er Scientific)检测 所得DNA的浓度，以供生长抑素受体2基因启动子区DNA甲基化水平的检测。
[0013] 3、DNA甲基化水平测定 本实验采用焦磷酸测序技术对生长抑素受体2基因启动子区的9个CpG位点（如图1) 进行了 DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚 合酶链反应（PCR)扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶（C)碱基保持不变，而使未发生甲基化的 C转变成了尿嘧啶（U)，然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。 本次研宄采用PyroMark Assay Design软件进行引物设计，用于实验的PCR扩增引物和测 序引物如下： 所述的甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列： 5' -Biotin -AGGGTAGAGGAGTTAGGAATTT-3' ； 所述的甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列： 5' -ACCCCTCACCTTTACTTTTC-3' ； 所述的甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列： 5' -ACCCAACCACTATCCC-3'。
[0014] DNA甲基化水平测定的具体步骤： 第一步：采用 EZ DNA 甲基化试剂盒-Gold(EZ DNA Methylation-Gold? Kit; ZYMO RESEARCH)对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化； 第二步：取第一步中转化过的DNA样本20ng加入到ZymoTaq?PreMix酶 (ZymoTaq?PreMix，ZYMO RESEARCH)，并加入上述一对趋化素样因子超家族成员3基因启动 子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增，扩增条件：首先95°C IOmin的变性；接着95°C 3〇8，1'1114〇8,72°0 11^11，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72°0 71^11。（注：1'111在实 验中根据跑PCR梯度温度确定） 第三步：焦磷酸测序的前期准备：在PSQ24板中预先加入40 μ 1含有0. 3 μ M上述甲基 化特异性测序引物的退火缓冲液（PyroMark Annealing Buffer; Qiagen);将需要使用的 混匀的琼脂糖珠总量（每样本3 μ 1)转移到一个微量离心管中；在琼脂糖珠中加入结合缓 冲液（PyroMark Binding Buffer; Qiagen)，使得平均每个样品约有50 μ 1的体积，将混合 物混匀；将以上混合物加入PCR产物（50 μ 1反应体积）中，每样本50 μ 1 ;将PCR产物在 常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加 入50ml的高纯水、70%乙醇、洗绦缓冲液（PyroMark Wash Buffer; Qiagen;)和50ml的变 性缓冲液（PyroMark Denaturation Solution ;Qiagen);打开真空预备工作站的泵，将真 空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具（PyroMark Vacuum Pr印Filter Probes; Qiagen)移到PCR板中，抓取琼脂糖珠（在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此 操作）；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具 放入70%乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5 - 10秒；关 掉泵；将真空准备工具放入含有测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠（测序引物也可最后 加入）；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80°C 3 分钟，再冷却到室温，即可进行焦磷酸测序反应； 第四步：焦磷酸测序：在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上，采用Pyromark Gold Q24试剂 盒（Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen)对第三步中的PSQ24板中的样本进行测序，然 后应用PyroMarkCpG软件对结果进行甲基化分析（甲基化水平检测结果示例见图2)。图2 中所示百分数为对应CpG位点的甲基化程度，如图2所示CpGl到CpG9的甲基化程度分别 为 35%，31%，33%，30%，21%，36%，28%，25%，11%。
[0015] 4、数据分析 本次实验采用SPSS 16. 0对数据进行整理分析，我们发现：被检测的9个CpG位点间存 在显著关联（相关系数1'〉0.426，？〈 0.0001，有统计学意义，见图1)(注：？〈0.05时表 示有统计学意义，下同），所以我们把CpGl-CpG9求平均值后参与到后续的分析中，发现病 例组和对照组之间的DNA甲基化水平存在显著差异（p = 9. 20ΧΚΓ4,见表1)。
[0016] 表1病例组与对照组间的比较（n=42)
【主权项】
1. 一种可用于检测与大肠癌相关的ITTPi基因启动子区甲基化程度的试剂盒，其特征 在于包括5^/TPi基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物、下游引物及其甲基化特异性 测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示： 5'-Biotin-AGGGTAGAGGAGTTAGGAATTT-3' ； 所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示： 5' -ACCCCTCACCTTTACTTTTC-3' ； 所述的甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示： 5' -ACCCAACCACTATCCC-3'。
2. -种可用于检测与大肠癌相关的ITTPi基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应用， 其特征在于：该试剂盒可用于大肠癌辅助检测、诊断或药物治疗中。
【专利摘要】本发明公开了可用于检测与大肠癌相关的SSTR2基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，特点是该试剂盒包括一对SSTR2基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，其中上游引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示，优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对大肠癌的检测，检测效率高，针对性强，同时，以SSTR2基因启动子区甲基化为靶点的药物有望成为大肠癌辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104726590
【申请号】CN201510128460
【发明人】段世伟, 叶孟, 李锦芸, 陈成
【申请人】宁波大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月24日