硫酸软骨素abc酶融合蛋白制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程和发酵工程领域中一种硫酸软骨素酶ABC融合蛋白制备方法 及其应用。
【背景技术】
[0002] 硫酸软骨素裂解酶（chondroi t inase或chondroi t in sulf ateyase，简称为 "ChSase"）是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖（ADi 及寡糖)的裂解酶。
[0003] 随着对ChSase的深入研究，发现硫酸软骨素酶ABC(简称为"ChSase ABC"）有着广 泛的应用价值。科研人员利用ChSase ABC检测硫酸软骨素和生产低分子量硫酸软骨素。鲍 伦军，杨建成等用C h S a s e A B C酶解-高效液相色谱的方法检测鱼翅中的透明质酸，采用 Z0RBAX糖分析柱，紫外检测波长为226nm，检测到鱼翅中透明质酸的质量分数为0.86-1.96 % (鲍伦军等.鱼翅中硫酸软骨素的酶解-高效液相色谱法测定.色谱，2002，20 (6): 557-559)。
[0004] 另外ChSase ABC在临床应用方面也有很大的作用。在缓解视网膜变性方面，可降 解硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)，CSPGs是中枢神经系统(CNS)损伤后胶质瘢痕的重要组分， 可抑制神经轴突再生。CSPGs主要通过糖氨多糖链抑制神经再生，因此去除GAG或者干扰其 合成均可使轴突再生。黄玉苗，高朋芬等通过玻璃体腔注射ChSase ABC酶，免疫荧光法观察 CSPGs的表达，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测多功能蛋白聚糖mRNA的表达，检测光 感受器凋亡情况，结果表明Chase ABC能通过降解变性大鼠视网膜异常沉积的CSPGs，抑制 光感受器细胞的凋亡，从而促进损伤网膜的修复(黄玉苗等.硫酸软骨素酶缓解视网膜变性 大鼠光感受器细胞凋亡.扬州大学学报，2012,33(4): 19-23.)。
[0005] 在提高后肢运动能力方面，ChSase ABC可以修复脊柱损伤。脊髓损伤是脊柱骨折 的常见并发症，可致肢体瘫痪，大小便失禁及呼吸肌瘫痪等一系列严重并发症，脊髓损伤后 神经再生和功能修复，是当今医学领域中的一大难题。孙永新，刘宁等利用ChSase ABC联合 高压氧预处理对成年大鼠脊髓损伤后不同时期后肢运动功能及腓肠肌运动终板内乙酰胆 碱酯酶(AChE)含量的影响，来检测ChSase ABC的作用。结果表明高压氧预处理可以改善大 鼠患肢的运动功能和提高AChE的活性，联合ChSase ABC作用更强(孙永新等.硫酸软骨素酶 ABC联合高压氧预处理对脊髓损伤大鼠后肢运动功能的影响.解剖科学进展，2012,18(6): 526-529.) Aicole J.Tester等用ChSase ABC来治疗受伤的猫，ChSase ABC修复了猫的脊 柱损伤，提高了猫的运动能力（参见：Nicole J.et al.Chondroitinase ABC improves basic and skilled locomotion in spinal cord injured cats.Experimental Neurology,2008,209(2):483-496)〇
[0006] 近年来，Mark R Brown等经研究发现，突出椎间盘内的主要组分为蛋白聚糖，而用 ChSase ABC及ChSase AC则可特异性降解掉突出的椎管内的糖胺聚糖、降低椎管内压，同时 对椎管外周组织无损害（Brown，M D.Method for treating intervertebral disc displacement with enzymes[P]:US,4696816,1987-09-29)。2001 年Denholm EM等发现 ChSase AC、ChSase B能抑制黑色素瘤血管的形成及瘤细胞的转移与增生等(Denholm E M， Lin Y Q,Silver P J. Anti-tumor activities of chondroitinase AC and chondroitinase B: inhibition of angiogenesis proliferation and invasion.European Journal of Pharmacology，2001,416(3) :213-221) aLee MC等发现当 软骨用ChSase ABC处理后，移植的软骨细胞与软骨创面的黏附能力大大增强（Lee M C， Sung K L,Kurtis M S,et al.Adhesive force of chondrocytes to cartilage effects of chondroitinase ABC.Clin 0rthop,2000,370(l):286-294)。
[0007] 对低分子量硫酸软骨素的制备常采用酸水解法、离子交换法和酶解法。前两种方 法需要较复杂的实验设备并且会污染环境，比较而言，酶解法需要的条件不高、方法简便且 容易控制。酶解法的关键在于获得大量的硫酸软骨素裂解酶。分离纯化硫酸软骨素裂解酶 的方法非常复杂，通常需要经过多步的色谱纯化，收率很低。异源重组表达ChSase ABC是常 用来提高ChSase ABC产量的手段之一。然而对ChSase ABC的异源重组表达研究非常有限， 现有技术中使用原核表达系统表达ChSase ABC酶蛋白后以活性蛋白状态存在的比例很低， 变性蛋白需经过变性、复性过程，制备过程繁琐。
[0008] 此外，专利申请CN103305496A公开了一种从微生物提取硫酸软骨素酶的方法，但 是该方法提取步骤繁琐，成本较高。
【发明内容】
[0009] 为解决现有技术的不足，本发明采用一种不同融合标签方法，获得了大量可溶性 的ChSase ABC I的融合蛋白，大大减少了后续处理的复杂程序。
[0010] 本发明的主要目的在于提供一种制备硫酸软骨素 ABC酶融合蛋白的方法，其中，所 述方法包括：1)克隆并连接硫酸软骨素 ABC酶融合蛋白基因，分别克隆所述硫酸软骨素 ABC 酶基因和3-磷酸甘油醛脱氢酶蛋白基因，并连接上述基因，使得后续表达的3-磷酸甘油醛 脱氢酶蛋白和硫酸软骨素 ABC酶蛋白N端连接;2)获得含有所述硫酸软骨素 ABC酶融合蛋白 基因的重组表达载体，将所述步骤1)连接的硫酸软骨素 ABC酶融合蛋白基因重组到表达载 体;3)表达所述硫酸软骨素 ABC酶融合蛋白，将所述步骤2)中克隆的含有硫酸软骨素 ABC酶 融合蛋白基因的表达载体转化到宿主细胞中，进行表达；以及4)收获并纯化表达的所述硫 酸软骨素 ABC酶融合蛋白。优选地，所述步骤1)中所述硫酸软骨素 ABC酶基因编码SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列；所述3-磷酸甘油醛脱氢酶基因编码SEQ ID N0:2所示的氨基酸序 列。
[0011]优选地，所述硫酸软骨素 ABC酶具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸;所述3-磷酸甘油 醛脱氢酶蛋白具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸。
[0012] 优选地，所述步骤1)中硫酸软骨素 ABC酶融合蛋白基因编码SEQ ID N0:3所示的氨 基酸序列。
[0013] 优选地，所述融合蛋白具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸。
[0014]优选地，所述步骤2)中表达硫酸软骨素 ABC酶融合蛋白基因的表达载体包括pMAL-c2x〇
[0015]优选地，所述步骤3)中表达所述硫酸软骨素 ABC酶融合蛋白的宿主细胞包括 E. co 1 iJMl 09和DH5a;其中，所述步骤3)中表达所述硫酸软骨素 ABC酶融合蛋白条件为TB培 养基37°C培养3小时，加入终浓度为0.5mM IPTG 10-42°C诱导培养15-28小时。
[0016] 优选地，所述步骤3)中表达所述硫酸软骨素 ABC酶融合蛋白条件为TB培养基37°C 培养3小时，加入终浓度为0.5mM IPTG 28°C诱导24小时。
[0017] 本发明的另一方面在于提供本发明所述方法制备的硫酸软骨素 ABC酶融合蛋白。
[0018] 优选地，所述硫酸软骨素 ABC酶融合蛋白酶活为30IU/mL，比酶活为37IU/mg。
[0019] 本发明的另一方面在于提供一种DNA，所述DNA序列编码SEQ ID NO: 3所示的氨基 酸序列。
[0020] 本发明的另一方面在于提供一种重组载体，所述重组载体包括载体和本发明所述 的DNA序列，其中，所述载体包括pMAL-c2x。
[0021] 本发明的另一方面在于提供一种转化体，所述转化体是将本发明所述的重组载体 导入宿主细胞而得到的转化体，其中，所述宿主细胞包括E.coli Topl0、JM109、BL21、BL21 (DE3WPDH5a。
[0022] 本发明的另一方面在于提供一种生产低分子量硫酸软骨素 A，B或者C的方法，所述 方法包括：1)克隆并连接硫酸软骨素 ABC酶融合蛋白基因，分别克隆所述硫酸软骨素 ABC酶 基因和3-磷酸甘油醛脱氢酶蛋白基因，并连接上述基因，使得后续表达的3-磷酸甘油醛脱 氢酶蛋白和硫酸软骨素 ABC酶蛋白N端连接;2)获得含有所述硫酸软骨素 ABC酶融合蛋白基 因的重组表达载体，将所述步骤1)连接的硫酸软骨素 ABC酶融合蛋白