一种从菠菜中提取蜕皮激素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从菠菜中提取蜕皮激素的方法，取待测样品，在液氮中研磨成粉末，加入体积比9∶150ml?MeOH-CHCl3混合液或100％MeOH溶液至50ml，在37℃下震荡2小时，然后用硅胶粉过滤，加入少许NaCl和50ml?n-Hexane萃取两次，收集MeOH层，用旋转蒸发仪进行干燥，再用异丙醇重新溶解样品，过滤后即可进行高效液相色谱分析，测定其含量。该方法中提取物经高效液相色谱分析，提取速度快、提取率高，并可微量提取。
【专利说明】一种从菠菜中提取蜕皮激素的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物源昆虫蜕皮激素类似物的提取分离【技术领域】，涉及一种从菠菜中提取蜕皮激素的方法。
【背景技术】
[0002]植源性蜕皮激素I是一类非常重要的植物次生代谢产物，也是具有昆虫蜕皮活性的天然留体化合物。植源性蜕皮激素能够促进昆虫的蜕皮，高浓度的蜕皮激素可以干扰昆虫正常的生理代谢，使昆虫提早蜕皮而成为弱小的或畸形的个体。昆虫对蜕皮激素相当敏感，轻者可引起昆虫不育，重者可导致死亡。因此，植源性蜕皮激素在植物抵抗非适应性植食性昆虫中扮演着重要的角色，非常低的浓度水平就可以阻止害虫的侵害。从植物中提取蜕皮激素已然成为目前生产、研究和开发的热点。从露水草、筋骨草中提取蜕皮激素的专利和报道屡见不鲜，但目前并没有以菠菜(Spinacia oleracea L.)为原料提取蜕皮激素(beta-Ecdysone)并测定其含量的技术体系。菠菜是为数不多的能够自身合成并积累大量植源性蜕皮激素的农作物。建立高效、简便的菠菜蜕皮激素提取和测定的方法，可以为常规的菠菜抗虫品种选育提供新的检测指标，进而为发展农业害虫防治新技术和抗虫育种提供理论依据。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种简便、快捷地从菠菜中提取蜕皮激素的方法。该方法提取方法简单，回收率高，并且可以微量提取。其具体技术方案为:
[0004]一种从菠菜中提取蜕皮激素的方法，包括以下步骤:
[0005](I)取菠菜叶片，加入液氮，将其研磨为粉末状；
[0006](2)将粉末置于50ml的离心管中，加入体积比为9: I的MeOH-CHCl3混合液或100%的MeOH溶液至50ml，放入恒温培养摇床震荡2h，摇床温度设为37°C，转速设为180rpm ；
[0007](3)将娃藻土 545加入到磨口布氏砂芯漏斗中，厚度为2cm,压实,将上述提取液倒入漏斗，使用循环水式多用真空泵SHK-1II抽滤样品；
[0008](4)将抽滤好的样品倒入分液漏斗中，加入己烷(Hexane) 50ml和少许NaCl，剧烈震荡，使其充分萃取，然后静置30min，取下层萃取液，上层萃取液倒掉，此步骤重复两遍；
[0009](5)取萃取好的溶液，用旋转蒸发仪干燥样品，水温为45-50°C，干燥晶体即为蜕皮激素提取物。
[0010]进一步优选，步骤(1)所述的菠菜叶片为新鲜的菠菜叶片。
[0011]进一步优选，步骤(1)所述的菠菜叶片研磨后需记录其质量。
[0012]进一步优选,步骤(4)所述的NaCl的质量≤溶液质量的5%。
[0013]进一步优选，步骤(5)所述的干燥样品的温度为45_50°C。[0014]一种本发明所述的从菠菜中提取蜕皮激素的方法制备得到的蜕皮激素样品。
[0015]与现有技术相比，本发明的有益效果为:本发明利用甲醇、氯仿和己烷沉淀相结合以及多次重复提取的工艺，从菠菜中提取蜕皮激素，不仅操作简便、耗时短、而且提取效率高，可以微量提取。蜕皮激素提取率可以达到100%。采用甲醇为提取溶剂，不但降低提取成本，同时也避免了环境污染。采用高效液相色谱法测定蜕皮激素含量，灵敏度水平可达5mg/L。本发明的蜕皮激素通过三种有机溶剂的混合提取和萃取，使得该方法提取率达到100%，为植物体内该物质的检测提供了可信的提取检测方法，可以利用在分子检测常规育种中，也可以利用在基因功能的研究中。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0017]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0018](I)取菠菜叶片，加入液氮，将其研磨为粉末状。
[0019](2)将粉末置于50ml的离心管中，加入MeOH-CHCl3 (9: 1，V/V)至50ml，放入恒温培养摇床震荡2h，摇床温度设为37°C，转速设为180rpm。
[0020](3)将硅藻土 545加入到布氏砂芯漏斗中，使用循环水式多用真空泵SHK-1II抽滤样品。
[0021](4)将抽滤好的样品倒入分液漏斗中，加入己烷(Hexane) 50ml和少许NaCl，剧烈震荡，使其充分萃取，然后静置30min，30min后，取下层萃取液，上层萃取液倒掉。此步骤重复两遍。
[0022](5)取萃取好的溶液，用旋转蒸发仪干燥样品，水温为45-50°C，直到将样品蒸干为止。
[0023](6)向样品中加入异丙醇(Isopropanol),使用KQ-500DE型数控超声波清洗器进行震荡加速样品的溶解，震荡时间在5min左右，直到烧瓶壁上的固体全部溶解为止。
[0024](7)将溶解好的样品溶液用移液枪吸出，利用一次性注射器将溶液通过0.45 iim的聚偏氟乙烯微孔滤膜(F型)过滤到2ml棕色色谱进样瓶中。保存在4°C冰箱中。
[0025](8)高效液相色谱法测定蜕皮激素含量
[0026]移动相为10% Isopropanol (0.1% TFA)，所有试剂需要经过过滤，并使用数控超声波清洗器清洗并抽气后使用。所使用的仪器为AgilentllOOSeries高效液相色谱仪，色谱柱(Column)为Symmetry? C185 u m4.6X250mm,流动相为 10%异丙醇(Isopropanolalcohol)，检测波长(Wavelength)为 248nm,柱温(Column Temp)为 40°C,流速(Flow rate)为1.2ml/min，进样量为20 U I，运行时间45.0min0
[0027]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种从菠菜中提取蜕皮激素的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)取菠菜叶片，加入液氮，将其研磨为粉末状； (2)将粉末置于50ml的离心管中，加入体积比为9:1的MeOH-CHCl3混合液或100%MeOH溶液至50ml，放入恒温培养摇床震荡2h，摇床温度设为37°C，转速设为180r/min ； (3)将硅藻土545加入到布氏砂芯漏斗中，厚度为2cm，压实，将上述提取液倒入漏斗，使用循环水式多用真空泵SHK-III抽滤样品； (4)将抽滤好的样品倒入分液漏斗中，加入己烷50ml和NaCl，剧烈震荡，使其充分萃取，然后静置30min,取下层萃取液,上层萃取液倒掉,此步骤重复两遍； (5)取萃取好的溶液，用旋转蒸发仪干燥样品，水温为45-50°C，干燥晶体即为蜕皮激素提取物。
2.根据权利要求1所述的从菠菜中提取蜕皮激素的方法，其特征在于:步骤(1)所述的菠菜叶片为新鲜的菠菜叶片。
3.根据权利要求1所述的从菠菜中提取蜕皮激素的方法，其特征在于:步骤(1)所述的菠菜叶片研磨后需记录其质量。
4.根据权利要求1所述的从菠菜中提取蜕皮激素的方法，其特征在于:步骤(4)所述的NaCl的质量≤溶液质量的5%。
5.根据权利要求1所述的从菠菜中提取蜕皮激素的方法，其特征在于:步骤(5)所述的干燥样品的温度为45-50°C。
6.—种权利要求1-5中任一项 所述的从菠菜中提取蜕皮激素的方法制备得到的蜕皮激素。
【文档编号】C07J9/00GK103788162SQ201410017263
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月7日 优先权日:2014年1月7日
【发明者】段方猛, 宋雯雯 申请人:青岛农业大学