一种肺癌诊断生物试剂、制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种肺癌诊断生物试剂，为一种肺癌特异性靶向细菌经多聚甲醛固定形成，所述的肺癌特异性靶向细菌表面展示有序列为SEQIDNo.1的多肽，所述的肺癌特异性靶向细菌可表达GFP蛋白，所述的肺癌特异性靶向细菌为一细菌本体中转入一表达载体，所述的表达载体中含有特异性靶向多肽基因和GFP基因，所述的表达载体可表达特异性靶向多肽和GFP蛋白，所述的特异性靶向多肽的序列为SEQIDNo.1。本发明还提供了所述肺癌诊断生物试剂的制备方法及其在肺癌诊断试剂盒中的应用。
【专利说明】一种肺癌诊断生物试剂、制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物、医药领域，具体涉及一种诊断肺癌的生物试剂及其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]肺癌是世界范围内最常见、致死人数最多的恶性肿瘤之一，其发病增长速度高居各恶性肿瘤之首。由于肺癌起病隐匿，目前仍缺乏有效的筛查和早期诊断方法，患者出现症状时多为晚期，预后较差。在早期诊断的肺癌患者中，手术治疗的预后较中晚期肺癌明显改善，生存率可达70%。临床上传统的诊断方法如胸片、支气管镜、痰细胞学检查等方法，缺乏足够的特异性和敏感性，大多数肺癌患者确诊时已为晚期，因此，提高肺癌早期诊断的精确性成为肺癌研究和治疗的首要目标。
[0003]近年来,在肺癌的辅助诊断方面,肿瘤标志物(tumor marker, TM)的研究十分活跃。肿瘤标志物是指在肿瘤发生和繁殖过程中，由肿瘤细胞所产生或分泌并释放到血液、细胞、体液中，反映肿瘤存在和生长的一类物质。检测、筛选及鉴定肿瘤标志物是肺癌早期诊断研究的重点。目前，比较有代表意义的肺癌肿瘤标志物主要为糖蛋白类抗原、角蛋白类抗原、酶类抗原、胚胎抗原等，这些有代表性的肿瘤标志物存在特异性不高的缺点。
[0004]在肺癌早期诊断方面有很多分子标记的应用，如量子点、近红外发光材料、上转换发光材料、磁性纳米颗粒等用于肿瘤的诊断检测。上述的具有成像功能的材料要实现诊断的目的，都需要在成像材 料上连接具有诊断价值的靶向分子，从而将特异性结合与发光成像联合起来实现诊断的目的。但上述成像材料体系的构建过程繁琐，成本昂贵，不适于规模化生产。
[0005]近些年出现的分子靶向技术为癌症诊断和治疗的精准性的提高带来了希望。常用的靶向分子有抗体、小分子核酸适配体及多肽等。其中，多肽小分子可通过近年来出现的表面展示技术实现。表面展示技术是利用基因工程手段实现外源多肽(或蛋白质结构域)以融合蛋白形式在微生物表面进行展示的新型基因工程技术，被展示的多肽或蛋白质结构域可以保持相对独立的空间结构和生物活性。细菌表面展示技术结合流式细胞分选技术以快速、高通量的特点为展示【技术领域】中应用的热点，在本实验室的前期研究中发现了一种肺癌细胞特异性靶向多肽(序列为SEQ ID N0.1)，含有13个氨基酸，具有分子量小、免疫反应弱、易穿透细胞膜等特点(CN201110340669.1)。如何利用上述特异性靶向多肽进行肺癌的早期检测成为亟待解决的问题。
【发明内容】
[0006]本发明旨在解决上述现有技术中存在的问题，提出一种肺癌诊断生物试剂，为一种肺癌特异性靶向细菌经多聚甲醛固定形成，所述的肺癌特异性靶向细菌表面展示有序列为SEQ ID N0.1的多肽，所述的肺癌特异性靶向细菌可表达绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein, GFP)。[0007]优选地，所述的肺癌特异性靶向细菌为一细菌本体中转入一表达载体，所述的表达载体中包括特异性靶向多肽基因和GFP基因，所述的表达载体可表达特异性靶向多肽和GFP蛋白，所述的特异性靶向多肽的序列为SEQ ID N0.1。
[0008]优选地，所述的特异性靶向多肽的C端连接于特殊外膜蛋白的N端，所述特殊外膜蛋白的N端位于细胞外，所述特殊外膜蛋白由外膜蛋白经改造。
[0009]优选地,所述的表达载体还包括阿拉伯糖araBAD万.co7i操纵子启动子。
[0010]优选地，所述的表达载体为PBAD33质粒。
[0011]优选地，所述的特异性靶向多肽基因和GFP基因位于pBAD33质粒的多克隆位点，所述的特异性靶向多肽基因位于GFP基因的下游。
[0012]优选地,所述的细菌本体选自coli，Shigella sonnei, Shigelladysenteriae, Shingella flexneri，Salmonella typhimurium, Salmonella enterica，Enterobacter aerogenes，Serratia marcescens，Yersinia pest is,或者 Klebsiellapneumoniae ^
[0013]优选地，所述的多聚甲醛的浓度为4%。
[0014]本发明还提供了一种所述肺癌诊断生物试剂的制备方法，包括以下步骤:
a、扩增OmpX基因，得到OmpX基因片段；
b、由OmpX基因片段制备CPX基因改造片段；
C、改造CPX基因；
d、将GFP基因、步骤c中得到的包含特异性靶向多肽基因的CPX改造基因转入pBAD33质粒中，得到PB33CPX-GFP质粒；
e、将步骤d中得到的pB33CPX-GFP质粒转化到大肠杆菌1061菌株，转化成功的MC1061即为肺癌特异性靶向细菌；
f、将肺癌特异性靶向细菌用多聚甲醛进行固定。
[0015]本发明另外提供了一种肺癌检测试剂盒，含有所述的肺癌诊断生物试剂。
[0016]本发明的有益效果在于，本发明的肺癌诊断生物试剂能够实现特异性靶向功能和荧光成像功能；本发明的肺癌诊断生物试剂经多聚甲醛固定后能长时间保存，并且提高了应用的安全性。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是OmpX蛋白结构示意图。
[0018]图2是CPX蛋白改造不意图。
[0019]图3是pBAD33质粒的结构图。
[0020]图4是实施例1制备的肺癌诊断生物试剂与细胞的特异性结合实验结果图。
[0021]图5是实施例1制备的肺癌诊断生物试剂的保存实验结果图。
[0022]图6是实 施例1制备的肺癌诊断生物试剂与肿瘤组织特异性结合的实验结果图。
【具体实施方式】
[0023]为了使本领域的技术人员更好的理解本申请的技术方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。[0024]本发明的肺癌诊断生物试剂，为一种肺癌特异性靶向细菌经多聚甲醛固定形成，所述的肺癌特异性靶向细菌表面展示有序列为SEQ ID N0.1的多肽，所述的肺癌特异性靶向细菌可表达GFP蛋白。本实施例中选择大肠杆菌MC1061作为改造菌株，还可选用大肠杆菌 KS476、JM109、BL21、DH5、YA21 或 YK537，以及其他种类的细菌，Escherichiacoli, Shigella sonnei，Shigella dysenteriae, Shingella flexneri，Salmonellatyphimurium, Salmonella enterica, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens,Yersinia pes tis,或考 Klebsiella pneumoniae。
[0025]本实施例中，肺癌特异性靶向细菌为大肠杆菌MC1061菌株转入同时含有GFP基因和特异性靶向多肽基因的质粒，特异性靶向多肽的C端连接于特殊外膜蛋白的N端，所述特殊外膜蛋白的N端位于细胞外，所述特殊外膜蛋白由外膜蛋白改造而成，外膜蛋白可选自OpmA或OpmX等,对外膜蛋白位于胞外的部分进行改造,如OpmA胞外的第一环、OpmX胞外的第二环或第三环。本实施例中外膜蛋白选择OpmX，特异性靶向蛋白基因为在CPX(circularly permuted variants of OpmX, OpmX的循环排列突变体)基因中插入序列为SEQ ID N0.2的基因，使SEQ ID N0.2基因编码的蛋白，即序列为SEQ ID N0.1的多肽表达于CPX位于胞外的NH2端。在大肠杆菌MC1061菌株表面展示有能与肺癌A549特异性结合的靶向多肽，同时可表达GFP蛋白，可进行荧光成像，为一种既有靶向功能又有荧光成像功能的多功能菌株，可望应用于特异性的肺癌细胞研究、临床诊断的多功能适时成像和载药靶向治疗等。
[0026]为了保存和 使用方便，将上述的肺癌特异性靶向细菌用多聚甲醛进行固定，多聚甲醛的浓度优选为4%。
[0027]大肠杆菌外膜蛋白X (outer membrane protein X, OmpX)是一种高表达的蛋白，分子量较小(约为16.3KDa)，单体，β桶状结构，结构如图1所示，OmpX有4个细胞外环，分别为L1-L4，L2和L3形成一个半刚性的β片层突起，该突起位于细胞表面，成为大肠杆菌进行表面展示的潜在插入位点。本实施例选择L2为插入位点，为了实现在OmpX蛋白细胞外环部分展示外源肽段或蛋白，制备了 OmpX的循环排列突变体(circularly permutedvariants of OmpX, CPX)，如图1所示，CPX为OmpX的细胞外环中的L2上的S53和S54残基之间断开，形成游离于胞外的C00H端和NH2端，将OmpX本身的C00H端和NH2端相连，如图2所示，对CPX进行改造，外源肽段或蛋白的展示位点为S54残基末端，CPX改造基因包括:0mpX的信号序列；GQSGQ酶切位点；GGQSGQ连接片段；外源展示片段(特异性靶向多肽)；0mpX原S54-F148片段；将OmpX本身的C00H端和NH2端连接起来的GGSG片段；0mpX原 A1-S53 片段。(Jeffrey J.Rice, et al.Bacterial display using circularlypermuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands.Protein Science (2006).15:825-836)
本实施例中选用的是 pBAD33 质粒(Guzman, L.et al., Tight regulation,modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBADpromoter, J.Bacteriol., 1995, 177,p4124_4130)进行改造,pBAD33 质粒结构如图 3 所不，PBAD33质粒含有阿拉伯糖araBADA.c07i操纵子启动子，将特异性靶向蛋白基因与GFP基因插入到PBAD33质粒的多克隆位点中，特异性靶向蛋白基因位于GFP基因的下游，双顺反表达盒可以在阿拉伯糖的诱导araBAD启动子时，同时表达特异性靶向蛋白基因和GFP基因。虽然本实施例中优选PBAD33质粒进行改造，但并不限于PBAD33质粒，只需满足在目标菌株中可高水平的表达外源蛋白即可。
[0028]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0029]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030]实施例1
按照如下步骤，制备肺癌诊断生物试剂:
а、OmpX基因的扩增；
OmpX的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，OmpX基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所
[0031]根据OmpX基因的核苷酸序列设计引物(SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14)以大肠杆菌1061菌株为模版进行PCR扩增。
[0032]b、CPX基因构建片段的获得；
用KpnI/Hindlll对OmpX基因和pBAD33质粒进行酶切处理，将OmpX基因转入到pBAD33质粒中，得到pB330pmX质粒，设计引物(SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16)以pB330pmX质粒进行PCR，得到的产物为后续重组PCR片段；
c、CPX基因的构建；
CPX从N端到C端的DNA序列由下列部分按顺序串联组成:
1、原OmpX信号肽序列，如SEQID N0.5所示；
2、DNA酶切位点，有选为GQSGQ,DNA序列如SEQ ID N0.6所示；
3、展示片段肽，即为靶向肺癌细胞多肽的编码序列，如SEQID N0.2所示；
4、连接片段1，有选为SEQID N0.7 ；
5、原OpmX蛋白S54-F148所对应的DNA序列，如SEQID N0.8所示；
б、连接片段2，有选为SEQID N0.9或SEQ ID N0.10 ；
7、原OpmX蛋白A1-S53所对应的DNA序列，如SEQID N0.11所示；
8、终止密码子序列，如SEQID N0.12所示。
[0033]按照上述的顺序用重组PCR分别将8个DNA片段连接起来，构建CPX基因。
[0034]d、将GFP基因、步骤c中得到的包含特异性靶向多肽基因的CPX改造基因转入PBAD33质粒中，得到pB33CPX-GFP质粒；
e、将步骤d中得到的pB33CPX-GFP质粒转化到大肠杆菌1061菌株，转化成功的MC1061即为肺癌特异性靶向细菌；
f、将肺癌特异性靶向细菌用多聚甲醛进行固定。
[0035]将挑选出的肺癌特异性靶向细菌过夜培养，取100 μ L菌液于新鲜LB培养基中，37°C下扩大培养2小时， 用0.02% (m/v) arabinose室温诱导I小时；
取诱导后的细菌，5000rpm, 5min离心，弃上清液体，将沉淀用4%多聚甲醛重悬，室温下固定45min ；
将固定后的细菌再次离心，弃上清液体，沉淀用PBS溶液清洗3遍。再用PBS重悬沉淀，避光保存于4°C。
[0036]对比例I
按照实施例1中的方法进行肺癌特异性靶向细菌筛选，区别在于不对肺癌特异性靶向细菌进行固定。
[0037]对比例2
按照实施例1中的方法构建细菌，区别在于CPX基因仅表达骨架蛋白不表达靶向多肽，筛选后用4%多聚甲醛进行固定。
[0038]肺癌诊断生物试剂即固定后的肺癌特异性靶向细菌结合实验
分别消化HLF细胞、A549细胞、H460细胞、MCF-7细胞、!fep-2细胞、!fepG-2细胞、HeLa细胞，并进行计数，用PBS溶液重悬；
肺癌诊断生物试剂中被固定的肺癌特异性靶向细菌(实施例1)和各种细胞比例均为500:1，按照上述比例将所述的细菌和不同的细胞进行混合，4°C下孵育45min ；
将对比例I中的肺癌特异性靶向细菌(未经固定的活菌)和各种细胞比例均为500:1，按照上述比例将所述的细菌和不同的细胞进行混合，4°C下孵育45min ；
对于上述两组孵育后于5000rpm下离心5min，弃上清液体，将沉淀用PBS溶液清洗3遍，将沉淀用PBS溶液重悬，用流式细胞仪进行分析；
将上述步骤重复3次，根据统计数据作图，结果如图4所示。
[0039]结果显示，实施例1制备的肺癌诊断生物试剂与肺癌A549细胞的结合率远远高于其他细胞(图4a)，本实施例的肺癌诊断生物试剂与肺癌A549细胞能够特异性的结合。实施例I的肺癌诊断生物试剂与对比例I (图4b)的肺癌特异性靶向细菌活菌对肺癌A549细胞均能够特异性的结合，且结合能力相当，经多聚甲醛固定后形成的肺癌诊断生物试剂仍然保持了与肺癌A549细胞特异性结合的能力。
[0040]肺癌诊断牛物试剂保存实齡
在肺癌诊断生物试剂中加入等量体积的PBS溶液进行重悬，于4°C环境中避光保存；
分别在第7、30天后，依次使用保存于4°C的肺癌诊断生物试剂与肺癌A549细胞共同孵育，再用流式细胞仪进行分析；
上述步骤设置了 3个平行实验组，收集3组数据分析后，结果如图5所示。
[0041]在肺癌诊断生物试剂保存30天后，其与肺癌A549细胞的结合率并没有下降，与刚制备的肺癌诊断生物试剂结合效率相同，本发明的肺癌诊断生物试剂可长期保存。
[0042]肺癌诊断生物试剂识别异种移植肿瘤组织能力的表征实验
实验中用到的异种移植肿瘤组织来源于意大利研究理事会那不勒斯肿瘤和内分泌研究所Dr.Vittorio实验室的惠赠。
[0043]小鼠皮下注射肺癌A549细胞，生成异位肿瘤，处死小鼠取肿瘤组织，以本领域常规的病理切片过程保存肿瘤切片，组织切片保存在载玻片上，用荧光显微镜观察肺癌诊断生物试剂与组织结合的情况。以正常组织作为对比。
[0044]肺癌诊断生物试剂中表达肺癌细胞特异靶向多肽的细菌为阳性菌，以仅表达骨架蛋白不表达靶向多肽的CPX细菌(对比例2)为阴性菌对比。
[0045]细菌生长、诱导、固定方法同实施例1。
[0046]本实验分为3组:
第一，将上述肺癌诊断生物试剂(固定有阳性菌)与异位肿瘤组织共同孵育后于荧光显微镜下观察；
第二，将上述肺癌诊断生物试剂(固定有阳性菌)与正常组织共同孵育后于荧光显微镜下观察；
第三，将上述阴性菌固定后与异位肿瘤组织共同孵育后于荧光显微镜下观察。
[0047]肿瘤组织切片脱蜡过程:用二甲苯处理15min ;再用二甲苯处理15mim ;用无水乙醇处理2min ;用95%乙醇处理2min ;用80%乙醇处理Imin ;最后用水冲洗；
滴加阳性和阴性菌液在载玻片上，以完全覆盖组织为准，室温下孵育45min ；
将载玻片至于PBS溶液中，使溶液完全覆盖载玻片，在摇床上轻摇去除组织表面的非特异性的结合成分，再将组织清洗3次，每次清洗时间为5min ；
荧光显微镜观察上述3组的结合情况，结果如图6所示，肺癌诊断生物试剂(固定有阳性菌)对肿瘤组织具有很好的识别能力，固定的肺癌靶向细菌对肿瘤组织有明显的结合(参见图6a和图6b)，固定的肺癌靶向细菌对正常组织没有明显的结合(参见图6c和图6d)。不表达特异性靶向多肽但表达GFP蛋白的阴性CPX细菌对肿瘤组织也没有识别作用(参见图6e和图6f)0
[0048]实施例2
实施例1中制备的肺癌诊断生物试剂在肺癌诊断试剂盒中的用途。
[0049]上述肺癌诊断生物试剂即固定后的肺癌特异性靶向细菌结合实验和肺癌诊断生物试剂识别异种移植肿瘤组织能力的表征实验结果表明肺癌诊断生物试剂对肺癌A549细胞和肿瘤组织均有很多的特异性结合能力，可用于制备肺癌诊断试剂盒。 [0050]虽然本发明参照当前的较佳实施方式进行了描述，但本领域的技术人员应能理解，上述较佳实施方式仅用来说明本发明，并非用来限定本发明的保护范围，任何在本发明的精神和原则范围之内，所做的任何修饰、等效替换、改进等，均应包含在本发明的权利保护范围之内。
【权利要求】
1.一种肺癌诊断生物试剂，为一种肺癌特异性靶向细菌经多聚甲醛固定形成，所述的肺癌特异性靶向细菌表面展示有序列为SEQ ID N0.1的多肽，所述的肺癌特异性靶向细菌可表达GFP蛋白。
2.根据权利要求1所述的肺癌诊断生物试剂，其特征在于，所述的肺癌特异性靶向细菌为一细菌本体中转入一表达载体，所述的表达载体中包括特异性靶向多肽基因和GFP基因，所述的表达载体可表达特异性靶向多肽和GFP蛋白，所述的特异性靶向多肽的序列为SEQ ID N0.1。
3.根据权利要求2所述的肺癌诊断生物试剂，其特征在于，所述的特异性靶向多肽的C端连接于特殊外膜蛋白的N端，所述特殊外膜蛋白的N端位于细胞外，所述特殊外膜蛋白由外膜蛋白经改造。
4.根据权利要求2所述的肺癌诊断生物试剂，其特征在于，所述的表达载体还包括阿拉伯糖araBAD E.coli操纵子启动子。
5.根据权利要求4所述的肺癌诊断生物试剂，其特征在于，所述的表达载体为PBAD33质粒。
6.根据权利要求5所述的肺癌诊断生物试剂，其特征在于，所述的特异性靶向多肽基因和GFP基因位于pBAD33质粒的多克隆位点，所述的特异性靶向多肽基因位于GFP基因的下游。
7.根据权利要求2所述的肺癌诊断生物试剂，其特征在于，所述的细菌本体选自Escherichia coli, Shigella sonnei，Shigella dysenteriae, Shingella flexneri,Salmonella typhimurium, Salmonella enterica， Enterobacter aerogenes, Serratiamarcescens, Yersinia pestis，或考 Klebsiella pneumoniae。
8.根据权利要求1所述的肺癌诊断生物试剂，其特征在于，所述的多聚甲醛的浓度为4% ο
9.一种所述肺癌诊断生物试剂的制备方法，包括以下步骤: a、扩增OmpX基因，得到OmpX基因片段； b、由OmpX基因片段制备CPX基因改造片段； C、改造CPX基因； d、将GFP基因、步骤c中得到的包含特异性靶向多肽基因的CPX改造基因转入pBAD33质粒中，得到PB33CPX-GFP质粒； e、将步骤d中得到的pB33CPX-GFP质粒转化到大肠杆菌1061菌株，转化成功的MC1061即为肺癌特异性靶向细菌； f、将肺癌特异性靶向细菌用多聚甲醛进行固定。
10.权利要求1所述的肺癌诊断生物试剂在肺癌诊断试剂盒中的用途。
【文档编号】C12N15/63GK103923902SQ201310009975
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月11日 优先权日:2013年1月11日
【发明者】朱毅敏, 王安欣, 董兵, 原丽华, 周旋, 濮科锋, 陈丽莎 申请人:中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所