应用热对流进行核酸序列扩增的方法和装置的制作方法

专利名称：应用热对流进行核酸序列扩增的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及扩增核酸序列的方法和装置。尤其涉及应用热对流的方法和装置，其中通过进行温度受控的包括聚合酶链式反应(PCR)及其相关过程在内的扩增过程，可以从含有DNA或RNA的遗传样品中扩增靶核酸序列。
背景技术：
以研发和诊断为目的，核酸序列扩增技术在生物科学，基因工程以及医学科学中具有广泛的应用。尤其是使用PCR(以下称为“PCR扩增技术”)的核酸序列扩增技术已经得到最广泛的应用。PCR扩增技术的详情公开于美国专利4,683,202；4,683,195和4,800,159和4,965,188号。
已经开发了多种包含自动PCR扩增方法的装置和方法，来用于快速有效地扩增多种遗传样品。这种技术的基本工作原理如下。
在商品化的PCR扩增技术中，制备样品包含待扩增的模板DNA、一对和模板DNA每条单链的特定序列互补的寡核苷酸引物、热稳定的DNA聚合酶以及脱氧核苷三磷酸(dNTP)。通过重复进行依次改变样品温度的温度循环，模板DNA特定部分核酸序列得到扩增。一般温度循环由三个或两个温度步骤组成，在温度循环内的扩增过程按照以下方式进行。
第一步是变性步骤，其中加热样品至一定高的温度，双链DNA被分开成单链DNA。第二步是退火步骤，其中冷却样品至一定低的温度，在第一步中形成的单链DNA和引物结合，形成部分双链DNA-引物复合体。最后一步是聚合步骤，其中维持样品在一个适当的温度，DNA-引物复合体中的引物在DNA聚合酶的作用下延伸，产生和模板DNA的每条链互补的新的单链DNA。经过由上述三个步骤组成的每个循环，由两条引物序列所选定的靶核酸序列得到复制。一般通过重复温度循环约20-40次，可以得到几百万或更高拷贝数的靶核酸序列。
变性步骤温度一般是90-94℃。退火步骤温度根据所用引物的融解温度(Tm)适当调节，一般在35-65℃。因为最常用的Taq DNA聚合酶(一种从水生栖热菌(Thermus aquaticus)中提取的热稳定DNA聚合酶)在72℃时具有最佳反应活性，一般设定聚合步骤温度为72℃并且使用三步骤温度循环。因为Taq DNA聚合酶在广泛的温度范围内均具有聚合酶活性，所以也可采用两步骤温度循环法，该法中聚合反应温度同退火温度设定为相同温度。
在最广泛应用的方法中，将含有样品的反应容器做成与具有高热传导性的固态金属块接触，该固态金属块通过和加热冷却装置结合来改变其温度，从而获得所需的样品温度循环。采用这种方法的商品常使用具有极高热传导性的镀金银块和/或Peltier制冷法，来获得快速温度改变。近来，已经发展了使用流体，比如气体或液体，来代替固态金属块作为热源的方法，得到快速温度改变，使用这种方法的产品正在商品化。在这类方法中，被加热到合适温度的流体以一种使流体热源和包含样品的反应容器间能获得有效热接触的方式环绕反应容器循环。获得快速温度循环的其他类型的方法也已得到开发。其它实例包括用多个具有各自特定温度的热源依次接触含有样品的反应容器或样品本身的方法，和直接用红外辐射加热样品的方法等。
现有核酸序列扩增装置具有许多缺陷，因为根据三步骤或两步骤温度循环该装置要完成改变整个样品的温度。
首先，由于改变样品温度的过程是必须的，现有温度循环型核酸序列扩增装置在设计上是复杂的。为了完成这样的温度改变过程，包含固体金属块或流体作为热源的方法要求迅速均一地控制和改变热源温度的装置，和控制温度改变时间间隔的装置。同样地，反应容器或样品要依次接触多个具有各自特定温度的热源的方法，需要快速准确移动反应容器或样品的装置以及控制移动时间和间隔的装置。
其次，由于现有核酸序列扩增装置设计复杂，将其整合为一个复合装置或微型设备是困难的。近来，在生物技术领域正在开发微型复合装置。例如，“芯片上的实验室(Lab-on-a-chip)”已经研制出来，将样本传送通道、阀门、压力测量器、反应容器、检测部件等通过光刻光(photolithography)整合成一个在玻璃、硅或者多聚物平板上的单一单位。这种微型复合装置预期将在多种研究和医学目的中有广泛的应用。当核酸序列扩增装置需要整合成这种微型芯片时，由于现有方法为了实现温度改变过程所需的复杂设计，使其在微型化上具有缺陷。此外，将现有装置整合为复合的装置是困难的，因为在复合的装置中快速的温度变化是不可取的。
第三，现有核酸序列扩增装置只能使用热稳定DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶。这是因为现有装置具有将整个样品加热到一定高温的过程。
最后，现有核酸序列扩增装置在减少PCR反应时间方面具有局限性。因为现有装置需要改变整个样品温度的过程，PCR反应时间必须需要比温度改变所需时间多的时间或至少一样多的时间。

发明内容
本发明意图解决上述困难。本发明的一个目的是提供一种基于热对流的新型核酸序列扩增方法和其装置。根据本发明的新方法和装置是这样扩增核酸序列在样品内形成多个具有不同温度的特定区域，从而不同区域的温度梯度导致样品发生自然热对流。
本发明的目的也是提供一种在设计上更简单的方法和其装置，不需要现有温度循环方法和装置中需要的复杂的成分，比如以一种可控方式改变温度的装置和控制温度改变的时间间隔的装置。
因此，本发明的另外一个目的是提供一种比现有技术更简单的核酸序列扩增方法和其装置，使其可以容易被微型化并且整合为复合的微型化装置，如芯片上的实验室。
本发明还有一个目的是提供一种基于热对流的核酸序列扩增方法和其装置，这种方法和装置不仅可以应用热稳定DNA聚合酶，而且可以应用非热稳定性DNA聚合酶。
本发明另外的目的是提供一种比现有技术更加有效的核酸序列扩增方法和其装置，无需现有技术必需的温度改变过程。
对于本领域技术人员来说，本发明其它目的和优势将在以下的详细描述、权利要求书附图中明确。
为实现上述目的，本发明提供了一种新型核酸序列扩增方法和其装置，基于下面描述的新颖的热对流型运行原理。
为实现上述目的，本发明提供了一种应用PCR的核酸序列扩增方法，该方法包括将样品注入反应容器的步骤，样品包含具有待扩增靶核酸序列的模板DNA、DNA聚合酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸，以及至少两条和核酸序列的每一个的3’末端互补的寡核苷酸引物；和在样品中维持特定的空间温度分布的步骤，多个热源与样品进行热接触，热源向样品特定区域提供热量或者移走热量，从而温度较高的区域在高度上低于温度较低的区域；其中特定空间温度分布包含这样的特定空间区域，每个特定空间区域各自执行一个温度条件，所述的温度条件适合于(i)变性步骤，其中双链DNA分离成单链DNA，(ii)退火步骤，其中变性步骤中形成的单链DNA与引物杂交形成DNA-引物复合物，或(iii)聚合步骤，其中通过聚合反应DNA-引物复合物中的引物得以延伸，并且其中特定空间温度分布是一种通过热对流导致样品循环的温度分布，由此变性、退火以及聚合步骤在样品内依次和重复发生。
为实现上述目的，本发明提供了一种应用PCR的核酸序列扩增装置，该装置包括多个热源，可给包含在反应容器中的样品的多个特定区域提供热量或移走热量，其中热源设计为可以维持样品的特定空间温度分布，从而较高温度区域在高度上低于较低温度区域，
其中特定空间温度分布包含各自执行一种温度条件的特定温度区域，该温度条件适合于(i)变性步骤，其中双链DNA分离成单链DNA，(ii)退火步骤，其中变性步骤中形成的单链DNA与引物杂交形成DNA-引物复合物，或(iii)聚合步骤，其中通过聚合反应DNA-引物复合物中引物得到延伸，并且其中特定空间温度分布是一种通过热对流引起样品循环的温度分布，由此变性、退火以及聚合步骤在样品内依次和重复发生。
在本发明中，包含样品的反应容器内部产生空间区域，在这些空间区域里变性、退火以及聚合步骤能够依次和重复发生。为了实现这个目的，多个热源结合在一起向样品特定区域供给和移走热量，并且温度较高区域在高度上低于温度较低区域。特定区域间温度梯度导致了自然热对流的产生，从而引起样品在不同温度区域的循环。因此，变性、退火以及聚合步骤依次和重复发生，导致核酸序列的扩增。
正如所述，本发明的核酸序列扩增装置基于热对流方法，它在设计上具有如下特点。首先，本发明的装置需要多个热源，维持反应容器里的样品内的多个特定温度区域的温度为所选温度。其次，温度较高的区域在高度上应该低于温度较低区域，以便通过热对流引起样品在特定温度区域间循环。更具体地说，在高温区域的样品比在低温区域的样品的密度低。因此，浮力产生并引起样品从位置较低的高温区域向位置较高的低温区域移动，同时重力引起样品向相反的方向移动。通过温度差一个自然的热对流因此产生，导致样品在特定温度区域间循环。最后，应该选择特定温度区域的温度，在样品内能够形成变性、退火以及聚合步骤可以在各自空间区域发生的特定空间区域，并且通过样品在热对流引导下以适当的速度在特定温度区域中循环，三个步骤可以依次和重复进行。
上述目的、特点和优势将在下面结合附图提供的详述中得到明确。在描述本发明时，当相关现有技术不必造成本发明的要点含混不清时，就不再对相关现有技术进行详细解释。
附图简述

图1显示的是基于热对流的核酸序列扩增方法的操作原理示意图。
图2a和2b显示的是样品中具有超过三个特定温度区域的实例示意图。
图3a和3b分别是根据本发明的核酸序列扩增装置的横截面图和透视图。
图4显示的是在反应容器中位于不同高度的样品的温度分布。
图5是电泳结果照片，说明实施例1在不同反应时间的结果。
图6是电泳结果照片，说明实施例2应用每对引物的结果。
图7是电泳结果照片，说明实施例3在不同反应时间的结果。
对附图中重要部分的数字的解释1，1’高温区域2，2’低温区域3，4，3’，4’热源5对流区域6反应容器101第一传导块102第二传导块103反应容器104加热装置105温度控制流体入口106温度控制流体出口107绝热体112，117通孔(through hole)111开口实施发明的最优方案下面，参考附图详细说明根据本发明的优选实施方案。
图1显示的是基于热对流的核酸序列扩增方法操作原理示意图。图1所示的实施方案例证这样的情况，一端封闭的直管被用作反应容器，形成两个特定温度区域1和2。然而，正如在图2描述的实施方案所示，可以使用改变形状的反应容器形成三个或三个以上特定温度区域。对于本领域技术人员，显而易见，基于本发明核酸序列扩增方法的热对流操作原理，可以设想出包括上述改变在内的多种改变。
在图1所示的一个实施方案中，反应容器与两个热源3和4热接触，热源直接或通过反应容器壁间接地向样品的特定区域1和2供给热量或者从中移走热量，从而在样品内形成一个空间温度分布。这样形成的温度分布使得PCR所需要的三个步骤，即变性、退火以及聚合步骤，能够发生。在具有不同温度的两个区域1和2中，较高温度区域1在高度上低于较低温度区域2。温度差在样品中产生密度差。作用在高温区域1的低密度样品上的浮力和作用在低温区域2的高密度样品上的重力产生了样品的热对流。因此样品在不同空间区域自然地循环，变性、退火以及聚合步骤在各自的空间区域能够发生。这种设计使得三个PCR步骤得以依次和重复发生，从而通过PCR方法获得DNA核酸序列的扩增。下面举例说明更详细的操作。
例如，位于样品底端的高温区域1可以保持温度在90-94℃，在这个温度下双链DNA可以分离成单链DNA。这样的设计使得变性步骤主要在区域1发生。低温区域2可以保持在退火温度35-65℃，所以位于底部高温区域的变性的DNA通过热对流移至位于上部的低温区域，从而单链DNA可以和互补于该单链DNA的引物退火形成DNA-引物复合物。在这种设计中，如果Taq DNA聚合酶用于聚合，由于Taq DNA聚合酶是已知在72℃具有最适活力并且在甚至到低温的广泛温度范围内均具有活性，聚合步骤，即DNA聚合酶同DNA-引物复合物结合且引物得以延伸的步骤，可以在低温区域2和对流区域5上部发生。因此，变性步骤首先在高温区域1发生并且变性的DNA通过热对流移至到低温区域2。在引物存在下，退火步骤因此发生在低温区域。在退火步骤中形成的DNA-引物复合物通过热对流经过低温区域2和对流区域5，在这个过程中，在DNA聚合酶的存在下，聚合步骤最终发生。因而，变性、退火以及聚合步骤能够依次和重复发生，样品DNA的靶序列得以有效扩增。
在图2所示的其他实施方案中，涉及了反应容器的三个特定区域与多个热源热接触。图2a是阐明一个实施方案的示意图，其中多个热源3、3’和4被排列形成两个高温区域1和1’以及一个低温区域2。图2b是阐明另外一个实施方案的示意图，其中多个热源3、4和4’被排列形成一个高温区域1和两个低温区域2和2’。在这里所用的多个热源可以设计为各自单独地用于一个温度区域或者同一热源可以用于一个以上温度区域。图2a阐明的实施方案中，如果两个高温区域1和1’设计为分别用于变性步骤和聚合步骤，则个区域应该和可以使该区域温度维持在适合各自步骤发生的温度的热源接触。在图2b阐明的实施方案中，如果两个低温区域2和2’都设计用于退火步骤，优选用一个热源代替两个热源4和4’。另外，图2b显示可以根据本发明构造具有单独的样品入口和出口的反应容器。
为了提高本发明的效率，控制热对流的速度是重要的，这样每个步骤的反应可以充分发生，同时整个反应时间可以减少。这可以通过如下方法获得(a)控制在特定温度区域间的温度梯度，(b)控制反应容器的直径，或者(c)改变反应容器的材料。当通过控制温度梯度去调节热对流速度时，改变特定温度区域间的温度差是最方便的。然而这具有局限性，因为每个特定温度区域在依赖于温度的PCR中具有各自的功能。因此，可以改变高温区域(1和1’)和低温区域(2和2’)之间的距离来获得相同的效果。例如，如果温度差保持不变，随着两个温度区域的距离变大则温度梯度变小，这样热对流速度降低。因为在反应容器壁和样品间的粘附力是抑制热对流的一个因素，热对流速度可以通过调节反应容器的直径来控制。当反应容器与样品接触的表面积和样品体积的比例变大，则粘附力增加而热对流速度下降。因此，通过调节反应容器直径从而控制反应容器与样品接触表面积可以控制热对流速度。样品和反应容器壁之间的粘附力还和反应容器材料有密切关系。因为PCR反应通常是在水溶液中进行，与像玻璃这类亲水物质相比，和水具有弱粘附力的疏水物质，如聚乙烯和聚丙烯，可产生更高的对流速度。因此，基于上述原理，通过设计适合PCR反应动力学的反应容器可以进一步提高本发明的效率。
图3显示的是根据本发明的一个实施方案的核酸序列扩增装置的横截面图(图3a)和透视图(图3b)。图3所示的装置含有多个热源作为维持温度的装置，包括加热部件；制冷部件；或者加热部件和制冷部件的结合体。优选的是在热源间加入绝缘装置来热隔离热源。在这个具体的实施方案中，装置中包含第一和第二热源，它们与样品特定区域热接触。第一热源由第一热传导块101和给第一热传导块供热的电加热部件104组成。第一热传导块与反应容器的底部热接触形成样品底部的高温区域。第二热源由第二热传导块102和循环水浴组成，循环水浴使得一定温度的水循环通过第二热传导块内部，维持第二热传导块的温度在适当的温度。第二热传导块102与反应容器的上部热接触，形成位于样品上端的低温区域。第二热传导块102包含入口105，来自循环水浴的水通过这里流入，出口106，水通过这个出口流出，以及流体循环通道(channel)，用来使水循环进入第二热传导块内部。尽管在图3中没有描述第二热传导块中的流体循环通道，本领域技术人员可以明白设计流体循环通道用来向第二热传导块102均一传送热量。热传导块101和102的材料选定为具有高的热传导性的铜，并且绝缘体107插入两个块之间来阻止直接的热传递。第一和第二热传导块101和102具有引入反应容器的接收器开口。接收器开口由在第一传导块101内一端封闭的开口111，和在第二传导块中的通孔112，和另外一个在绝缘体上的通孔117组成。
在其后描述的实施例1、2和3中，样品底部的高温区域通过控制电加热部件104维持在94℃，而在样品上部的低温区域通过控制循环水浴的水温维持在45℃。
本发明不局限于图3所描述的核酸序列扩增装置。下面的改变是可能的。
首先，热传导块101和102的结构可以改变。例如，第一热传导块101可以和反应容器底部热接触而第二热传导块102可以和反应容器上部热接触，而反应容器中部可以和空气接触或者与第三热传导块接触。另外，图3描述的实施方案中热是通过反应容器壁从传导块传递到样品的特定区域，与其不同的是，热传导块可以直接和样品接触。
其次，热传导块材料可以改变。在图3描述的实施方案中，使用的是由铜制成的热传导块101和102，但是材料并不局限于铜。几乎任何可以向反应容器传递热的材料都可以使用。例如，其他热传导固体或流体，比如液体和气体，都可以代替以上所用的热传导块使用。例如，红外辐射或者其他装置可以部分或全部替代热传导块101和102。
第三，保持第一和第二热传导块温度的装置不局限于循环水浴或者电加热部件。几乎任何可以向样品供给热量或者从样品移走热量的部件都可以使用。
第四，几乎任何手段，比如固体，液体或者气体，都可以用来代替图3描述的绝缘体107，只要它适合于在导热物质之间隔绝热传递。也可能使用不包括绝缘体的组合物(composition)。
最后，当改变的反应容器(如图2a或2b所示的反应容器)被用来代替图1描述的反应容器以促进热对流时，可以使用多个热源，包括热传导块和它们的改进形式，这种适当改进是基于本发明的原理的。
上述第一、第二和第三例子是热源一部分尤其是热传导块被改进的实例。正如这里所使用的，热源是指可以用来维持样品温度在一个特定值的任何装置。因此，除了上述热源的改变实例，本发明中任何装置可以用来作为热源，只要它可以维持样品特定区域在一个所选温度。本发明几乎包括任何具有维持样品特定区域在所选温度功能的装置。这是因为本发明的特征不在于热源的特殊设计，而是通过热源的特殊排列意图在样品中产生特定温度分布，使得PCR过程可以依次和重复发生。
上述改进的实例的更详细的设计可以取决于工业技术的发展而不同。因此，这里不作详细解释。
图4显示从反应容器底部开始不同高度测定的温度分布，来表明基于热对流的PCR方法的原理。热对流是由温度差产生的密度差引起的流体运动现象。这种类型的对流称作自然对流，区别于由泵或者推进器推动流体运动的被迫对流。本发明使用的术语“对流”总是指自然对流。对于在反应容器中发生的自然对流，反应容器中样品底部在温度上应该高于上部。
图4可见，当和反应容器底部接触的第一热传导块101维持在96℃，并且和反应容器上部接触的第二热传导块维持在45℃，就形成了高温区域(图4中温度高于或者等于90℃的区域)、低温区域(温度接近50℃的区域)、以及对流区(具有温度梯度的区域)。样品在高温区域进行变性步骤。然后变性的样品穿过对流区移至低温区，在那里进行退火步骤。当样品停留在低温区域和从低温区域穿过对流区移回时，样品进行聚合步骤。热对流引起样品在三个区域依次并重复循环，从而导致通过PCR扩增核酸序列。
图7显示了应用固定在固体表面的DNA聚合酶得到的结果。这里使用的术语“固定化DNA聚合酶”意思是指固定在固体支持物上并保持聚合酶活性的DNA聚合酶。可以使用多种方法制备固定化DNA聚合酶，但是该方法应该提供一种具有足够高聚合酶活性的固定化DNA聚合酶，使得可以检测到通过模板DNA的PCR扩增的核酸序列。本发明实施例中使用的固定化DNA聚合酶通过使用这样的方法制备保持了高聚合酶活性，其中DNA聚合酶的活性位点被DNA底物掩蔽并且通过共价键固定在Au表面。实施例中描述了固定化方法的详细步骤。通过这种方法制备的固定化酶的聚合酶活性足够(大约是液相DNA聚合酶活性的60-80％)进行PCR反应。然而，可以用于本发明的固定化DNA聚合酶并不局限于应用本发明实施例中使用的方法来制备的，而是包括那些用其他方法制备的。
根据本发明的热对流类型的核酸序列扩增方法中，除了可以使用热稳定性聚合酶，如Taq DNA聚合酶，也可以使用非热稳定性DNA聚合酶，如Klenow片段和T7 DNA聚合酶。这是因为如下事实。由于本发明的性质决定，整个样品的温度并不重复地从高温到低温变化或者反之，而是样品的特定区域保持在一个恒定温度。例如，样品上部可以保持在低温，而样品的底部可以保持在高温。通过使固定化的DNA聚合酶位于低温区或者位于低温区附近的对流区的上部，使用非热稳定性DNA聚合酶是可能的，下面描述的实施例1、2和3证实应用本发明的核酸序列扩增装置可以达到本发明的目的。
实施例11.方法1.1.反应容器一端封闭的玻璃管用作反应容器。玻璃管长度为55-60mm，内径为2mm，外径为8mm，并且底部封闭端厚度为3mm。玻璃管内壁用喷雾类涂层材料聚四氟乙烯涂层并热硬化。
1.2.样品pBluescript II KS(+)用作DNA模板。PCR中使用的样品于含有50mMKCl的100μl 10mM Tris缓冲液(pH8.3)中含有40ng模板DNA、各40pmol的T3引物(5’-ATTAACCCTCACTAAAG-3’)(SEQ ID NO1)和T7引物(5’-AATACGACTCACTATAG-3’)(SEQ ID NO2)、4nmol dNTP，1pmol(5U)Taq DNA聚合酶以及250nmol MgCl2。
1.3.反应温度和反应时间首先，用电加热部件对第一热传导块101加热并保持在96℃，并且用循环水浴使第二热传导块102维持在45℃。上述制备的样品注入反应容器，反应容器然后插入至接收器111、117和112。使样品反应适当的时间。在反应期间，反应容器通过加入氮气加压至约1.2atm来防止样品溶液沸腾。
1.4.样品中温度分布的测定上述反应条件下对样品的每个区域的温度进行测定。从反应器底部开始，热电耦温度计的尖端(tip)每隔2.5mm放置，经过足够的时间，温度被测定和记录下来。图4显示反应容器内样品温度分布的实例。
2.结果首先，在上述反应条件下反应容器内样品每个区域测定的温度证明(参见图4)形成了用于变性的高于90℃的高温区、用于退火的50℃左右的低温区以及具有温度梯度引导热对流的对流区。
在上述反应条件下样品经过限定时间温育后，取出反应容器并冷却。反应产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳分析。图5是一张电泳结果照片，反应时间达4小时，每30分钟一个时间间隔。反应产物是一段164bp的双链DNA。由图5可见，PCR反应在90分钟前达到饱和。
实施例21.方法除了T3/T7引物对，也在本试验中考察KS/U、KS/Pvu II以及KS/Nae I引物对。反应时间设定为150分钟，其他反应条件和实施例1中相同。T3和T7引物序列在实施例1中已经阐述，其他引物序列提供如下KS引物5’-CGAGGTCGACGGTATCG-3’(SEQ ID NO3)U引物5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’(SEQ ID NO4)Pvu II引物5’-TGGCGAAAGGGGGATGT-3’(SEQ ID NO5)Nae I引物5’-GGCGAACGTGGCGAGAA-3’(SEQ ID NO6)2.结果如在实施例1，用电泳分析反应产物。图6是实施例2的电泳结果照片，泳道1、2、3和4分别是使用T3/T7、KS/U、KS/Pvu II以及KS/Nae I引物对得到的结果。可见四个引物对分别产生了164bp、144bp、213bp和413bp的正确大小的双链DNA。
实施例31.方法不是向样品加入Taq DNA聚合酶，而是将Taq DNA聚合酶固定在Au丝表面并且定位在低温区域。其他实验条件和实施例1中相同。
用来固定DNA聚合酶的方法描述如下。
下面所示的含有65个碱基的单链DNA和KS引物在磷酸缓冲液(pH8.3)中以1∶1摩尔比混合。产生的溶液在94℃温育10分钟然后缓慢冷却至35℃以下。在这个过程中，含有65个碱基的单链DNA和KS引物退火形成部分双链DNA。然后向该溶液加入适当摩尔数的购自Perkin Elmer(美国)的Taq DNA聚合酶(AmpliTaq Gold)，产生的混合物在72℃的干浴(dry bath)中温育10分钟。然后，将混合物移至一个50℃的干浴温育20分钟，来完成位点掩蔽的DNA聚合酶的制备，其中部分双链DNA同DNA聚合酶的活性位点结合。
KS引物5’-CGAGGTCGACGGTATCG-3’(SEQ ID NO1)65-mer3’-CCAGCTGCCATAGCTATTTTCTTTTCTTTCTTAAGTTCTTTTCTTTTCCTAGGTGATCAAGATCT-5’(SEQ ID NO7)为了得到最大量的0.26pmol的固定化DNA聚合酶，Au丝制备成外径为0.1mm和长度为4.7cm，使用前将其处理为线圈形状，外径是1.5mm和长度大约为4mm。为了保证Au丝表面的清洁，用Piranha溶液在60-70℃洗涤10-15分钟，并且使用前依次用去离子水和无水乙醇漂洗。
为了在Au表面引入用来固定化的反应基团，通过Au-S键形成反应在Au表面形成单层硫醇分子，即通过在具有硫醇基团的连接分子和Au之间的羟硫基金属(thiolate)形成反应来制备支持物质。在这个反应中，应用含有两类硫醇分子的混合溶液，分别是固定化反应基团和非反应基团的分子。具有固定化反应基团的硫醇分子占整个两种硫醇分子的摩尔百分比选定为5％。为了引入羧基固定化反应基团，具有较长烷基链的12-巯基十二烷酸用来作为连接分子。6-巯基-1-己醇或者1-庚硫醇是具有非反应基团的硫醇分子，用来作为基质分子。羧基固定化反应基团是通过这样的方法引入到Au丝的表面的，将Au丝置于100μl 2mM的溶于乙醇的硫醇混合溶液中室温2小时并用无水乙醇洗涤。
引入羧基固定化基团的Au丝置于120μl含有10mM 1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺(EDC)和5mM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的乙醇溶液中，室温下放置2小时。在EDC的存在下，羧基基团通过和NHS反应而活化，形成NHS-酯。
硫醇单层的羧基基团活化后，Au丝移至含有活性位点被掩蔽的DNA聚合酶的酶溶液中。在这个步骤，硫醇单层的活化的羧基(NHS-酯)和蛋白质的一级胺反应，形成酰胺键(-CO-NH-)。从而，Taq DNA聚合酶固定在支持材料上。
2.结果正如在实施例1中，反应产物用电泳分析。图7是电泳结果照片，全部反应时间达4个小时，每30分钟为一个时间间隔。正如图7可见，PCR反应在150分钟前达到饱和。
从实施例1、2和3中的结果可见如下的要点。
首先，根据本发明的基于热对流的核酸序列扩增装置可以有效工作。
其次，已经证实，通过将固定在固相表面的DNA聚合酶定位在低温区或者在对流区上部，应用根据本发明基于热对流的核酸序列扩增装置能够进行PCR反应。从而证实高温不稳定的DNA聚合酶也能够使用。
对于本领域技术人员，显而易见上述本发明并不局限于上述实施例和附图，并且只要不摒弃本发明的技术思想，多种替代，变化和改进都是可能的。因此，上述实施例和改进只是用来举例说明，不应该认为是限制本发明的意思。本发明真正的范围应该由下面的权利要求书决定，不受说明书任何方式的限制。
如上所述，本发明中样品的多个特定区域保持在特定温度，特定区域间的热对流使得样品在反应容器内部循环。从而，变性、退火以及聚合步骤可以依次和重复进行。因此，可注意到如下效果。
首先，核酸序列扩增装置可以设计成简单组成。本发明不需要改变样品温度的过程。因此根据本发明的设计可以更简单，因为现有装置中用来改变和控制样品温度的复杂装置是不需要的。
第二，根据本发明的装置易于微型化或者整合为复合装置，如芯片上的实验室，来完成PCR核酸序列扩增过程。它也可以整合入不希望有温度变化的装置中。
第三，非热稳定性DNA聚合酶也可以使用。这是因为本发明可以使用固定化的DNA聚合酶，通过将其定位在反应容器的特定区域，该区域维持在适合聚合酶活性的温度。根据本发明，应用固定化DNA聚合酶时，固定化聚合酶在能够维持其聚合酶活性的温度区域，PCR反应可以进行。因此，根据本发明，在低温时具有最适活性的酶，如Klenow片段或者T7 DNA聚合酶，也可以用于PCR反应。
最后，PCR反应时间可以减少。本发明中，无需改变整个样品的温度。因此可以节省用来改变和控制整个样品温度的时间。
序列表<110>AHRAM BIOSYSTEMS INC.
HWANG，HYUN JINKIM，JEONG HEEJEONG，KYUNGHOON<120>应用热对流进行核酸序列扩增的方法和装置<130>apa21_kr_pct<150>KR-10-2001-0057040<151>2001-09-15<150>KR-10-2001-0066943<151>2001-10-30<160>7<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>1attaaccctc actaaag 17<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成序列
<400>2aatacgactc actatag 17<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>3cgaggtcgac ggtatcg 17<210>4<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>4gtaaaacgac ggccagt 17<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成序列
<400>5tggcgaaagg gggatgt 17<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>6ggcgaacgtg gcgagaa 17<210>7<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>7tctagaacta gtggatcctt ttcttttctt gaattctttc ttttctttta tcgataccgt 60cgacc 6权利要求
1.一种应用聚合酶链式反应(PCR)的核酸序列扩增方法，该方法包括将样品注入反应容器的步骤，该样品包含具有待扩增的靶核酸序列的模板DNA、DNA聚合酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸，以及至少两条和每个靶核酸序列3’末端互补的寡核苷酸引物；和通过多个热源与样品进行热接触在样品中维持特定的空间温度分布的步骤，该热源向样品特定区域提供热量或者从特定区域移走热量，使得温度较高的区域在高度上低于温度较低的区域，其中特定空间温度分布包含这样的特定空间区域，每个特定空间区域各自执行一个温度条件，所述的温度条件适合于(i)变性步骤，其中双链DNA被分离成单链DNA，(ii)退火步骤，其中变性步骤中形成的单链DNA与引物杂交形成的DNA-引物复合物，或(iii)聚合步骤，其中通过聚合反应使DNA-引物复合物中的引物得以延伸，并且其中的特定空间温度分布是通过热对流引导样品循环的温度分布，由此变性、退火以及聚合步骤在样品内依次和重复发生。
2.权利要求1的核酸序列扩增方法，其中至少一个所述的热源包含与反应容器或者样品热接触的热传导固体；和向该热传导固体提供热量的加热部件，从该热传导固体移走热量的冷却部件，或者加热部件和冷却部件的组合体。
3.权利要求1的核酸序列扩增方法，其中至少一个所述的热源包含与反应容器特定区域热接触的液体；用来容纳液体的接受器；向该液体提供热量的加热部件，从该液体移走热量的冷却部件，或者加热部件和冷却部件的组合体。
4.权利要求3的核酸序列扩增方法，其中至少一个热源进一步包含使液体围绕反应容器循环的循环部件。
5.权利要求1的核酸序列扩增方法，其中至少一个热源包含与反应容器特定区域热接触的气体；向该气体提供热量的加热部件，从该气体移走热量的冷却部件，或者加热部件和冷却部件的组合；和使该气体围绕反应容器循环的循环部件。
6.权利要求1的核酸序列扩增方法，其中至少一个热源是直接向样品提供热量的红外辐射发生部件。
7.权利要求1的核酸序列扩增方法，其使用一种在热源间隔离热传导的装置。
8.一种应用PCR的核酸序列扩增装置，该装置包括多个热源，可给包含在反应容器中的样品的多个特定区域提供热量或从中移走热量，其中热源安排为可以维持样品的特定空间温度分布，从而较高温度区域在高度上低于较低温度区域，其中特定空间温度分布包含各自执行一种温度条件的特定空间区域，该温度条件适合于(i)变性步骤，其中双链DNA分离成单链DNA，(ii)退火步骤，即变性步骤中形成的单链DNA与引物杂交形成DNA-引物复合物，或(iii)聚合步骤，其中通过聚合反应DNA-引物复合物中引物得到延伸，并且其中特定空间温度分布是一种通过热对流导致样品循环的温度分布，由此变性、退火以及聚合步骤在样品内依次和重复发生。
9.权利要求8的核酸序列扩增装置，其中至少一个热源包含与反应容器或者样品热接触的热传导固体；和一个给热传导固体提供热量的加热部件，从热传导固体移走热量的冷却部件，或者加热部件和冷却部件的结合体。
10.权利要求8的核酸序列扩增装置，其中至少一个热源包含与反应容器特定区域热接触的液体；用来包含液体的接受器；给液体提供热量的加热部件，从液体移走热量的冷却部件，或者加热部件和冷却部件的结合体。
11.权利要求10的核酸序列扩增装置，其中至少一个热源进一步包含使液体围绕反应容器循环的循环部件。
12.权利要求8的核酸序列扩增装置，其中至少一个热源包含与反应容器特定区域热接触的气体；给气体提供热量的加热部件，从气体移走热量的冷却部件，或者加热部件和冷却部件的结合；和使气体围绕反应容器循环的循环部件。
13.权利要求8的核酸序列扩增装置，其中至少一个热源是直接向样品提供热量的红外辐射发生部件。
14.权利要求8的核酸序列扩增装置，其使用在热源间隔离热传导的装置。
全文摘要
本发明提供一种核酸序列扩增方法和其装置，其设计简单，易于微型化和一体化为复合装置，能够使用非热稳定性DNA聚合酶。本发明中，多个热源结合在一起向样品的特定区域提供或者移走热量，通过将较高温度区域定位在高度上低于较低温度区域，从而在样品内部维持一个特定空间温度分布。
文档编号C12M1/00GK1571849SQ02820409
公开日2005年1月26日 申请日期2002年9月14日 优先权日2001年9月15日
发明者黄贤镇, 金廷姬, 郑敬勋 申请人:阿赫姆生物系统公司