专利名称：一种通过xrcc1基因检测肺癌易感性的试剂盒的制作方法
—种通过XRCC1基因检測肺痛易感性的试剂盒技聿领域本发明涉及一种疾病易感性检拥用的试剂盒，尤其是一神检拥肺痛晷j^性的试拥盒，m^检翻xit^交襟互补修复基因l (X-ray repair crote-<compleinentinggeneI, XRCC1)的单被苷餿多态性(SNP)位点 来瓖澜个体对肺痛的易感性。背康技术原发性支气管肺痛，,肺痛，为当前世界各地最常见的恶性肿瘤之一，是一种严重M人类健康和生4r的疾病，肿痛细胞源于支气蟹粘鹏或腺体，常有区域性淋巴结和血行转移，早期常有刺 & 嗽、澳 中审血等呼吸道症状，病情进展速度与细鬼的生物特性有关。半个世纪以来，世界各闺胂痛的发病率和病死率都有明显塌高的趋势，世界卫生组戟WHO)2Q00年报 告1997年全世界死于恶性肿痛的共706.5万人，占死亡人数的12.6%,其中肺癌占恶性肿痛死亡的19 %， ^Btt肿痛死因的第一位，我国1990 1992年的抽样调査显示，在城市人口的肿痛死亡中，肺癌由 原来的第4位上升为第1位，农村上升最快的也是肺痛.云南银矿的肺痛发病率在1954 1959年间为 28.02/10万，1960 1969年间为197.87/10万，1970~1979年间上升到219.10/10万，这在全世界也是罕见 的，.英理著名肿瘤学家ItPeto预言如果我国不及时控制吸烟和空气污染，到2025年我頃每年脚痛将超 过柳万，成为世界第一肺癌大国，病因和发病机制迄今尚未明确，一致认为肺痛的发病与下列因素有关(D"gys (包括主动吸 被动吸知)②职业致痛因子，已被确认的致人类肺痛的职业因素包括石棉、无机9Nfc合物、二氣甲鹏、铬及 其化合物、锞、氡、芥子气、氣乙烯、煤烟、焦油和石油中的多环芳烃、烟草的加热产物等③空气污染 (包括室内小环境和室外大环境污染)；④电离辐射⑤饮食与营养，美国纽约和芝加哥开展的簾膽性人群瑰条的结果说明，食物中天然维生素A类、e胡萝卜素的摄入量与十几年后痛症的发生呈负相关，其中最夷出的是肺痛⑥其他，美国痛症学会将结核列为肺痛的发病因素之一。有结核病者患肺癌的危险性是 正常人群的10倍。其主要组织学类型是腺痛.此外，病毒感染、真菌毒素(黄曲雾)、机体免疫功能低下、 内分泌失调以及家族遗传等因素，对肺痛的发生可能也起一定的综合作用。近年研究表明，肺癌的发生与某些痛基因的活化及抑癌基因的失活密切相关。已经证明的几个痛基因 家族包括引起突变的ras族、放大基因的myc族、C《B2、机制不明的bcl-2、 Kit及由野生型变异的抗癌 基因p53、 p16和RB等。大量研究表明C-myc、 L-myc、 N-myc和RAF在小细敏肺痛中i&W过虔表达。 非小细胞肺痛中则常可见ras族基因的过度表达。这些深入的研究将为基因预防和治疗肺痛班供理论基础。XRCC1位于第19号染色体1913.2-13.3位置，全长32,3kb, mRNA全长2087bp,共有17个外显子， 编码634个氨基酸的蛋白。XRCC1编码的蛋白对因电离辐射和烷基化物引起的0NA单链断裂能起到有效 的i^复作用。XRCCl编码的蛋白与DNA连接,in、聚合酶P、多聚ADP核糖转移籌交互作用，参与DNA 的鹏切除修复(Base Excision R印air， BER)通路。众多研究显示，XRCC1基因上部分位点的多态性， 与,发生有密切的关系。与XRCC1相关的痛症主要有乳腺痛、头颈部鳞状细胞痛、食管痛、胄痛、 结鹏、胰腺癌、肺痛等。SNP(single nucleotide polymorphi柳〉，即单核苷酸多态性标记，是一类基于单械基变异引毎的DNA 多态牲，被逮传学界称为第三代遗传标记。主要是指由基因组核苷酸水平上的变异弓l起的DNA序列多态性， 包^IMiyS转换、頫换，以及单碱基的插入/缺失等。它是基因组中条为广泛存在的一类多态性标记，占 大约90%,这些基因组序列变异可以导致个体间表型的差异以及不同个体对疾病，特别是复杂疾病的易感 性、和对环境因素、药物反应的差异。w25487是位于第19号染色体XRCC1基因上的一个G/A多态，引起XRCC1基因 {9的蛋白第399 个M酸由A堪变为Gln。 Aig399GIn位于第10号外显子，XRCC1蛋白BCRTI区域.在世界人群中的该 多态的頻率分布，G占0.72， A占0,28左右。中国人群中的分布G为O.幼，A为0.32。分子生物，究表 明，XRCC1基因上第399号豕基酸A屯"Gln的替代加强XRCC1蛋白与DNA-致痛物加合物的结合能力， 从面彩响个体的肿痛易感性。通过大ft对于大规模人群的肺癌病例对照研究，XRCC1的399氨基酸突变 位点在傲单因素分析时与肺痛发生相关，但是分层分析后发现在大童吸烟的人群中，肺痛发病风险降低， ra25487位点携带A型即为肺痛易感型..发明内容基于XRCC1基因上的is25487号SNP位点可用来评估个体对肺痛的易感性的基础上，本发明提供一 种植測胂痛易感性的试剂盒。该试剂盒包括检測XRCC1基因SEQ ID NO: 1中第156位SNP的特异性引物对及特异性荧光探针、 T叫,、dNTP混合液、MgCl,溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对SEQ ID NO: 1中第156位SNP位点而设计，麟异性扩增 出SEQ ID NO: 1中包含第156位SNP位点的DNA片段的引物对，设计这类引物对是本领域技术人员能壤 轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 2和3所示序列的引物对。特异性引物对可用常规 的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这两对引物.本试剂盒中所述的特异性荧光探针是指针对SEQ ID NO: 1中第156位SNP位点而设计，能通过荧光 定悬PCR技术特异性检测出这个SNP位点肺痛易感基因型的探针。设计这类探针是本领域技术人员能够轻 易完成的，优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 4所示序列的T叫man探针。特异性荧光探针可用常规 的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光探针不限于这条探针，所有可用 f荧光定1: PCR检測SEQ ID NO: 1中第156位SNP位点的探针均在本发明范围内。本发明试剂盒的组分和含董包括10 X荧光定楚PCR反应缓冲液， O.lfil 25nM dNTP混合液， 0.6|il 25nM MgCl,溶液， 0.025(il (5units/|U) T叫咖A聚合酶， 幼HM特异性引物对(两条)各0.225!11. 10nM特异性荧光探针0.25ji1, 去离子水5. 575|U。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20iC。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件，实簾例l.检測试剂盒的使用 步 1: DNA模板的抽取 用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组咖A。 步，2:荧光定1;PCR反应使用可检拥肺癌易感性的荧光定JtPCR检測试剂盒，其中，含有下列引物对和荧光探针 有义引物5， - TAACTGGCATCTTCACTTCT -3'(SEQ ID NO: 2)加值为56卩 反义引物5' - TCCAGATTCCTGGCATTGC -3' (SEQ ID NO: 3) Tn值为581C 荧光探针5' - CGGCTGCCCTCCCAGAGG -3' (SEQ ID NO: 4) Tta值为641C荧光定i PCR反应体系为总体积10 il，包含浓度为20ng/jil的DNA模板2ji1、 10 X荧光定量PCR 反应级冲液、0. 25aM cfl4TP泡合液、0.6^1 25nM l^Cl, JfiFfK、 0. 025fil (5units/(il) T叫IMA'聚合,、 20HM的有义引物和反义引物各0.225ni、 10|Ui的荧光探针0.25jU，去离子水5* 575jil。在ABI9700型PCR扩増仪上进行反应，反应条件为501C、 2分钟，诉1C、 10分钟，进行抑个循环的 诉1C、 30秒，601C、 l分钟。反应结束后在旭I7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。 步驟3: SNP基因型分析将荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量和正常对照相对比，荧光探针^的荧光倌号明显离于正 常对照，说明被检測DNA的XRCC1基因上ra25487号SNP位点基因型携带有A型，为肺痛易鹏，实旌例2.指导人们主动，肿痛的服务目前在上海主链生物工程有限公司已经开展了这项服务。 步，l: DNA提取对被检9H者进行股务前咨询，由被检測者签署知情同意书，填写生活饮食习愤问巻调査表，依照取样盒中的指示使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅am附法进行口腔上飾通的咖A抽提.步骤2:基因分型检新使用本发明提供的试剂盒,对被检測者DNA的XRCC1基因上的rs25487号SNP位点进行荧光定量PCR 检翻，确定该SNP位点的基因型。步骤3:指导人们主动预防肺痛通过对被检涠者SNP基因型的分析，出具基因分型检測报吿和被检測者个体化ttiK掛导报吿，基因检 渊挺吿详细说明了被检渊者肺癌易感程度的布低以及患病的概率大小。个体化tt康賴导报告以lfett翻者的 基困分型检測结果为基础，结合其生活饮食习惯问巻调査结果，评估被检測者Mi痛逮传易感的相对风险， 同时制定出针对于被检渊者的个性化健康行动方案，方案包括在饮食习惯、生活方式上的改进建议等，并 为被检測者普及预防肺癌的健康知识。
序列表<110>上海主健生物工程有限公司<1加> 一种通过XRCC1基因检測肺痛易感性的试剂盒〈160> 4<210> <211> <212> <213>1300 咖A 人属,<柳> 1agatcacaccccccaagtacggactgtcacctgctccttagc卿cggag人种(Homo sapiens, human)taactggcat cttcacttct gccccccacc agctgtgcct ttgcc幼cac 60agccaggtcc t鄉cctggg aggccgcatc gtgcgta鄉agtgggtgct 120cgcatgcgtc ggcggctgcc ctcccggagg taaggcctca cacgccaacc 180tcctgtgctg ggcaatgcca gg幼tctgga ggggagtcag actggggcct 240幼cacaggtg gtcccagccc agagccagca gactactgag鄉agcgggg 300<210> <211> <212> <213>2加 DNA人工序列<220><223>引物 <柳> 2taact鹏at cttcacttct 20<210> <211> <212> <213>319DNA人工序列<220> <223>引物<柳> 3tocagattcc tggcattgc 19 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列<2加><223>探针 <柳> 4cggctgccct cccag鄉 18
权利要求
1.一种用于检测肺癌易感性的试剂盒，其特征在于包括检测XRCC1基因SEQ ID NO1中第156位SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对SEQIDNO: 1中第156 位SNP位点而设计，麟异性扩増出包含SEQ ID NO: 1中第156位SNP位点的DNA片段的引物对。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性荧光探针是指针对SEQ IDNO, 1中第 156位SNP位点而设计，能通过荧光定爱PCR技术特异性检測出该SNP位点肺痛易感基因型的探针。
4. 根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性引物对选自具有SEQIDNO: 2和3所 示序列的引物对，
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所含的特异性荧光探针选自.具有SEQ IDN(h 4所示 序列的Taqman探针。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括IOX荧光定量FCR反 应缓冲液，0. l(il 25nM dNTP泡合液，0.6fil 25oM MgCl,溶液，0.025ril (5units/ il) T叫DNA豳合糖， 20一特异性引物对(两条〉各0.225(il， 10jiM特异性荧光探针0.25ji1,去离子水5.575jxl。本试剂盒供 —人份检拥应用，试剂盒的保存温度为-201C.
全文摘要
本发明公开了一种用于检测肺癌易感性的试剂盒。该试剂盒包括检测XRCC1基因SEQ ID NO1中第156位SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过检测分析个体的XRCC1基因上SNP位点基因携带型来预测个体对肺癌的易感性。
文档编号C12Q1/68GK101130811SQ20061003038
公开日2008年2月27日 申请日期2006年8月25日 优先权日2006年8月25日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司