一种受ABA调控的miRNA在提高植物抗旱性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种受ΑΒΑ调控的miRNA在提高植物抗旱性中的应用，属于生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] MiRNA在植物生长发育及逆境响应过程中都起到了非常重要的作用（Kulcheski et al·，2011 ;Li et al·，2008 ;Sunkar et al·，2007)。脱落酸（Abscisic acid, ΑΒΑ) 是植物中最重要的激素之一，也在植物生长发育及抗逆中起到作用（Sreenivasulu et al.，2012 ;Wilkinson and Hartung, 2009)。研究受ΑΒΑ调控的miRNA的种类及功能对研究 ΑΒΑ调节植物生长发育及抵抗逆境胁迫具体机制是有重大意义的。截止到目前，水稻中受 ΑΒΑ调控的miRNA并没有被很好的研究。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种受ΑΒΑ调控的miRNA在提高植物抗旱性中的应用。
[0004] 本发明提供一种提高植物抗旱性的方法,是提高植物中SEQ ID No. 1所示的RNA 分子的水平或降低SEQ ID No. 15所示的RNA分子的水平。
[0005] 上述方法中，所述提高植物中SEQ ID No. 1所示的RNA分子的水平或降低SEQ ID No. 15所示的RNA分子的水平的方法是将SEQ ID No. 18所示的DNA分子导入出发植物中实 现的，与出发植物相比，转基因植物的抗旱性增强。
[0006] 上述任一所述的方法中，所述SEQ ID No. 18所示的DNA分子是通过重组表达载体 导入的。
[0007] 上述任一所述的方法中，所述重组表达载体是将所述SEQ ID No. 18所示的DNA分 子插入出发载体PCAMBIA2300-35S的BamHI和Xbal多克隆位点间得到的；
[0008] 所述SEQ ID No. 18所示的序列中自5'末端起第327位至第347位的DNA分子为 miR162b相应序列。
[0009] 上述任一所述的方法中，所述植物为水稻。
[0010] SEQ ID No. 1所示的RNA分子在识别和/或切割和/或降解SEQ ID No. 11所示的 DNA分子的转录产物中的应用也属于本发明的保护范围。
[0011] 上述应用中，所述转录产物为SEQ ID No. 15所示的RNA分子。
[0012] 上述任一所述的应用中，所述SEQ ID No. 1所示的RNA分子的识别位点为SEQ ID No. 15所示的RNA分子中自5'末端起第518至第542位，切割的位点在SEQ ID No. 15所示 的RNA分子中自5'末端起第529至第530位之间，在切割之后，SEQ ID No. 15所示的RNA 分子被降解。
[0013] 所述SEQ ID No. 1所示的RNA分子及SEQ ID No. 15所示的RNA分子的水平是受 ΑΒΑ调控的，施加 ΑΒΑ后ΑΒΑ合成途径关键酶基因 OsZEP发生突变的水稻Osabal-1的SEQ ID No. 1所示的RNA分子及SEQ ID No. 15所示的RNA分子水平均恢复到野生型水稻的水 平，即与施加 ΑΒΑ后的野生型水稻的SEQ ID No. 1所示的RNA分子及SEQ ID No. 15所示的 RNA分子水平基本一致。
[0014] SEQ ID No. 1所示的RNA分子或SEQ ID No. 18所示的DNA分子在提高植物抗旱性 中的应用也属于本发明的保护范围。
[0015] 上述应用中，所述植物为水稻。
[0016] 本发明证明受ΑΒΑ调控的miRNA162b通过负调控OsTREl的表达量提高了水稻的 抗旱能力。本发明对研究水稻抗胁迫机制十分重要，也为提高水稻抗胁迫能力进而实现高 产提供了思路。
【附图说明】
[0017] 图1为miR162b在WT和Osabal-Ι中的表达水平。
[0018] 图2为miR162b靶基因 OsTREl的实时定量PCR验证。
[0019] 图3为电泳检测inner PCR产物。
[0020] 图4为miR162b对靶基因 OsTREl的切割位点。
[0021] 图5为外源ΑΒΑ处理之后，各组幼苗的miR162b及OsTREl表达水平检测。
[0022] 图6为转基因水稻的miR162b及OsTREl表达水平检测。
[0023] 图7为转基因水稻的抗旱性检测。
【具体实施方式】
[0024] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0025] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026] 野生型水稻日本晴（Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare)在文献"13;[1111，1^ T.，and Οοηο,Κ. (1992). MOLECULAR-CLONING AND CHARACTERIZATION OF GENES RELATED TO CHILLING TOLERANCE IN RICE. Plant Physiol. 99:1146-1150. " 中公开过，公众可从中 国科学院微生物研究所获得。
[0027] Osabal-1 水稻在文献 "Chengzhen Liang, Yiqin Wang, Yana Zhu et. al (2014) · OsNAP connects abscisic acid and leaf senescence by fine-tuning abscisic acid biosynthesis and directly targeting senescence-associated genes in rice. PNAS. 1321568111"中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得，该水稻的ABA合成 途径关键酶基因 OsZEP发生突变。
[0028] SYBR?'Premix Ex Taq? II (Perfect Real Time)购自宝生物工程（大连）有限 公司，产品目录号为DRR081A。
[0029] FirstChoice? RLM-RACE 试剂盒购自 Life Technology,产品目录号为 AM1700。
[0030] PEASY-T5 Zero克隆载体购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为 H41205。
[0031] pCAMBIA2300-35S 和 pCAMBIA2300-Ubiquitin 在文献"Chengzhen Liang, Yiqin Wang, Yana Zhu et.al (2014). OsNAP connects abscisic acid and leaf senescence by fine-tuning abscisic acid biosynthesis and directly targeting senescence-associated genes in rice. PNAS. 1321568111" 中公开过，公众可从中国科学 院微生物研究所获得。
[0032] 实施例 1、miRNA-seq 和 DNA-microarray 数据分析
[0033] 一、对野生型水稻日本晴（以下实施例中均简称为WT)和ΑΒΑ合成途径关键酶基 因 OsZEP发生突变的突变体Osabal-Ι的第5、6片叶取样并提取总RNA进行miRNA-seq及 gene chips分析。经过标准化后将miRNA读数转化为表达量，得到了在WT和Osabal-Ι中 差异表达的miRNA，miR162b。
[0034] miR162b 的序列为：5, -UCGAUAAGCCUCUGCAUCCAG-3'（SEQ ID No. 1)。
[0035] miR162b在WT和Osabal-1中的表达量如图1所示。
[0036] 图1表明，与在WT中的表达量相比，miRNA162b在Osabal-Ι中的表达显著下调。
[0037] 二、miRNA靶基因预测及表达水平验证
[0038] 对于步骤一得到的差异表达的miR162b，用颈环RT-PCR (stem-loop RT-PCR)的方 法进行验证。
[0039](一）颈环引物介导的反转录
[0040] 转录体系（10 μ L):步骤一获得的 WT 或 Osabal-Ι 的总 RNA 500ng，stem-loop RT 引物 200nM，dNTP ImM，余量为 ddH20。
[0041] miR162b 的 stem-loop RT 引物：
[0042] 5,-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacCTGGAT-3，（SEQ ID No. 2)
[0043] 将上述体系用PCR仪保温65 °C 10min，置于冰上2min，再向反应液中添加 200U的M-MLV反转录酶（购自宝生物工程（大连）有限公司，产品目录号为D2639A)， 4yL 5Xbuffer(M_MLV 反转录酶试剂盒自带），10U RNA 酶抑制剂（Recombinant RNase Inhibitor，购自宝生物工程（大连）有限公司，产品目录号为2313A)及RNase-free水至 总体系20μ L。再将此体系在室温（25°C )放置15min，42°C lh，70°C 15min再放到冰上冷 却，即得到cDNA。
[0044] 以U6作为内参进行上述反应（仅stem-loop RT引物不同），得到内参cDNA，其中 U6 的 stem-loop RT 引物如下：5' -ATTTGGACCATTTCTCGATTTGT-3'（SEQ ID No. 3)。
[0045] (二）实时定量PCR
[0046] 实时定量 PCR 反应体系（20 μ L) : SYBR? Premix Ex Taq? II (Perfect Real TimeUOyL，浓度为10μΜ的通用引物lyL，浓度为10μΜ的特异引物lyL及步骤（一） 得到的cDNA用ddH 20稀释10倍后的溶液1 μ L，ddH20 7 μ L。
[0047] 用 Bio-Rad CFX96 进行实时定量 PCR (real-time PCR)。
[0048] 实时定量