重组昆虫蜕皮激素失活基因Bbsp::egt及其杀虫真菌剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新的重组蜕化类固醇尿苷5'-二磷酸-葡糖基转移酶编码基因 Bbsp: :egt，具体地说含有编码球孢白僵菌（Beauveria bassiana)几丁质酶的信号肽 (Bbsp)和编码舞毒蛾核型多角体病毒(LdMNPV)蜕化类固醇尿苷5'-二磷酸-葡糖基转移酶 基因（egt)的重组序列。
[0002] 本发明涉及表达上述重组序列的真菌表达载体。
[0003] 本发明还涉及表达上述重组载体的杀虫真菌剂。
[0004]
【背景技术】
[0005] 传统农业生产中频繁使用的DDT、除虫菊酯等化学杀虫剂大部分都会严重地改变 生态系统结构，并对人体有害，甚至会集中在食物链中，对人类的健康产生潜在威胁。因此， 在此背景下，对环境安全的生物杀虫剂受到人们越来越多的关注。真菌是控制自然界昆虫 种群数量的主要因素，已被开发成为真菌杀虫剂，成为化学杀虫剂的重要补充。真菌杀虫剂 具有对环境安全、可持续性强等优点。然而鉴于真菌杀虫活性的发挥需要一系列复杂的过 程，真菌杀虫剂往往具有致死寄主速度慢，对环境条件要求高等缺点，严重制约了它农药市 场的应用及推广(Harry C et al.，2014)。因此，如何提高这些生物杀虫剂的效率，并研究 其作用机理已成为该领域的一个研究重点。
[0006] 有研究表明，昆虫的生长发育及免疫反应受到体内蜕皮激素20E的调控。丛林等发 现(丛林，2013)，合成蜕皮激素的相关基因 Nvd的突变，可造成幼虫取食停止，并在进入下一 龄期前死亡；桔小实蝇突变体体内蜕皮激素的水平严重降低会导致胚胎后期的发育停滞， 表皮不分化，头部不褪化，背合不全和后肠畸形环化甚至死亡。此外，20E也能提高昆虫的免 疫或解毒能力。将外源20E处理6龄取食期棉铃虫，发现血细胞密度在处理12h后增加了 2倍， 细胞间的粘连作用增强，吞噬率提高了近15%(柴连琴，2015)，暗示20E-定程度上参与了昆 虫免疫反应的正调控。邹凤鸣（邹凤鸣，2010)发现，较高浓度20E处理家蚕后，体内参与内源 性和外源性底物的解毒代谢的一类谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)表现出显著的上调表达，表 明20E提高了昆虫的解毒能力。以上研究显示，蜕皮激素20E广泛参与了昆虫生长发育、免 疫、解毒等生理生化反应，在体内滴度的降低可能导致昆虫的发育受阻或死亡。因此，如能 在真菌侵染宿主的过程中降低昆虫体内20E水平，则可能会有助于真菌击倒宿主。来自 LdMNPV病毒的egt基因产物能以昆虫蜕皮激素20E为底物，在其分子上添加糖基使20E失活， 从而降低20E水平。
[0007]
【发明内容】
[0008] 针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种重组昆虫蜕皮激素失 活基因 Bbsp: egt。
[0009] 本发明还提供所述重组昆虫蜕皮激素失活基因 Bbsp:egt应用于杀虫真菌剂，干扰 宿主昆虫的相关激素水平，降低昆虫的免疫抵御能力，以此改良杀虫真菌球孢白僵菌的杀 虫效力，解决昆虫病原真菌侵染效率低的问题。
[0010] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种重组昆虫蜕皮激素失活基因 Bbsp: egt，其特征在于，含有一段融合基因，所述融合基因由来源于球孢白僵菌(Beauveria bassiana)编码几丁质酶的分泌型信号肽（Bbsp)基因与来源于舞毒蛾核型多角体病毒 (Lymantria dispar nuclepolyhedrovirus，以下简称LdMNPV)编码！I兑化类固醇尿苷5 ' -二 磷酸-葡糖基转移酶的egt基因融合构成Bbsp: :egt;融合基因 Bbsp: :egt具有如SEQ ID N0. 1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
[0011] 进一步，所述Bbsp: :egt的真菌表达载体构建方法，包括如下步骤： 1) Bbsp: :egt基因的合成 在LdMNPV病毒egt基因前端加入一段球孢白僵菌(Beauveria bassiana)编码几丁质酶 的信号肽（Bbsp)基因序列（N端31个氨基酸），两端分别添加 Xba I酶切位点后人工合成 Bbsp: : egt片段，将Bbsp: : egt片段克隆到puc57_simple载体后，筛选获得测序正确的克隆 载体并将其命名为口此57-8；[11^|16-1^)8口：：6区1：; 2) Bbsp: :egt真菌表达载体的构建 利用常规分子生物学方式将Bbsp: :egt片段构建到超量表达载体puc-bar-Pgpda上； 首先乂&&1单酶切口11057-8；[11^|16-1^^::681:，获得约1.81^)的1^8。：：681:目标片段，克隆 进经Xba I单酶切并去磷酸化处理的puc-bar-Pgpda线性化载体(约5.5kb);重组载体转入 大肠杆菌DH5a，以P1/P2为引物进行方向筛选(P1引物位于启动子Pgpda区域，P2引物位于 Bbsp: :egt内部，因而正向转化子扩增出约0.8kb片段，反之则无法形成扩增条带）后，获得 puc-bar-Pgpda-Bbsp: :egt重组表达载体，其上游含有一个真菌组成性启动子Pgpda，质粒 图谱如图1所示。筛选方向所用引物序列如下： 筛选所用PCR反应体系：5.0 yL 2XTaq mix，lyL模板（约30ng)，0.5 yL Pl，0.5 yL Ρ2,3·0 yL dH20,总体积 10 yL; 筛选所用PCR反应参数：95°C (5min); 30 circles: 95°C (30sec), 56°C (30 min), 720C (lmin)；720C(5min)； 3) 真菌的遗传转化及鉴定 芽孢子遗传转化参照Fan等人的方法(Fan et al. ,2011);以引物P1与P2进行PCR验证 获得16个正向转化子，结果如图2;PCR反应体系：5.0 yL 2XTaq mix，lyL模板(约30ng)， 0.5 yL Ρ1，0·5 yL P2,3.0 yL dH20,总体积 10 yL; PCR反应参数：95°C (5min); 30 circles: 95°C (30sec), 56°C (30 sec), 72°C (lmin) ； 720C(5min)； 4) 球孢白僵菌转化子中Bbsp: :egt表达量的测定 为获得Bbsp: :egt高水平表达的真菌转化子，无菌条件下接种各转化子于1/2SDY液体 培养基，26°C摇床培养3天，抽滤取菌丝体提取RNA，经反转录合成cDNA(TaKaRa， PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser),以此为模板进行 Real-time PCR。实 验获得两个Bbsp::egt高水平表达转化子，分别命名为F1、F2(图3)。1^引物?3/?4序列如下： RT-PCR反应体系：5.0 yL Universal SYBR Green Supermix(Bio-RAD)，4.0 yL cDNA， 0.5 yL P3,0.5 yL P4,总体积 10 yL; RT-PCR反应参数：95°C (3 min); 36 circles: 95°C (lOsec), 56°C (20sec), 72°C (20sec)0
[0012] 本发明还提供一种杀虫真菌剂，含有一段融合基因 Bbsp: :egt，所述融合基因由来 源于球孢白僵菌(Beauveria bassiana)编码几丁质酶的分泌型信号肽(Bbsp)基因与来源 于舞毒蛾核型多角体病毒(LdMNPV)的蜕皮激素失活基因 egt融合构成，主要包含权利要求1 或2所述的重组昆虫蜕皮激素失活基因。
[0013] 相比现有技术，本发明具有如下有益效果： 1、本发明提供一种重组昆虫銳皮激素失活基因 Bbsp: egt，包含重组Bbsp: : egt真菌表 达载体，构建球孢白僵菌分泌型信号肽Bbsp与egt的融合基因，导入球孢白僵菌中组成性表 达，实现基因的跨种结合，使真菌在侵染宿主的过程中打破激素分泌的平衡，干扰正常生理 生化反应的正常运作，降低宿主昆虫对病原真菌的免疫抵御能力，提高真菌在宿主血腔中 的增殖速度，从而增强真菌的杀虫效果。
[0014] 进一步，将LdMNPV病毒egt基因与杀虫真菌球孢白僵菌相结合，可有效提高真菌生 防制剂的防治效果，并有利于研究杀虫真菌的侵染致病机理，因此具有较强的理论与应用 价值。
[0015] 2、本发明中，egt参与了 20E-EH-ETH的生长发育调节反应链。20E在昆虫的生长发 育过程中扮演重要的角色，调节着昆虫的蜕皮、蛹化等过程。此外，20E还能促进生殖功能 (Wu et al.，2006;Liu et al.，2009)、免疫反应等。有资料显示，20E处理后的6龄棉铃虫血 细胞密度增加，细胞间的粘连作用增强，吞噬率提高约15%(柴连琴，2015)。叫丨基因的编码 产物蜕化类固醇尿苷5'-二磷酸-葡糖基转移酶能失活20E。含有egt基因的杆状病毒能引起 家蚕幼虫龄期延长，体躯肥大，直到停止就食后仍不能入眠的现象(王厚伟等，2000)。上述 研究表明，egt可能通过抑制20E的活性，造成昆虫体内激素水平发生紊乱。据此，我们在真 菌中导入融合基因 Bbsp: :egt，使真菌在侵染宿主的过程中，分泌egt编码蛋白，造成宿主激 素水平紊乱，干扰宿主免疫反应，从而提高真菌的杀虫效果。通过该方法可获得高效的真菌 杀虫剂，并为微生物农药的改良提供了新思路。
[0016]
【附图说明】
[0017]图1为本发明重组昆虫蜕皮激素失活基因 Bbsp:egt的质粒图谱。
[0018]图2为本发明Bbsp:egt的球孢白僵菌转化子菌丝PCR验证结果。
[0019]图3为本发明Bbsp:egt各真菌转化子RT-PCR筛选结果。
[0020]图4为本发明Bbsp:egt两真菌转化子的生物测定结果。
[0021] 图5为侵染4天后试虫抗菌相关基因表达情况。
[0022] 图6为试虫体内蜕皮激素20E的含量变化情况。
[0023]
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
[0025]本发明涉及一种重组昆虫蜕皮激素失活基因 Bbsp:egt，所述基因由来源于编码球 孢白僵菌(Beauveria bassiana)几丁质酶的分泌型信号肽(Bbsp)与来源于舞毒蛾核型多 角体病毒(LdMNPV)编码蜕化类固醇尿苷5'-二磷酸-葡糖基转移酶的egt基因融合构成。其 具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和如SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列。
[0026] 另外，本发明还提供一种杀虫真菌转化菌株，本发明所构建的质粒载体可进行杀 虫真菌遗传转化，获得可表达本发明重组蜕皮激素抑制子的杀虫真菌转化菌株，其中杀虫 真菌可以是球抱白僵菌（Beauveria bassiana)、金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae)、黄绿绿僵菌（Metarhizium flavoviride)、布氏白僵菌（Beauveria brongniartii)、玫烟色拟青霉（Paecilomyces fumosoroseus)、汤普森被毛抱（Hirsutella thompsonii)或粉拟青霉(Paecilomyces farinosus)等。本发明构建了球孢白僵菌转化菌 株。
[0027] 以下具体实施中，所用的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。
[0028] -、Bbsp: :egt基因的合成及真菌表达载体构建 【实施例1】 1. Bbsp: : egt基因的克隆合成 在LdMNPV病毒egt基因前端加入一段球孢白僵菌(Beauveria bassiana)几丁质酶的信 号肽序列，两端分别添加 Xba I酶切位点后人工合成，将Bbsp: :egt克隆到puc57_simple载 体后，获得测序正确的克隆载体并将其命名为口11〇57-8；[11^|16-8&8口：：6区1：。
[0029] 2.超量表达载体的构建 利用常规分子生物学方式将Bbsp: : egt片段构建到超量表达载体puc-bar-Pg