microRNA444a或其编码基因在调节水稻耐盐性中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种microRNA444a或其编码基因在调节水稻耐盐性中的应用。本发明提供microRNA444a或其编码基因在调控植物株高中的应用；所述microRNA444a的核苷酸序列为序列表中的序列3或序列4或序列2或序列2自5’末端第49-4425位核苷酸。本发明的实验证明，本发明发现的microRNA444a，将其的编码基因导入水稻中，得到OsmicroRNA444a的超表达株系，该植株与未转入该基因的水稻相比表现出明显的耐盐性的表型，说明该microRNA与水稻耐盐性调控密切相关。
【专利说明】m i croRNA444a或其编码基因在调节水稻耐盐性中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种miCix)RNA444a或其编码基因在调节水稻耐盐性中的应用。
【背景技术】
[0002]真核细胞中存在大量的非编码RNA，~22nt的小RNA是其中一类非常重要的调控RNA,主要包括siRNA和miRNA两种类型，二者均由类似RNase III的核酸内切酶Dicer加工产生，随后进入沉默复合体抑制靶基因表达。miRNA是真核生物基因表达中的一类负调控因子，主要在转录后水平上通过介导靶基因mRNA的切割或抑制翻译以及染色体修饰来调节植物基因的表达，参与调控植物器官的形态建成、生长发育、激素分泌、信号转导以及对外界环境胁迫的应答能力等生物学过程，是一种新的基因调控模式。从2002年证实miRNA在植物中的存在以来，关于植物miRNA的研究进展异常迅速，短短几年内就己发现了 200多种。植物在进化过程中为了适应各种环境产生了复杂的适应机制，体现在分子水平上主要通过转录水平和转录后水平调控众多相关基因的表达来抵抗各种环境胁迫。如机械力、干旱、盐碱、低温等非生物胁迫在转录或转录后调控植物特定基因的表达，这些基因的表达反过来又赋予植物抗逆性。可见miRNA在生物生长发育的各个时期都扮演着重要的角色，调控许多重要的生物途径，处于基因调控网络的核心位置。
[0003]在植物中，研究发现多个抑制祀基因翻译的miRNAs (Aukerman andSakai, 2003;Gandik ota et al.，2007)。一般来说植物中抑制靶基因翻译的miRNA主要结合靶基因的3’-UTR区，有时也作用于5’-UTR区(Sunkar and Zhu, 2004) ?在拟南芥中，miR172既可以切割祀基因AP2的mRNA,也可以抑制蛋白的表达(Aukerman andSakai, 2003; Chen, 2004)，主要以抑制翻译的作用为主。miR156/157和miR854也是通过抑制翻译调节祀基因的表达(Arteaga-Vazquez et al., 2006; Gandikota et al.，2007)。切割靶基因是植物中miRNA主要调节方式，而抑制靶基因翻译是动物中主要调节方式。近年来研究发现植物中也存在抑制靶基因翻译这样的调节方式，这两种方式在很多时候共同存在。最近研究发现miRNA可介导靶基因位点和组蛋白的甲基化，进而抑制靶基因的表达。
[0004]在植物生长和发育过程中miRNAs起着重要的调节作用，包括生长发育、代谢、信号传导和植物的胁迫响应(Chen, 2004;Lauter et al., 2005;Li et al., 2005;Malloryet al.，2005;Wang et al.,2005;Chiou et al.,2006;Sunkar et al.,2006;Gandikotaet al.,2007;Jung et al.，2007;Wang et al.,2008b;Wang et al.,2009;Wu etal.，2009; Jiao et al.，2010a)。对已克隆miRNAs进化分析发现仅有一部分miRNAs且相应靶基因编码转录因子是保守的(miR156、miR172和miR399等)，而很大一部分miRNAs及靶基因是不保守的(miR444、miR396d, e 和 miR824 等)(Fahlgren et al.，2007)。2005 年朱健康课题组在研究水稻中miRNAs时,发现了一个新的miRNA (miR444a),它在单子叶植物中十分保守，比如在水稻、小麦、大麦和玉米中都发现它的存在，拟南芥中没有检测到它的表达。作者通过5’RACE和生物信息学分析方法确定miR444a调节的靶基因为0sMADS57 (Sunkar etal., 2005; Kutter et al., 2007; Lu et al.，2008)。组织表达模式显不 miR444a 在水稻的叶片、茎、根、花序和幼苗都有表达(Sunkar et al.，2005)。生物信息学分析表明miR444a与OsMADS57互补位点在OsMADS57编码区内且它们在序列上高度互补。
[0005]miRNA的正常表达是植物正常生长发育所必需的。目前，植物以拟南芥miRNA的研究最为详尽，Palatnik等(2003)发现miR319 (或称为miR-JAW)基因在野生型植株的芽顶端组织、花器官和果实中均有表达，通过对jaw-D基因进行突变研究，发现miR319能通过靶向作用于TCP转录因子基因家族成员来调控植物叶片的形态建成。miR319基因过量表达导致植物的叶片偏上生长、果实畸形、叶片边缘锯状化和开花期延迟等一系列异常的多效表型(Pleiotropic phenotype) (Palatnik et al.，2003)。而 miR164 家族能通过调节具有NAC功能域的转录因子(NAM/ATAF/CUC，NAC)基因家族中的CUP SHAPED C0TYLED0N1(⑶Cl)、⑶C2和⑶C3来实现对植物的花瓣数量以及花器官边缘细胞与顶端分生组织细胞分化的调控(Rhoades et al.，2002)。miR166 通过调节拟南芥 Homeoboxl5 蛋白(ATHB15)来调控植物的维管细胞和韧皮部细胞的发育(Kim et al.，2005)，一些miRNA还与植物细胞壁的合成及纤维的发育有关。miR172通过调控靶标AP2(APETALA2)和AP2_like基因来调节植物开花的时间和花的形态(Chen et al.，2004)。拟南芥中miR171通过对具有GRAs结构域的SCL(SCARECROE-LIKE)转录因子家族成员的调控，来控制花的发育和根系发育(Liaveet al., 2002)。
[0006]近年来，人们采用比较基因组学、构建小RNA文库(Sunkar et al.，2004)和表达序列标签(EST)分析等方法，发现miRNA可由逆境胁迫诱导产生。Lu等(2005)从毛果杨(Populustrichocarpa Toor)的木质部中克隆到22种miRNA,大部分克隆的miRNA的表达受拉伸和挤压胁迫的正调控或负调控(Lu et al.，2005)。Sunkar和Zhu(2004)构建了拟南芥幼苗的于旱、盐碱、低温、脱落酸胁迫的小RNA文库,发现大部分与胁迫相关(Sunkar etal.，2004)。
【发明内容】
[0007]本发明的一个目的是提供microRNA444a或其编码基因或表达microRNA444a的重组载体的应用。
[0008]本发明提供的microRNA444a或其编码基因或表达microRNA444a的重组载体在调控植物耐盐性中的应用；
[0009]所述micr0RNA444a的核苷酸序列为序列2自5’末端第49-4425位核苷酸或序列2或序列表中的序列3或序列4。
[0010]序列表中的序列2所示的RNA或序列2自5’末端第49-4425位核苷酸所示的RNA为序列3或序列4所示RNA的前体。
[0011]上述应用中，所述microRNA444a的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第49-4425位核苷酸。
[0012]序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第49-4425位核苷酸编码序列2所示RNA。
[0013]上述应用中，所述表达microRNA444a的重组载体为将所述microRNA444a的编码基因插入表达载体中，得到表达micr0RNA444a的载体。在本发明的实施例中，所述表达载体具体为PUN1301载体，上述表达microRNA444a的重组载体具体为将所述microRNA444a的编码基因插入PUN1301载体的BglII和SacI之间得到的载体。pUN1301载体按照实施例1的二的2中的方法制备。
[0014]上述应用中，所述调控植物耐盐性为提高植物耐盐性。
[0015]上述应用中，所述应用为将所述microRNA444a的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的耐盐性高于所述目的植物。
[0016]上述应用中，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。
[0017]本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。[0018]本发明提供的方法，为将micr0RNA444a的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的耐盐性高于所述目的植物；所述micr0RNA444a的核苷酸序列为序列表中的序列3或序列4或序列2或序列2自5’末端第49-4425位核苷酸。
[0019]上述方法中，所述microRNA444a的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第49-4425位核苷酸；所述microRNA444a的编码基因通过重组载体导入目的植物中。
[0020]上述方法中，所述重组载体为将所述microRNA444a的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA444a的载体。上述重组载体具体为将所述microRNA444a的编码基因插入pUN1301载体的BglII和SacI之间得到的载体。
[0021]本发明的第三个目的是提供一种重组载体。
[0022]本发明提供的重组载体，为将miCix)RNA444a的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA444a的载体；所述microRNA444a的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第49-4425位核苷酸。
[0023]在本发明的实施例中，所述表达载体具体为pUN1301载体，上述重组载体具体为将所述microRNA444a的编码基因插入pUN1301载体的BglII和SacI之间得到的载体。
[0024]本发明的实验证明，本发明发现的miCix)RNA444a，将其编码基因导入水稻中，得到0smicroRNA444a的超表达株系，该植株与未转入该基因的水稻相比表现耐盐的表型,说明该microRNA与水稻盐胁迫密切相关。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为扩增到0smicroRNA444a包含前体序列在内的基因组DNA
[0026]图2为超表达载体pUN1301_0smiR444a的部分物理图谱
[0027]图3为转基因水稻的Northern以及Real-time-PCR鉴定
[0028]图4为0smicroRNA444a超表达转基因水稻表型观察
【具体实施方式】
[0029]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0030]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0031 ] 实施例1、microRNA444a在调控水稻耐盐性中的应用
[0032]一、microRNA444a 的编码基因 0smicroRNA444a 的获得[0033]1、编码基因 0smicroRNA444a 的克隆
[0034]根据数据库分析的结果设计引物，5'端引物:5' -GAAGATCTGCAATTGGGGGCAGCAAGC-3'(下划线序列为 Bgl I 位点)，3'端引物:5' -CGAGCTCTGGCAACAGGAGGCAGCAAG-3'(下划线序列为SacI位点)，提取粳稻中花十号三叶期幼苗总基因组，采用RT-PCR方法扩增到 4392bp 全长 cDNA。
[0035]具体操作过程如下:
[0036]1)植物基因DNA的提取:选取0.5g三叶期中花十号水稻(Oryza sativa L.cvZhonghualO ;记载在如下文献中:李梅芳，水稻花培品种一中花10号,农业科技通讯，1998年第I期第26页；公众可从中国科学院植物研究所获得，以下简称为野生型水稻。)的幼苗为材料，在液氮中研磨，将液氮中研碎的冻干粉转入到含729 μ L基因组提取buffer (0.1MTris-HCl (PH8.0)、50mM EDTA (ρΗ8.0)、0.5Μ NaCl)，再加入 18.4 μ L β -mercapto ethanol剧烈振荡使其全部悬浮；接着加入52.8 μ L65° C预热的20%SDS ；65° C水浴温育30min，每5min颠倒混匀一次；然后加入250 μ L冰上预冷的5Μ乙酸钾，立即颠倒混匀，冰上放置20min ;4。。，12，OOOg离心10min,取上清;加入与上清等体积的酹/氯仿/异戍醇(25:24:I )，抽提一次，4°C，12，OOOg离心10min，用等体积的氯仿/异戊醇(24:1)再抽提一次；收集上清并加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，_20°C放置30min ；4°C，12，OOOg离心10min，弃去上清；沉淀用Iml的70%乙醇洗2次；干燥后，溶于20 μ L ddH20中，得到基因组DNA。
[0037]2)PCR扩增:提取的基因组稀释100倍，用作模板按以下体系进行PCR反应:0.2μ1 PrimerSTAR HS DNA Polymerase (5U/μ I )、10 μ 12 X GC buffer, 1.8μ IdNTPs，0.5μ 15'端引物(10 μ Μ)，0.5 μ 13'端引物(10 μ Μ)，加 ddH20 终体积 20 μ I。引物序列 Y 端引物:5' -GAAGATCTGCAATTGGGGGCAGCAAGC-3 '(下划线序列为 BglII 位点)，3'端引物:5' -CGAGCTCTGGCAACAGGAGGCAGCAAG-3'(下划线序列为 Sac I 位点)，PCR 程序为:94° C预变性30s后进入PCR循环，循环参数为98° ClO秒变性一52° C15秒复性— 72° C4分钟20秒延伸，35个循环后在72° C继续合成10分钟。
[0038]扩增的PCR产物经过0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图1所示，从图中可以看出，得到分子量大约4.39kb的条带,用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收该片段得到20 μ I回收产物。进行测序分析,测序结果该PCR片段的核苷酸序列为序列表中的序列I自5 ’末端第49-4425位核苷酸，将该PCR产物的基因为0smicroRNA444a，其编码的0smiCix)RNA444a的核苷酸序列为序列表中的序列2自5’末端第49-4425位核苷酸，0smicroRNA444a剪切成熟体为microRNA444a，其核苷酸序列为序列表中的序列3或序列4。
[0039]二、超表达载体 pUN1301_0smicroRNA444a 的构建
[0040]1、含有 0smicroRNA444a 的载体 pTE_0smiR444a
[0041]取3.5μ I上述一得到的PCR产物回收产物，加入1μ I (3U/μ I) T4-DNA连接酶、5μ 12Χ 连接酶缓冲液、0.5μ I (50mg/ml)pGEM-T Easy 载体(Promega) 4°C连接过夜，得到连接产物，用连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，经含羧苄青霉素的抗性平板筛选得到含有重组质粒的大肠杆菌菌株。采用碱裂解法从菌株中分离提取质粒，以PGEM-TEasy载体上的T7和SP6启动子序列为引物，进行测序分析，该质粒为将序列表中的序列I自5’末端第49-4425位核苷酸插入pGEM-T Easy载体中，将测序正确的质粒命名为pTE_0smiR444ao[0042]2、pUN1301载体的获得
[0043]I)剪取约0.2g玉米(品种名:中作-中单8，北京中农作科技发展有限公司)幼苗，置于液氮中研磨；然后加入800 μ L新配制的提取缓冲液(含0.1M Tris-HCl ρΗ8.0，50mMEDTA, 0.5M NaCl，1%SDS和I % β -巯基乙醇)，剧烈振荡使其全部悬浮；65°C水浴30分钟，每5分钟颠倒混匀一次；然后加入250 μ L预冷的5Μ乙酸钾水溶液，立即颠倒混匀，冰浴5分钟；加入等量酚/氯仿,抽提一次,12000rpm离心5分钟；收集上清液，加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，室温放置40分钟；4°C 12000rpm离心15分钟，弃上清；沉淀用70%、100%乙醇各洗一次；干燥后，溶于20 μ L含100 μ g/mL RNase的ddH20中，得到玉米基因组DNA。
[0044]2)取上述玉米基因组DNA溶液2μ L作为模板，在带有Hind III识别位点的 5 '引物(GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG)和带有 BamHI 识别位点的 3 '引物(CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG)为引物，进行 PCR 扩增，PCR 反应条件为:先 94°C 3 分钟；再94°C 45秒，62°C 45秒，72°C 2分钟，共35个循环，最后72°C 10分钟。反应结束后，对PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，表明得到长度约为2kb的扩增片段，与预期结果相符，回收该目的片段，得到的片段经测序验证，具有序列表中序列5所示的核苷酸，为玉米泛素启动子(UbiPro )。
[0045](玉米泛素启动子(UbiPro)也可以人工合成获得。)
[0046]3)用限制性内切酶Sac I和EcoR I将Noster poly A终止序列(277bp)从质粒载体PBI121 (北京拜尔迪生物技术有限公司目录号:MP-091)上切下，连接到载体pUC19 (北京百泰克生物技术有限公司目录号:DP7801 M^Sac I和EcoR I位点间，得到重组载体，命名为pUC19-Noster。再用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切pUC19_Noster，琼脂糖凝胶电泳检测后，回收线性化 的载体大片段，并将该回收片段与2)中经Hind III和BamH I双酶切获得的带有粘性末端的玉米泛素启动子(UbiPro)相连，得到重组载体，命名为PUN19。
[0047]4)用限制性内切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切(37° C条件下，先加入EcoR I进行部分酶切，酶切时间为半小时，65° C下20分钟使EcoR I酶失活，后加入HindIII完全酶切3小时即可)从3)购建的重组载体pUN19切下包含UbiPro和Noster的长度约为2.3kb的片段，将该片段克隆入质粒载体pCAMBIA1301 (Biovector C0.，LTD公司目录号Biovec-1l)的EcoR I和HindIII位点处，得到重组载体，命名为pUN1301。
[0048]3、PUNl3O1-OsmiCroRNA4Ma 的构建
[0049]用限制性内切酶BglII和SacI对2步骤获得的质粒pUN1301进行双酶切，酶切体系为:质粒 10μ l、10x 酶切缓冲液 5μ l、BglIIl μ I (?ου/μ I)、SacI0.8μ I ( IOU/μ I),加ddH20补充反应体系至50 μ 1，37°C酶切4小时。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，回收4392bp线性化的pUN1301大片段，溶于20 μ I ddH20中。
[0050]用限制性内切酶BglII和SacI对I步骤获得的质粒pTE_0smiR444a进行双酶切。酶切体系为:质粒10 μ 1，酶切缓冲液5 μ 1、BglIIly I (IOU/μ I)、加ddH20补充反应体系至50μ 1，37°C酶切4个小时。再加入SacI0.2μ I (IOU/μ I )，37°C酶切20分钟。用0.8%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，用AxyPrep公司的DNA凝胶回收试剂盒回收该片断，回收 4392bp 的 0smicroRNA444a 片段。
[0051]将10 μ I回收的4392bp的0smicroRNA444a溶液、6 μ I回收的载体pUN1301大片段溶液、2μ l(3U/y 1)T4DNA连接酶和2μ IlOx连接酶缓冲液混和，16°C连接16小时，得到的连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆。提取阳性克隆中的重组质粒，进行测序验证，结果该重组质粒为将序列表中的序列I自5’末端第49-4425位核苷酸插入pUN1301的BglII和SacI酶切位点间得到的载体，命名为pUN-0smiR444a，且pUN-0smiR444a中启动子、基因和终止子的结构正确(见图2)。在该表达载体中采用玉米泛素启动子(UbiPro)启动目的片段0smicrORNA444a在植物中超表达。
[0052]三、转基因水稻的获得
[0053]将上述pUN1301-0smicroRNA444a质粒用电击法转化农杆菌EHA105 (Hiei Y,Ohta S，Komari T, Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice(Oryzasativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundariesof the T-DNA.Plant J6:271 - 282，公众可从中国科学院植物研究所获得。)，经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆的超表达工程菌，提取阳性克隆的超表达工程菌的质粒，为pUN1301-0smicroRNA444a，将该阳性克隆的超表达工程菌命名为EHA105/pUNl301-Osmi croRNA444a。
[0054]将EHA105/pUN1301-0smicroRNA444a 侵染中花十号水稻(Oryza sativa L.cvZhonghualO,以下简称为野生型水稻)的愈伤组织，再将导入EHA105/pUN-0smiR444a的愈伤组织用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤5遍，无菌滤纸吸干后转至N6D2S1培养基上，筛选一代；两周后，转移至N6D2S2培养基上筛选二代(2周/代)；取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至分化培养基(I )，上，在分化培养箱(12小时光周期，白天28°C，夜晚25°C)中培养7天；然后转移至分化培养基(2)，上，在分化培养箱中培养至产生再生苗。再生的植株在生根壮苗培养基上生根壮苗；待小苗长至10厘米左右时，打开容器封口膜，炼苗2-3天，然后将小苗移入人工气候室栽培，获得10个株系共60棵TO代转0smicroRNA444a水稻。
[0055]所用培养基如下表1:
[0056]表1所用培养基配方
[0057]
【权利要求】
1.microRNA444a或其编码基因或表达microRNA444a的重组载体在调控植物耐盐性中的应用； 所述microRNA444a的核苷酸序列为序列2自5’末端第49-4425位核苷酸或序列2或序列表中的序列3或序列4。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述micr0RNA444a的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第49-4425位核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于: 所述表达microRNA444a的重组载体为将所述microRNA444a的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA444a的载体。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于:所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于: 所述单子叶植物为水稻。
6.一种培育转基因植物的方法,为将microRNA444a的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的耐盐性高于所述目的植物； 所述micr0RNA444a的核苷酸序列为序列表中的序列3或序列4或序列2或序列2自5’末端第49-4425位核苷酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述micr0RNA444a的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第49-4425位核苷酸； 所述microRNA444a的编码基因通过重组载体导入目的植物中。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述重组载体为将所述micr0RNA444a的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA444a的载体。
9.一种重组载体，为将microRNA444a的编码基因插入表达载体中，得到表达microRNA444a 的载体； 所述micr0RNA444a的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第49-4425位核苷酸。
【文档编号】C12N15/113GK103923917SQ201310009657
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月10日 优先权日:2013年1月10日
【发明者】种康, 陈丽萍, 马岩, 郭思义, 牛遇达, 徐云远 申请人:中国科学院植物研究所