检测c-kit基因d816v突变位点的引物、试剂盒及其pcr方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了一种检测C-KIT基因突变的引 物、试剂盒及其PCR方法，用于C-KIT基因D816V突变位点的快速检测。
【背景技术】
[0002] C-KIT基因属于原癌基因，编码的KIT受体属于III型酪氨酸激酶。该受体与配 体--干细胞因子（SCF)结合后，通过形成二聚体激活下游信号，包括Ras/Raf/MAPK通路、 Akt/PI3K通路等，最终活化胞浆内的转录因子，调苄基因表达、控制细胞生长和增殖。
[0003] 正常情况下，KIT受体在干细胞因子的参与作用下活化。若C-KIT基因发生突变， KIT受体活化不需要配体SCF参与，从而引起肿瘤细胞的持续增殖，并导致凋亡信号通路的 失控。研宄发现，C-KIT基因的突变会导致恶性肿瘤的发生，包括急性髓细胞白血病、胃肠 道间质瘤和睾丸癌等。
[0004] 其中胃肠道间质瘤（Gastrointestinal Stromal Tumor，GIST)是消化道最常见的 间叶组织源性肿瘤。绝大部分的GIST肿瘤细胞表达C-KIT基因编码的Kit蛋白（⑶117)， 且GIST常存在C-KIT基因突变，突变导致KIT蛋白的活化不需要配体SCF参与就能刺激 肿瘤细胞的持续增殖和抗凋亡信号的失控，从而发生肿瘤。GIST中C-KIT基因突变率约为 80-90%，突变形式多样，包括替换、缺失和插入重复等。其中位于外显子llLys550-Val560 区段的突变最为常见(约占70-80%)，外显子9 Ala502-Tyr503区段的6碱基插入重复突变 约占5-10%。
[0005] Imatinib (伊马替尼)，又称Glivec (格列卫)是小分子酪氨酸激酶抑制剂，它能选 择性地抑制KIT、BCR-ABL和TOGFR。Imatinib结合于KIT蛋白胞浆内酪氨酸激酶功能区的 ATP结合位点，阻断磷酸基团由ATP向底物酪氨酸残基的转移，从而抑制细胞增殖并恢复细 胞凋亡程序。目前，Imatinib用于治疗KIT阳性、不能手术切除和/或转移性的恶性GIST， 其临床疗效令人振奋。但并非所有GIST患者经Imatinib治疗后都能取得良好疗效，临床 研宄表明GIST中C-KIT基因的突变情况与Imatinib分子靶向治疗的疗效密切相关。存 在C-KIT外显子11突变的患者疗效最好，外显子9突变的患者疗效次之，而无基因突变的 GIST患者疗效最差。此外，对外显子9突变的患者，用药剂量由400mg/日提高到800mg/日 可提尚疗效。
[0006] 2006年另一种靶向药物苏尼替尼（Sunitinib，又称索坦Sutent)获得美国FDA批 准用于Imatinib耐药的难治性GIST患者。与Imatinib相似，Sunitinib的临床疗效与基 因突变位点有关。不同的是，它对C-KIT外显子9突变者效果最好，对外显子11突变者的 效果不理想。
[0007] 美国癌症综合网络（NCCN)《软组织肉瘤临床治疗指南》中提出，GIST患者接受靶 向药物治疗前，应先进行C-KIT基因突变检测，根据检测结果决定是否使用靶向药物作为 临床治疗措施。检测C-KIT基因突变对于指导GIST患者的合理应用分子靶向药物治疗，具 有重要的参考价值。
[0008]目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法；基因芯片杂交法； PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR-SSCP ;PCR高分辨熔解曲线分析技 术；PCR-Taqman MGB (Minor Groove Binder)探针法；AS-PCR 法；Cast-PCR 法等。这些方 法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床 普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。
[0009] 如：1)直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但该法检测 基因突变的灵敏度为20%(即目的基因的突变基因DNA模板数占野生型DNA模板数的20%)。 同时还存在操作复杂，周期长，分析速度慢，常需要2天的时间，而且该法是开管操作，大大 增加污染的可能性，不适合对大规模标本的检测，同时还需要昂贵的仪器，存在在基层不易 实施等缺点。
[0010] 2)普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP 仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力，还存在PCR产物污染导致 假阳性的风险，见[Mol Diagn Ther. 2010 Jun 1; 14(3): 163-9，United States Patent 20120135406]。
[0011] 3)芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用 于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。
[0012] 4) PCR高分辨熔解曲线分析技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂成本较低， 但因其荧光信号来自染料，特异性受到影响，而且检测仪器是升级版的荧光PCR仪，价格高 昂，普及受限，见[Clin Chim ACqa. 2012 Nov 12;413(21-22):1781-5; United States Patent 20110045479]〇
[0013] 5) PCR-Taqman MGB探针法适合已知突变位点，常常需要两条探针，而Taqman MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，见[J Clin Microbiol. 2010 Aug;48(8):2909-15;United States Patent 20090311679]，并且不能检测样本中的含量 较少（彡1，〇〇〇个中的1个）的等位基因或突变位点。
[0014] 6)PCR-SSCP法虽然简单，但该法是开放性的检测系统，容易造成PCR产物的污染， 而且操作步骤多，费时费力。
[0015] 7)等位基因特异性引物PCR扩增法（AS-PCR)，这一方法是目前检测基因突变或 SNP最简单快速的方法（Wu D Y, Ugozzoli L, Pal B K, Wallace R B.，Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:2757-2760)，其原理是引物3'末端碱基与模板的碱基错配，其PCR的 效率将会下降 1〇3-1〇6.6倍（Chen, X.，and Sullivan, P F, The Pharmacogeonomics Journal 2003，3，77-96)。尽管该方法的原理简单，但错配的引物，依然会发生非特异 性扩增，扩增情况视突变的类型和检测位点周围的碱基序列相关（Ayyadevara S, Thaden J J, Shmookler Reis R J., Anal Biochem 2000; 284:11-18)，还与样本中存在的等位 基因变量的影响。为了增加AS-PCR的特异性，许多科学家做了很多努力。大量的实验证 明，该方法最关键的是设计与3'末端突变位点碱基互补或错配的两条特异引物，引物设 计不好，将导致高背景的交叉扩增，会导致较高的假阳性。尽管不少人努力将这一弊端克 月艮，如报道的TaqMAMA方法，在3'倒数第二位或第三位上引入突变碱基，的确可以增加 反应的特异性，但仍然无法完全消除假阳性，而且在纯合子与杂合子的判断上，缺乏标准， 会出现混乱的情况，见[J Virol Methods. 2008 Nov;153(2):156-62;Genomics. 2004 Feb;83 (2) :311-20]。简单的AS-PCR，通常采用PCR反应结束后再进行电泳，从有无反应条 带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的仪器，但电泳操作，增加了 PCR的污染机会，而 且耗时费力。尽管有人对该方法作了改进，采用荧光定量PCR技术，但得到的不是"全或无" 式的结果，总会有非特异性反应的发生，即同样的引物对野生型和突变型位点都会扩增，只 是其得到的Ct (Cycle threshold)不同而已，因此就引入了 ACt的概念，即ACt=野生 Ct-突变Ct，但计算复杂，如要A Ct值大于纯合子Ct值判为突变型纯合子，A Ct值小于杂 合子Ct值，判为杂合子，ACt值的引入不仅增加了操作步骤，还会引起混乱，因为ACt值 的设定标准无法准确定位，不同的标本和不同的检测仪器都会有不同的数字，给临床应用 带来很大的困难，实际应用依然受限，见[中国专利CN101235415, CN101565742A]。
[0016] 8)美国LIFE公司采用一种MGB封闭探针的方法，称作Cast-PCR ( Competitive allele specific Taqman PCR)，用MGB探针将不检测的位点封闭，然后用等位基因特异 引物荧光定量PCR的方法检测目的位点，这虽然提高了检测的特异性，但由于多加入一 条MGB封闭探针，势必增加成本，对反应效率多少会带来干扰，见[Exp Mol Pathol. 2012 Jun; 92 (3): 275-80; United States Patent 20100221717 ;CN102428190A]。有人采用锁 核酸（LNA) ( Plant Method 2007, 3 :2)或修