methprimer. eg)在线软件进行引物设计，用于实验的PCR扩增引物如下： 所述的甲基化特异性扩增上游引物核苷酸序列如下： 5' _ AGAGGTGATCGGTAATTTTTTAGTC-3' ； 所述的甲基化特异性扩增下游引物核苷酸序列如下： 5' - CCTATTACACAAACTCAAACTCGTT-3' ； 所述的非甲基化特异性扩增上游引物核苷酸序列如下： 5' - GAGGTGATTGGTAATTTTTTAGTTG-3' ； 所述的非甲基化特异性扩增下游引物核苷酸序列如下： 5' - CCTATTACACAAACTCAAACTCATT-3'。
[0013] DNA甲基化测定的具体步骤： 步骤一：采用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen，Hilden，德国）DNA提取试剂盒提取组织 全基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA的浓度； 步骤二：采用EZ DNA甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化； 步骤三：取步骤二中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo Taq? PreMix酶（Zymo Taq? PreMix，ZYMO RESEARCH)，分别加入上述一对堪因启动子区甲基化特异性扩增引 物和5??遵因启动子区非甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增，扩增条件：首先95°C IOmin的变性；接着94°C 30s，Tm 40s，72°C 50s，共35个循环的退火反应；然后延伸反应 72°C IOmin (注：Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定）； 步骤四：将步骤三的PCR产物取5 μ 1放置于采用Regular Agarose G-IO (Biowest，西 班牙）配制的浓度为2%琼脂糖凝胶进行电泳，在通过BIO-RAD Gel Doc XR+凝胶成像系统 成像，判断PCR产物甲基化情况（图1)。如图1，M代表甲基化，U代表未甲基化。T代表肿 瘤组织，N代表癌旁组织。应用J基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物和下游 引物能扩增出明显的特异条带则认为该样本基因发生甲基化，如应用基因 启动子区的非甲基化特异性扩增上游引物和下游引物扩增出的明显单一条带，则认为该样 本基因未发生甲基化。从结果中我们可以看出T1，T2癌组织基因启动子区 都存在甲基化，而相对应的癌旁组织Nl，Ν2中J基因均未发生甲基化。而作为对照组 的水在用甲基化特异性引物扩增和未甲基化特异性引物扩增时均未见条带。若应用 基因启动子区甲基化特异性扩增上游引物、下游引物及其非甲基化特异性扩增上游引物和 下游引物均能扩增出条带，则认为该样本基因发生部分甲基化或不完全甲基化。
[0014] 4、数据分析 本次实验采用SPSS 16.0对数据进行整理分析，我们发现：在喉癌组织中J 基因启动子区甲基化率高于癌旁组织，且差异有统计学意义（卡方值=47.86，尸 =4. 58X 10 12,见表1，注值小于0. 05,具有统计学意义）。此外，我们还对J基因 启动子区甲基化率与93例喉癌患者的临床病例资料进行了分析。结果发现基因启 动子区甲基化率水平在低病理分化、高T分级、临床晚期、有淋巴结转移的喉癌患者明显升 高，且差异均具有统计学意义（见表2); 表1癌组织与癌旁组织甲基化比较（n=93)
注：η表示样本个数，/7值小于0. 05,具有统计学意义； 表2甲基化水平与喉癌患者临床病理资料分析（η=93)
注：a:值有fish确切概率法算得η表示样本个数，/値小于0. 05,具有统计学意义。
[0015] 与其他传统的喉癌检测技术相比，此试剂盒技术具有准确可靠、灵活快速和经济 节约的优点。本发明采用上述试剂盒对似·?基因启动子区甲基化水平进行检测，能够快 速可靠地为喉癌的辅助诊断、检测或筛查药物提供借鉴。
[0016] 上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通 技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护 范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
【主权项】
1. 一种可用于检测与喉癌相关的基因启动子区甲基化程度的试剂盒，其特征 在于包括似·?基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物、下游引物及其非甲基化特 异性扩增上游引物和下游引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如 SEQIDNO. 1 所示： 5' _AGAGGTGATCGGTAATTTTTTAGTC-3' ； 所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示： 5' -CCTATTACACAAACTCAAACTCGTT-3' ； 所述的非甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示： 5' -GAGGTGATTGGTAATTTTTTAGTTG-3' ； 所述的非甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 4所示： 5' -CCTATTACACAAACTCAAACTCATT-3'。2. -种可用于检测与喉癌相关的J基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应用， 其特征在于：该试剂盒可用于喉癌辅助检测、诊断或药物治疗中。
【专利摘要】本发明公开了可用于检测与喉癌相关的<i>SHISA3</i>基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，特点是该试剂盒包括一对<i>SHISA3</i>基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一对非甲基化特异性扩增引物，其中甲基化特异性上游引物核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示，未甲基化特异性上游引物序列如SEQ？ID？NO.3所示，下游引物序列如SEQ？ID？NO.4所示，优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对喉癌的检测，检测效率高，针对性强，同时，以<i>SHISA3</i>基因启动子区甲基化为靶点的药物有望成为喉癌辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105385760
【申请号】CN201510855573
【发明人】沈志森, 周重昌
【申请人】宁波市医疗中心李惠利医院
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年11月30日