专利名称：一种提取和分离虫草素的方法
技术领域：
本发明属于农产品深加工技术领域，具体涉及一种提取和分离虫草素的方法。
背景技术：
虫草菌素又称虫草素、蛹虫草菌素，3’ -脱氧腺苷，它是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素。其分子式为CltlH13N5O3,分子量为251. 24，熔点230-231°C，溶于水、热乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，紫外光的最大吸收波长为259nm。虫草素有抗肿瘤、抗白血病、抗菌、免疫调节、清除体内自由基等多方面的药理作用。另据报道，虫草素一方面具有对DNA和RNA合成过程、加RNA和mRNA转录后修饰过程及腺苷酸环化酶活化等三方面的抑制作用，另一方面它又能促进细胞分化，重建细胞骨架。虫草素有降低胆固醇、降血糖、抗感染、抗疟原虫、抗蚊虫的作用，含虫草素的虫草发酵液对哮喘及支气管疾病、肾衰竭病人的肾功能等方面都有良好的辅助治疗效果。
目前，虫草素主要通过生物合成的方法经由两条途径获得一是直接从蛹虫草子实体中提取；二是通过蛹虫草液体发酵，从发酵液中提取。虫草素的获得主要从蛹虫草子实体中提取。但子实体中含量只有0. 2-0. 6%，提取效率不高，因此虫草素生产成本极高，价格昂贵。因为虫草素疗效显著并且大量提取分离得到纯品非常不易，目前国际市场上虫草素的价格非常昂贵，随着研究的深入虫草素的商业价值更是不可估量。中山大学采用行星球磨法对冬虫夏草子实体进行破碎，超声溶解，活性炭除杂来提取虫草素(专利申请号CN201110004151.0)。但是该方法在子实体破碎过程中容易产生热量造成虫草素提取率低，而且只能对干燥样品进行加工，对于含水高的样品加工困难
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的虫草素提取方法过程中容易产生热量造成虫草素提取率低、纯度低、只能对干燥样品进行加工，对于含水高的样品加工困难的问题，而提供一种提取和分离虫草素的方法。一种提取和分离虫草素的方法，该方法包括如下步骤(I)超低温粉碎将雪花冬虫夏草原料采用低温粉碎机以液氮为介质在温度为_196°C以下粉碎，得到粉末；(2)虫草素的提取将步骤(I)得到的粉末和蒸馏水以重量比1:5-1:20混合，超声波提取、离心过滤后，得到提取液；(3)分离将步骤(2)得到的提取液与大孔树脂混合平衡，温度20°C，经洗脱液洗脱树脂柱，收集流出液冻干；(4)纯化用反向高效液相色谱将步骤(3)得到的流出液进行纯化，得到虫草素的浓缩物。优选的是，所述的步骤(I)中雪花冬虫夏草为雪花冬虫夏草子实体或雪花冬虫夏草菌丝体。
优选的是，所述的步骤(I)的温度为_196°C。优选的是，所述的步骤(2)是在超生频率20-30KHZ，输出功率100W-200W条件下进行超生波提取。优选的是，所述的步骤(2)中的超声波提取时间为15_30min。优选的是，所述的步骤(3)中的提取液的上样量为大孔树脂体积的10倍，提取液的吸附流速为大孔树脂吸附流速的1-3倍。优选的是，所述的步骤(3)中的洗脱液为浓度为20-50% (V/V)的乙醇，洗脱液为5-10倍树脂柱体积，流速2-4BV/hr。
优选的是，所述的步骤(4)中反向高效液相色谱条件为色谱柱20X150mmX5um的 C18 制备柱，柱温20°C，流动相组成10%甲醇，0. 05M磷酸缓冲液，pH7. 2，流速lml/min,检测波长260nm，进样量200ul。优选的是，所述的步骤(4)用反向高效液相色谱将步骤(3)得到的流出液进行纯化，经纳滤脱盐、干燥得到虫草素的浓缩物。优选的是，所述的纳滤脱盐用的复合膜为截留分子量200Da的NF-1812卷式聚酰胺。本发明的有益效果本发明提供一种提取和分离虫草素的方法，该方法将雪花冬虫夏草原料采用低温粉碎机以液氮为介质在温度为_196°C以下粉碎，可以防止高温条件下虫草素提取率降低，得到粉末；将得到的粉末和蒸馏水以重量比1:5-1:20混合，在超生频率20-30KHZ，输出功率100W-200W条件下进行超生波提取、离心过滤后，得到提取液，该方法采用低频超声低输出功率促溶，可以提高虫草素的提取率，防止虫草素在高频超声波条件下被破坏；将得到的提取液与大孔树脂混合平衡，温度20°C，经洗脱液洗脱树脂柱，收集流出液冻干，水提取结合树脂亲和，可以防止有机污染，同时有助于其他虫草活性成分的综合加工；用反向高效液相色谱进行纯化、经纳滤脱盐、干燥得到虫草素的浓缩物。经测定，本发明的一种提取和分离虫草素的方法，虫草素的质量含量最高可达到98-99%，回收率可达到88-90%。
图I为本发明实施例2雪花冬虫夏草菌丝体经超声波提取后虫草素含量分析的HPLC谱图；图2为本发明实施例2雪花冬虫夏草菌丝体与大孔树脂混合后虫草素含量分析的HPLC谱图；图3为本发明实施例2雪花冬虫夏草菌丝体经冷冻干燥后虫草素含量分析的HPLC谱图。
具体实施方式
一种提取和分离虫草素的方法，该方法包括如下步骤(I)超低温粉碎将雪花冬虫夏草原料采用低温粉碎机以液氮为介质在温度为_196°C以下粉碎，得到粉末；(2)虫草素的提取将步骤(I)得到的粉末和蒸馏水以重量比1:5-1:20混合，超声波提取、离心过滤后，得到提取液；(3)分离将步骤(2)得到的提取液与大孔树脂混合平衡，温度20°C，经洗脱液洗脱树脂柱，收集流出液冻干；(4)纯化用反向高效液相色谱将步骤(3)得到的流出 液进行纯化，得到虫草素的浓缩物。所述的步骤(I)中雪花冬虫夏草为雪花冬虫夏草子实体或雪花冬虫夏草菌丝体。所述的步骤(I)的温度优选为_196°C，过200-700目筛，得到粉末。所述的步骤(2)得到的粉末和蒸馏水重量比优选为I :10混合。所述的步骤(2)是在超生频率20-30KHZ，输出功率100W-200W条件下进行超生波提取，提取时间为15-30min。所述的步骤(2)中离心过滤过程中的转速为5000转/分，时间为15min。所述的步骤(3)中大孔树脂为天津市海光化工有限公司生产，型号为NKA II。所述的步骤(3)中的提取液的上样量为大孔树脂体积的10倍，提取液的吸附流速为大孔树脂吸附流速的1-3倍。所述的步骤(3)中的洗脱液为浓度为20-50% (V/V)的乙醇，洗脱液为5_10倍树脂柱体积，流速2-4BV/hr。所述的步骤(4)中反向高效液相色谱条件为色谱柱20X150_X5um 的 C18 制备柱，柱温20。。，流动相组成10%甲醇，0. 05M磷酸缓冲液，pH7. 2，流速lml/min,检测波长260nm，进样量200ul。所述的步骤(4)用反向高效液相色谱将步骤(3)得到的流出液进行纯化后，优选经纳滤脱盐、干燥得到虫草素的浓缩物。所述的纳滤脱盐将纯化后的提取液在温度为20°C，pH7. 2,0. 4Mpa操作压力下进行纳滤脱盐，所述的纳滤脱盐用的复合膜为截留分子量200Da的NF-1812卷式聚酰胺，有效膜面积0. 2m2,弱负电性；所述的冷冻干燥是在_40°C，IOpa条件下进行。实施例I将雪花冬虫夏草子实体原料采用低温粉碎机(上海丽科高分子材料有限公司)以液氮为介质在_196°C条件下粉碎，过200目筛，得到粉末；将得到的粉末和蒸馏水以重量比I 5混合，在超生频率(日本本多W-115超声波清洗机)28KHz，输出功率200W条件下进行超生波提取，提取时间为30min，然后以转速5000转/分离心(高速冷冻离心机GL-20B)过滤15min,得到提取液，经液相色谱分析，虫草素质量含量0. 0010% ;将提取液与大孔树脂(天津市海光化工有限公司生产，型号为NKA II)混合平衡，温度20°C，上样量10倍树脂体积，吸附流速3倍树脂BV/hr，以浓度为20% (V/V)乙醇为洗脱剂洗脱树脂柱，洗脱剂为10倍树脂柱体积，流速2BV/hr ;收集流出液冻干，经HPLC分析测定，虫草素质量含量达51%，回收率达90% ;用反向高效液相色谱(Waters Delta600)进行纯化，反向高效液相色谱条件为色谱柱C18制备柱(20X150mmX5um)，柱温20°C，流动相组成10%甲醇，0. 05M磷酸缓冲液，pH7. 2，流速lml/min，检测波长260 nm，进样量200ul ;然后将纯化后的提取液在温度为20°C，pH7. 2,0. 4Mpa操作压力下进行纳滤脱盐，所述的纳滤脱盐用的复合膜为截留分子量200Da的NF-1812卷式聚酰胺，有效膜面积0. 2m2,弱负电性；在_40°C，IOpa条件下冷冻干燥得到虫草素的浓缩物。经测定纯度98%，回收率88%，虫草素质量含量达到98%。实施例2雪花冬虫夏草菌丝体原料采用低温粉碎机(上海丽科高分子材料有限公司)以液氮为介质在_196°C条件下粉碎，过700目筛，得到粉末；将得到的粉末和蒸馏水以重量比I 10混合，在超生频率(日本本多W-115超声波清洗机)30KHz，输出功率100W条件下进行超生波提取，提取时间为20min，然后以转速5000转/分离心(高速冷冻离心机GL-20B)过滤15min，得到提取液，经液相色谱分析，虫草素质量含量0. 0012%,如图I所示(图中的标注※的峰代表虫草素)；将提取液与大孔树脂(天津市海光化工有限公司生产，型号为NKA II)混合平衡，温度20°C，上样量10倍树脂体积，吸附流速I倍树脂BV/hr，以浓度为30% (V/V)乙醇为洗脱剂洗脱树脂柱，洗脱剂为10倍树脂柱体积，流速3BV/hr ;流出液冻干，经液相色谱检测分析测定，回收率达92%，虫草素质量含量达54%，如图2所示(图中的标注※的峰代表虫草素)；用反向高效液相色谱进行纯化，反向高效液相色谱条件为色谱柱C18制备柱(20\150臟\511111)，柱温201，流动相组成10%甲醇，0. 05M磷酸缓冲液，pH7. 2，流速lml/min，检测波长260nm，进样量200ul ;然后将纯化后的提取液在温度为20°C，PH7. 2,0. 4Mpa操作压力下进行纳滤脱盐，所述的纳滤脱盐用的复合膜为截留分子量200Da的NF-1812卷式聚酰胺，有效膜面积0. 2m2,弱负电性；在在_40°C，IOpa条件下冷冻干燥得到虫草素的浓缩物。经测定纯度99%，回收率90%，虫草素质量含量达到99%，如图3所示(图中的标注※的峰代表虫草素)。实施例3雪花冬虫夏草子实体原料采用低温粉碎机(上海丽科高分子材料有限公司)以液氮为介质在_196°C条件下粉碎，过500目筛，得到粉末；将得到的粉末和蒸馏水以重量比I 20混合，在超生频率(日本本多W-115超声波清洗机)20KHz，输出功率100W条件下进行超生波提取，提取时间为lOmin，然后以转速5000转/分离心(高速冷冻离心机GL-20B)过滤15min，得到提取液，经液相色谱分析，虫草素质量含量0. 0011%;将提取液与大孔树脂(天津市海光化工有限公司生产，型号为NKA II)混合平衡，温度20°C，上样量10倍树脂体积，吸附流速I. 5倍树脂BV/hr，以浓度为50% (V/V)乙醇为洗脱剂洗脱树脂柱，洗脱剂为10倍树脂柱体积，流速4BV/hr ;将流出液冻干，经液相色谱检测分析测定，回收率达91%，虫草素质量含量达52% ;用反向高效液相色谱进行纯化，反向高效液相色谱条件为色谱柱C18制备柱(20\150臟\511111)，柱温:20°C，流动相组成10%甲醇，0. 05M磷酸缓冲液，pH7. 2，流速lml/min，检测波长260nm，进样量200ul ;然后将纯化后的提取液在温度为20°C，pH7.2，0. 4Mpa操作压力下进行纳滤脱盐，所述的纳滤脱盐用的复合膜为截留分子量200Da的NF-1812卷式聚酰胺，有效膜面积0. 2m2,弱负电性；在在_40°C，IOpa条件下冷冻干燥得到虫草素的浓缩物。经测定纯度98. 5%，回收率89%，虫草素质量含量达到9 8. 5%。
权利要求
1.一种提取和分离虫草素的方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)超低温粉碎将雪花冬虫夏草原料采用低温粉碎机以液氮为介质在温度为_196°C以下粉碎，得到粉末； (2)虫草素的提取将步骤(I)得到的粉末和蒸馏水以重量比1:5-1:20混合，超声波提取、离心过滤后，得到提取液； (3)分离将步骤(2)得到的提取液与大孔树脂混合平衡，温度20°C，经洗脱液洗脱树脂柱，收集流出液冻干； (4)纯化用反向高效液相色谱将步骤(3)得到的流出液进行纯化，得到虫草素的浓缩物。
2.根据权利要求I所述的一种提取和分离虫草素的方法，其特征在于，所述的步骤(I)中雪花冬虫夏草为雪花冬虫夏草子实体或雪花冬虫夏草菌丝体。
3.根据权利要求I所述的一种提取和分离虫草素的方法，其特征在于，所述的步骤(I)的温度为-196°C。
4.根据权利要求I所述的一种提取和分离虫草素的方法，其特征在于，所述的步骤(2)是在超生频率20-30KHZ，输出功率100W-200W条件下进行超生波提取。
5.根据权利要求I或4所述的一种提取和分离虫草素的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的超声波提取时间为15-30min。
6.根据权利要求I所述的一种提取和分离虫草素的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的提取液的上样量为大孔树脂体积的10倍，提取液的吸附流速为大孔树脂吸附流速的1-3 倍。
7.根据权利要求I所述的一种提取和分离虫草素的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的洗脱液为浓度为20-50%的乙醇，洗脱液为5-10倍树脂柱体积，流速2-4BV/hr。
8.根据权利要求I所述的一种提取和分离虫草素的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中反向高效液相色谱条件为 色谱柱20X150_X5um的C18制备柱， 柱温20°C， 流动相组成10%甲醇，0. 05M磷酸缓冲液，pH7. 2， 流速lml/min, 检测波长260nm, 进样量200ul。
9.根据权利要求I所述的一种提取和分离虫草素的方法，其特征在于，所述的步骤(4)用反向高效液相色谱将步骤(3)得到的流出液进行纯化，经纳滤脱盐、干燥得到虫草素的浓缩物。
10.根据权利要求9所述的一种提取和分离虫草素的方法，其特征在于，所述的纳滤脱盐用的复合膜为截留分子量200Da的NF-1812卷式聚酰胺。
全文摘要
本发明提供一种提取和分离虫草素的方法，属于农产品深加工技术领域。解决现有的虫草素提取方法过程中容易产生热量造成虫草素提取率低、纯度低、只能对干燥样品进行加工，对含水高的样品加工困难的问题。该方法是将雪花冬虫夏草低温粉碎后以料水1:5-1:20混合，在超生频率20-30kHz条件下超声提取后，与大孔树脂混合平衡，用反向高效液相色谱进行纯化，经纳滤脱盐、干燥最终得到虫草素的浓缩物。本发明采用低温液氮研磨，并且结合低频超生低输出功率促溶，使虫草素的质量含量最高可达到98-99%，回收率可达到88-90%。
文档编号C07H1/08GK102746355SQ20121020319
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月19日 优先权日2012年6月19日
发明者太青林, 太龙杰, 成怀畅, 王秀然 申请人:吉林省起泰科技有限公司