irl62b 进行测 序，结果正确。
[0093] 引物序列如下：
[0094] pri-mirl62b 正向引物：5, ~CGGGATCCGCCACCATCACAAGCAACCTTGTG~3> (SEQ ID No. 16)
[0095] (下划线所示的序列为BamHI酶切识别位点）
[0096] pri-miR162b 反向引物：5，-GCTCTAGAGTGGCAGCAGCAATATGAGGATATTTG-3，（SEQ ID No. 17)
[0097] (下划线所示的序列为Xbal酶切识别位点）
[0098] 2、将重组质粒pCAMBIA2300-35S-pri-mirl62b转化水稻WT，具体方法参见文献 "Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T (1994) Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J 6:271-282. "得到 miR162b 过表达的转基因水稻。
[0099] (二）miR162b功能缺失的水稻的构建
[0100] 1、合成 STTM162b，STTM162b 的工作原理如文献，3即，6丄.，￥&11，1，611，￥· Y. , Qiao, Μ. Μ. , Fan, R. ff. , Mao, Y. P. , and Tang, X. Q. (2012). Construction of short tandem target mimic(STTM)to block the functions of plant and animal microRNAs. Methods 58:118-125. "所述，其序列如下：
[0101] STTM162b ：
[0102] 5 ' -ggtaccCTGGATGCAGActaGGCTTATCGAgttgttgttgttatggtctaATTTAAATatggtcta aaga agaagaatCTGGATGCAGActaGGCTTATCGAccc￡gg-3, (SEQ ID No. 19)
[0103] (下划线所示的序列为酶切识别位点）
[0104] 2、ΚρηΙ和Xmal双酶切STTM162b，得到基因片段；ΚρηΙ和Xmal双酶 切pCAMBIA2300-Ubiquitin，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接， 得到重组质粒，将其命名为pCAMBIA2300-Ubiquitin-STTM162b。将重组质粒 pCAMBIA2300-Ubiquitin-STTM162b 进行测序，结果正确。
[0105] 3、将重组质粒pCAMBIA2300-Ubiquitin-STTM162b转化水稻WT,具体方法参 见文献 "Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T (1994) Efficient transformation of rice (Oryza sativa L. )mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J 6:271-282."得到 miR162b 功能缺失的水稻。
[0106] (三）0sTREl过表达的转基因水稻的构建
[0107] 1、以水稻WT基因组DNA为模板，以0XTRE1正向引物和0XTRE1反向引物为 引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，该产物的序列如SEQ ID No. 22所示；ΚρηΙ和 BamHI双酶切SEQ ID No. 22所示的DNA分子，得到基因片段；ΚρηΙ和BamHI双酶切 pCAMBIA2300-Ubiquitin，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒， 将其命名为 pCAMBIA2300-Ubiquitin-TREl。将重组质粒 pCAMBIA2300-Ubiquitin-TREl 进 行测序，结果正确。
[0108] 引物序列如下：
[0109] 0XTRE1 正向引物：5, -GGGGTACCATGGCGCCCACCGCCGC-3' (SEQ ID No. 20)
[0110] (下划线所示的序列为ΚρηΙ酶切识别位点）
[0111] 0XTRE1 反向引物:5' -CGGGATCCCTAGCAGTCTATCTTCTTGTCCTGAGG-3' (SEQ ID No. 21)
[0112] 2、将重组质粒pCAMBIA2300-Ubiquitin_TREl转化水稻WT，具体方法参见文献 "Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T (1994) Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J 6:271-282"得到OsTREl过表达的转基因水稻。
[0113] 二、miR162b过表达、miR162b功能缺失及miR162b靶基因 OsTREl过表达的转基因 水稻的鉴定
[0114] miR162b过表达、miR162b功能缺失的转基因水稻以及WT的miR162b表达水平的 检测方法如实施例1中步骤二的（一）和（二），miR162b过表达、miR162b功能缺失的转 基因水稻、miR162b靶基因 OsTREl过表达的转基因水稻以及WT的OsTREl的表达水平的检 测如实施例1的步骤二的（三）。检测结果如图6所示。
[0115] 将以上鉴定后的miR162b过表达、miR162b功能缺失及miR162b靶基因 OsTREl过 表达的转基因水稻分别简称为〇xmiR162b、STTM162b和oxTREl。
[0116] 图6中，oxmiR162b 4和oxmiR162b 7为oxmiR162b的两个转基因水稻的独立株 系；STTM162b 14和STTM162b 18为STTM162b的两个转基因水稻的独立株系；oxTRE14和 oxTRE134为oxTREl的两个转基因水稻的独立株系。
[0117] 图6表明，与WT相比，oxmiR162b 4和oxmiR162b 7中的miR162b表达量显著提高， OsTREl的表达量显著降低，miR162b过表达的转基因水稻构建成功。与WT相比，STTM162b 14和STTM162b 18中的miR162b表达量显著降低，OsTREl的表达量显著提高，miR162b功 能缺失的水稻构建成功。与WT相比，oxTREl 4和oxTREl 34的OsTREl表达量显著提高， OsTREl过表达的转基因水稻构建成功。
[0118] 三、转基因水稻的抗旱性分析
[0119] 将以上鉴定的构建成功的miR162b过表达、miR162b功能缺失及miR162b靶基因 OsTREl过表达的转基因水稻（分别为oxmiR162b、STTM162b和oxTREl)分别与WT -起进 行干旱试验，具体步骤如下：
[0120] 将转基因水稻（oxmiR162b、STTM162b和oxTREl)分别与WT种在同一盆里正常浇 水至5片叶时期，然后停止浇水，让植物一直处于干旱状态直至有一组植物的叶片全部卷 曲。图7A表明，其中oxmiR162b和WT组在干旱第6天出现上述表型，而STTM162b和WT组 及oxTREl和WT组则第4天就出现如上表型。
[0121] 重新浇水2周后，记录每组植物的存活率，结果如图7B所示。图7B表明，经干旱 复水后，oxmiR162b水稻的存活率高于WT，而STTM162b和oxTREl水稻的存活率低与WT。
[0122] 实验表明，受ΑΒΑ调控的miRNA162b通过负调控OsTREl的表达量提高了水稻的抗 旱能力。
【主权项】
1. 一种提高植物抗旱性的方法，是提高植物中SEQIDNo. 1所示的RNA分子的水平或 降低SEQIDNo. 15所示的RNA分子的水平。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述提高植物中SEQIDNo. 1所示的RNA 分子的水平或降低SEQIDNo. 15所示的RNA分子的水平的方法是将SEQIDNo. 18所示的 DNA分子导入出发植物中实现的，与出发植物相比，转基因植物的抗旱性增强。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述SEQIDNo. 18所示的DNA分子 是通过重组表达载体导入的。4. 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体是将所述SEQ IDNo. 18所示的DNA分子插入出发载体pCAMBIA2300-35S的BamHI和Xbal多克隆位点间 得到的。5. 根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述植物为水稻。 6. SEQIDNo. 1所示的RNA分子在识别和/或切割和/或降解SEQIDNo. 11所示的 DNA分子的转录产物中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述转录产物为SEQIDNo. 15所示的RNA 分子。 8. SEQIDNo. 1所示的RNA分子或SEQIDNo. 18所示的DNA分子在提高植物抗旱性中 的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述植物为水稻。
【专利摘要】本发明公开了一种受ABA调控的miRNA在提高植物抗旱性中的应用。本发明公开一种提高植物抗旱性的方法，是提高植物中SEQ？ID？No.1所示的RNA分子的水平或降低SEQ？ID？No.15所示的RNA分子的水平。本发明证明受ABA调控的miRNA162b通过负调控OsTRE1的表达量提高了水稻的抗旱能力。本发明对研究水稻抗胁迫机制十分重要，也为提高水稻抗胁迫能力进而实现高产提供了思路。
【IPC分类】C12N15/82, C12Q1/68, A01H5/00
【公开号】CN105441474
【申请号】CN201410382648
【发明人】邱金龙, 左张丽, 田彩娟
【申请人】中国科学院微生物研究所
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年8月6日