一种简单快速接种中国小麦花叶病毒的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重要作物病毒的人工接种方法及其应用，尤其是一种简单快速接 种中国小麦花叶病毒的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus，CWMV)是我国上世纪末在山东 发现的一种土传病毒，现已划入帚状病毒科（family Virgaviridae)菌传杆状病毒属 (genus Furovirus) <XWMV在小麦病株上引起典型的症状包括:幼叶呈现褪绿条纹，老叶则 黄化甚至变成紫色。严重的病株矮缩、萎蔫甚至死亡，从而导致产量损失严重。分子鉴定显 示棒状的CWMV粒子内部含有2条单链正义RNA( ssRNA)基因组片段，分别称为RNA1和RNA2。基 因组测序分析表明RNA1长7147nt，编码3个病毒运动和复制所必需的蛋白；而RNA2则较短， 仅3564nt，编码4个蛋白，其中3个与病毒外壳蛋白有关，另一个则是富含半胱氨酸的RNA沉 默抑制子。在自然条件下，中国小麦花叶病毒，由土壤专性寄生的禾谷多黏菌（Polymyxa graminis)传播，该类病毒在真菌介体的休眠孢子中存活数载，这给该类病害的防控带来了 严重困难。由于其介体禾谷多黏菌高度专性寄生，十分难以人工体外培养;在自然条件下， 禾谷多黏菌种群复杂多样，加之土壤中微生物群落复杂多样，也难以获得高效传播CWMV的 禾谷多黏菌纯系，因此，CWMV自然条件下的介体传播接种模式至今仍然无法在实验室条件 下进行，这给CWMV及相关病毒的深入研究和生物学特性分析带来了困扰;另一方面，CWMV虽 然能够摩擦接种，但其效率有限，也难以在抗病筛选和CWMV深入研究中发挥作用。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种简单快速高效的接种中国小麦花叶 病毒的方法及其应用。
[0004] 本发明解决其技术问题采用的技术方案:一种快速高效的接种中国小麦花叶病毒 的方法，包括以下步骤：
[0005] 1)引物设计:通过本实验室测定的中国小麦花叶病毒基因组片段RNA1和RNA2序列 共设计4条引物，引物序列见表1，其中引物对Rlf/Rlr用于扩增RNA1，引物对R2f/R2r用于扩 增RNA2;
[0006] 2)病毒基因组扩增反应：以病毒基因组cDNA作模板，采用高保真的Phusior#DNA聚 合酶(NEB)进行扩增，其中引物对Rif/Rlr扩增的RNA1产物长约7.2-kb，引物对R2f/R2r扩增 的RNA2产物长约3.6-kb;
[0007] 3)病毒基因组克隆：病毒全长基因组RNA1、RNA2扩增产物经切胶纯化后，采用In-Fusion克隆试剂盒(Clontech)参照商家说明书分别连接至线性化的双元载体质粒上，测序 验证获得分别含RNA1和RNA2全长cDNA片段的重组双元载体质粒，然后利用电转化仪将含 RNA1和RNA2全长cDNA片段的重组质粒分别导入农杆菌；
[0008] 4)人工接种:将含有CWMV基因组的农杆菌等量混合，然后通过注射器将农杆菌混 合液浸润入植物体内，2周后进行病毒分子检测并观测植株表型变化；
[0009] -种快速高效的接种中国小麦花叶病毒的方法的应用，包括以下步骤：
[0010] 病毒温敏性分析:经人工接种CWMV的植株，分别置于12、15、17、20、25°C条件下继 续培养，二周后进行病毒分子检测并分析病毒在不同温度下的复制等特性。
[0011]表1本发明所设计的引物
[0012] '[0013]发明的有益效果是:本发明针对当前中国小麦花叶病毒研究技术的难点，发展建 立了一种简单快速高效的人工接种CWMV的方法，并成功地应用于CWMV的温敏特性分析，本 方法可广泛应用于病毒生物学特性、病毒基因功能及植物抗病性等分析。
【附图说明】
[0014] 图1:不同温度条件下病毒RNA在接种叶片和系统叶片中的积累。其中，RNA1和RNA2 分别表示CWMV的第一、二条基因组片段;sgRNA表示亚基因组RNA; rRNA表示核糖体RNA;
【具体实施方式】
[0015] 下面结合附图对本发明作进一步说明：
[0016] 实施例1 一种高效的人工接种CWMV的方法及其温敏性分析。
[0017] 引物设计:通过本实验室测定的中国小麦花叶病毒基因组片段RNA1和RNA2序列共 设计4条引物，引物序列见表1，其中引物对Rif/Rlr用于扩增RNA1，引物对R2f/R2r用于扩增 RNA2〇
[0018] 病毒基因组扩增反应：以病毒基因组cDNA作模板，采用高保真的PhusioWDNA聚合 酶(NEB)进行扩增，其中引物对Rif/Rlr扩增的RNA1产物长约7.2-kb，引物对R2f/R2r扩增的 RNA2产物长约3.6-kb;
[0019] 病毒基因组克隆：病毒全长基因组RNA1、RNA2扩增产物经切胶纯化后，采用In-Fusion克隆试剂盒(Clontech)参照商家说明书分别连接至线性化的双元载体质粒，测序验 证获得分别含RNA1和RNA2全长cDNA片段的重组双元载体质粒，然后利用电转化仪将含RNA1 和RNA2全长cDNA片段的重组质粒分别导入农杆菌；
[0020] 人工接种：将含有CWMV基因组的农杆菌等量混合，然后通过注射器将农杆菌混合 液浸润入植物体内，2周后进行病毒分子检测并观测植株表型变化。
[0021] 病毒温敏性分析:经人工接种CWMV的植株，分别置于12、15、17、20、25°C条件下继 续培养，2周后进行病毒分子检测并分析病毒在不同温度下的复制等特性。
[0022]结果分析：利用本发明的方法接种植物，接种效率可达到100%，而且所有接种 CWMV的植株都产生典型的花叶症状，分子检测显示通过本方法接种的CWMV在植物体内能够 正常滴进行蛋白表达、基因组复制和转录、病毒粒子装配;本实验室前期调查显示CWMV在自 然条件下的发病严重程度与温度有密切相关，为了分析CWMV的这一特点，我们特别利用本 发明的方法接种CWMV后，然后在不同温度条件下培养，2周后进行分子检测，结果见图1，在 接种叶片中CWMV RNA在12°C条件下积累量最大，其次为15°C条件，而在25°C条件下病毒RNA 积累量则少得多，表明较低温有利于CWMV在接种叶片的复制与转录及积累，而较高温度下 则不利于CWMV RNA在接种叶片中的积累;在植株上部未接种叶片中，病毒RNA积累量在17°C 条件下最多，其次为15°C条件，而在较低温度（12°C)和较高温度(20和25°C)条件下则没有 检测到病毒RNA的积累信号，表明在15-17°C温度最有利于CWMV的系统侵染，而较低和较高 的温度均不利于CWMV的系统侵染。综合起来看，低温有利于CWMV的复制与转录，但温度在 15-17°C时更适合CWMV的系统侵染。因此，本发明针对当前中国小麦花叶病毒研究技术的难 点，不仅提供了一种简单快速高效的人工接种CWMV的方法，还成功地应用于CWMV的温敏特 性分析，为深入研究CWMV的温敏性机制奠定了基础。同时本发明也可广泛应用于病毒生物 学特性、病毒基因功能及植物抗病性等分析。
[0023]除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形 成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
【主权项】
1. 一种简单快速接种中国小麦花叶病毒的方法，包括以下步骤： 1) 引物设计:通过本实验室测定的中国小麦花叶病毒基因组片段RNA1和RNA2序列共设 计4条引物，其中引物对Rif/Rlr用于扩增RNA1，引物对R2f/R2r用于扩增RNA2; 2) 病毒基因组扩增反应：以病毒基因组cDNA作模板，采用高保真的PhusionDNA聚合酶 进行扩增，其中引物对Rlf/Rlr扩增的RNA1产物长约7.2-kb，引物对R2f/R2r扩增的RNA2产 物长约3.6-kb; 3) 病毒基因组克隆：病毒全长基因组RNA1、RNA2扩增产物经切胶纯化后，采用In-Fusion克隆试剂盒参照商家说 明书分别连接至线性化的双元载体质粒上 ，测序验证获得分 别含RNA1和RNA2全长cDNA片段的重组双元载体质粒，然后利用电转化仪将含RNA1和RNA2全 长cDNA片段的重组质粒分别导入农杆菌； 4) 人工接种:将含有中国小麦花叶病毒基因组的农杆菌等量混合，然后通过注射器将 农杆菌混合液浸润入植物体内，2周后进行病毒分子检测并观测植株表型变化。2. 根据权利要求1所述的简单快速接种中国小麦花叶病毒的方法的应用，包括以下步 骤:经人工接种中国小麦花叶病毒的植株，分别置于12、15、17、20、25°C条件下继续培养，二 周后进行病毒分子检测并分析病毒在不同温度下的复制等特性。
【专利摘要】本发明涉及一种简单快速接种中国小麦花叶病毒的方法，应用一套4条病毒基因组特异性引物(基因序列如序列表所示)以病毒基因组cDNA为模板进行扩增，扩增产物经纯化后连接至线性化双元载体，将重组的双元载体导入农杆菌并接种植物并用于CWMV的温度敏感性分析，结果分析显示本接种方法不仅能够获得CWMV侵染的植物病株，而且十分高效，表明本方法适用于中国小麦花叶病毒的接种，可用于相关病毒生物学特性、病毒基因功能及植物抗病性等分析。
【IPC分类】C12N15/84
【公开号】CN105441480
【申请号】CN201610005687
【发明人】张恒木, 羊健, 张芬, 李静, 陈剑平
【申请人】浙江省农业科学院
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2016年1月4日