专利名称：用于检测冠心病易感性的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测疾病易感性的试剂盒，尤其是一种检裙潘心病M性的试剂盒，壤过检m敢麻酯瓣l基因(paraoxonase 1, P0N1)的单核苷酸多态性位点来预測个^Mt冠^H)i的易感性。背录技术冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease)指冠状劝胜粥^9Hb使血管 腔狭窄或阻塞，或沐)因冠状动脉功能性改变(痉牵)导致心肌缺血缺舰坏顿弓l起的心脏病，统称靴 动脉性心脏病(coronary heart disease),简称冠心病(CHD),亦称缺血性心脏病(isch棚ic heart disease)。冠状动脉粥样硬化性心脏病是动脉粥样硬化导致器官病变的最常见类型，也是严重危害人民健康, 见病。本病多发生在40岁以后，男性多于女性，发达国家常见，美国约有700万人患本病，毎年约50余 万人死于本病，占人口死亡数的l/3 l/2，占心脏病死亡数的50 75%。在我国，近年来虽增长趋势， 加世纪70年代北京、上海、广州本病的人口死亡率分别为21.7/10万人口、 15.7/10万人口和4.1/10万 人口 ；恥年代我国城市男性本病死亡率为49.2/10万人口 ，女性为32.2/10万人口 。冠心病的发病随年龄的增长而增商，程度也随年齡的增长而加重，有资料表明，自40岁开始，每坩 加10岁，冠心病的患病率增l倍。男性50岁，女性60岁以后，冠状动脉硬化发展比较迅速，同样心肌 梗塞的危险也随着年齡的增长而增长。年轻的男性患者比年轻的女性患者多，但绝经后的女性以及年过六 十的妇女，其危险就几乎与男性相等了，甚至大于男性。老年人心脏病发作的可能性较商，其发病机理是复杂的，综合性的较长过程.可归纳为四个步骤1.心血管内皮敏胞损害，平滑肌细 胞增生。2.血小板粘附于受損的血管壁后，释放出血淸素，血栓素A2、血小板IV、 Vl因子等。3.低密度 脂蛋白由受损的内皮细胞渗入内膜下的平滑肌细胞，并被吞噬，进入细胞后被细胞内裕瞎体的水解瞎分解 而释放出游离胆固醉，后者与亚油酸结合，成为重要发病环节，4.在上述病理变化基础上，最终发生冠 状动脉纤维化、钙化.冠心病是一种有遗传因素和环境因素相互作用而发病的多基因病，寻找冠心病相关基因进而鰣明冠心 病发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。P0N1为paraoxonase 1 (对氣麻脂,l)编码基因，血淸中的对氣磷ISW 1可以作为抗敏化剂，对低 密度脂蛋白LPL等生物大分子进行水解并降低瓶化水平.从而&低血管内的氧化势，起到对血管的保护作 用，基因发生缺陷后，导自低密度脂蛋白LPL等生物大分子进行水解并IBMK氣化水平下降，造成对血管 蜜的损伤，带来心脑血管的疾病。SNP(singlenucl的tide polymorphism),即单核苷酸多态性标记，是一类基于单 变异引起的加A 多态性，被遗传学界称为第三代通传标记。主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性， 包括单碱基转换、頮换，以及单碱基的插入/缺失等，它是基因组中最为广泛存在的一类多态性标记，占 大约90%.这些基因组序列变异可以导致个体间表型的差异以及不同个体对疾病，特别是复杂疾病的易感 性、和对环境因素、药物反应的差异。研究表明，P0Nl基因上的rs662号SNP位点(SEQ1DNO: 1所示 序列中146位)的多态性(A/G)会弓l起基因编码蛋白的第192个氨基酸由Gln变为Arg,而冠心病患者带 有Arg的频率明显高于正常人群，P0N1基因的Glnl92Arg多态性与冠心病严重性、冠状动脉粥样硬化进展 程度、血脂水平和降血脂药物治疗效果相关。国内外的大量的关联分析表明，PONl基因的Gln多态(SNP 位点基因型为A)能够降低冠心病的易感性、延缓冠状动脉粥样硬化进展程度*该SNPs位点的多态性可 用于评估个体对冠心病的易感性，目前已通过中国科学院国家生物基因检測技术应用评估认证中心的认 证，
发明内容
基于P0N1基因上的rs662号SNP位点可用来评估个体对冠心病怖易感性的基础上，本发明提供一种 用于检渊冠心病易感性的试剂盒，该试剂盒包括检測P0N1基因SEQ ID NO: 1中第146位SNP的特异性引物对及特异性荧光探针、Tag 酶、dNTP混合液、MgCh溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对SEQ ID NO: 1中第1站位SNP位点而设计，能特异性扩增 出SEQ ID NO: 1中包含第146位SNP位点的DM片段的引物对，设计这类弓嫩对是本领域技术人员US^ 轻易完成的，优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 2和3所示序列的引物对，特异性引物对可用常规 的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这两对引物，本试剂盒中所述的特异性荧光探针是指针对SEQ ID NO: 1中第146位SNP位点而设计，能通过荧光 定量PCR技术特异性检糖出该SNP位点冠心病易感基因型的探针。设计这类,是本领域技术人员能够轻 易完成的。优选地，试剂盒中包含具有S印ID NO: 4所示序列的T叫nan探针，特异性荧光探针可用常规 的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光探针不限于这条探针，所有可用 于荧光定量PCR检獮SEQ ID NO: 1中第146位SNP位点的探针均在本发明范围内。本发明试剂盒的组分和含量包括 ljil 10 X荧光定量PCR反应缓冲液， 0. l(il 25mM dNTP混合液， 0.6pl 25mM MgCl，溶液， 0.025)il (5units/)il) T叫DNA聚合酶， 20(iM特异性引物对(两条)各0.225jil， 10nM特异性荧光探针0.25(i1, 去离子水5. 575jil。本试剂盒供一人份检拥应用，试剂盒的保存温度为-201C。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条自实敏方法，通紫按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。实施例l.检測试剂盒的使用 步籌l: DNA模板的抽取 用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组咖A。 步，2:荧光定量PCR反应使用可检測冠心病易感性的荧光定1:PCR检拥试剂盒，其中，含有下列弓l物对和荧光探针有义引物5' - GGACCTCAGCACTTTTATC -3' (SEQ Iti NO: 2) T鹏值为561C反义引物5' — TTGGACTATAGTAGACAACA -3' (SEQ ID NO: 3) Tm值为541C荧光探针5' - CGATCCTGGGAGATCTATTTGG-3' (SEQ ID NO: 4) Tn值为641C荧光定量PCR反应体系为总体积lOjil,包含浓度为20ng/nl的DNA模板2fi1、 lpl 10 X荧光定S PCR 皮应缓冲液、0.1^1 25mM dNTP泡合液、0. 6(il 25mM MgCl,溶液、0. 025|U (5units/|il) T叫DNA聚合,、 加fiM的有义引物和反义引物各0.225nl、 IOjiM的荧光探针0. 25nl,去离子水5.575jil。在旭I9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为501C、 2分钟，诉1C、 IO分钟，进行抑个循环的 95"、 30秒，601C、 l分钟。反应结束后在旭I7恥0型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，步澳3: SNP基因型分析
将荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光豕和正常对照相对比，荧光探针最终的爽光信号与正常对照 相差不多，说明被检渊DNA的P0N1基因上的rs662号SNP位点基因型携带为A型，非冠心病易感型，实施例2.指导人们主动预防冠心病的股务目前在上海主健生物工程有限公司己经开展了这项服务。 步骒l: DNA提取对被检涠者进行服务前咨询，由被检測者签豕知情同塞书，填写生活饮食习慎询眷调査表，依照％# 盒中的指示使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细趣的DNA抽提.步紫2:基因分型检測使用本发明提供的试剂盒，对被检涠者DNA的P0N1基因上的rs662号SNP位点进行荧光定量PCR检 測，确定该SNP位点的基因型。步骤3:指导人们主动预防冠'll祸通过对被检測者SNP基因型的分折，出具基因分型检測报告和被检鑭者个体化健康指导报吿，基BI^ 翻报吿详细说明了被检測者冠心病易感程度的髙低以及患病的概率大小。个^ttt康接导报吿以被检JWt 的基因分型检測结果为基础，结合其生活饮食习惯问巻调査结果，评估被检1 #冠心病通传易 的相对风 险。同时制定出针对于被检渊者的个性化健康行动方案，方案包括在饮食习惯、生活方式上的改进建议等， 并为被检測者普及预防冠心病的健康知识。
序列表<110>上海主健生物工程有限公司<120>用于检測冠心病易感性的试剂盒<160> 4<210> <211> <212> <213〉1300 DNA 人厲,人种(Hono sapiens, human)<400> 1cC8gtt幼ta蹄ttgcagttcactattttctatgUgtct幼tggaatcaatcctgt幼t gttc祖tacc ttcaccttat Btattatgtg tgtatgtttt 60tg幼tgatat tgttgctgtg ggacctgagc acttttatgg cacaaatgat 120ttgaccccta cttac幼tcc tgggagatgt atttgggttt agcgtggtcg l抑actatagtcc助gtgaagtt cgagtggtgg cagaag辟U tgattttgct 240acatttcacc cgatggc幼g tatgt卿ct ctctgaaatg tagt鹏ttt 300<210〉 <211> <212> <213>219脆人工序列<220> <223>引物<柳〉219<210> <211> <212> <213>3加 腿人工序列<咖> <223>引物<柳> 320<210〉 4 <211> 22 <212>醒 <213>人工序列<220><223>探针 <400> 权利要求
1.一种用于检测冠心病易感性的试剂盒，其特征在于包括检测PON1基因SEQ ID NO1中第146位SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性弓I物对是播针对咖IDNO: 1中第H6 位SNP位点而设计，能特异性扩增出包含SEQ ID NO: 1中第146位SNP位点的DNA片段的引物对.
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性荧光探针是指针对SEQ IDN0: 1中第 146位SNP位点而设计，能通过荧光定至PCR技术特异性检拥出该SNP位点冠心病易感基因型的探针，
4. 根据权利耍求l所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性弓I物对选自具有SEQIDNO: 2和3所示序列的引物对。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性荧光探针选自具有SEQ IDN0: 4所示 序列的T叫man探针。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括l(il IOX荧光定麓PCR反 应缓冲液，O.l(il 25mM dNTP稱合液，0.6)il 25mH MgCl,溶液，0.025fil (5units/(il) T叫DNA衆合,， 幼一特异性引物对(两条)各0.225jd， 10nM特异性荧光探针0.25fi1，去离子水5.575p1,本试剂錄 —人份检瀕应用，试剂盒的保^m度为-20TC。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测冠心病易感性的试剂盒。该试剂盒包括检测PON1基因SEQ ID NO1中第146位SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过检测分析个体的PON1基因上SNP位点基因携带型来预测个体对冠心病的易感性。
文档编号C12Q1/68GK101131358SQ20061003038
公开日2008年2月27日 申请日期2006年8月25日 优先权日2006年8月25日
发明者冯哲民, 屹 楼, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司