054] 检测体系 PCR 反应液包括：2XPCR Buffer ;2mM dNTPs ;K0D FX DNA PolymeraseQU/ μ I);检测目的基因用的上、下游引物。
[0055] 测序体系包括：测序纯化液、EDTA (125mmol)、无水乙醇、75 %乙醇、HIDI (高度去 离子甲酰胺）、测序引物：测序_F(3. 2ym)与测序-R(3. 2ym)，及CDA_S-F34(3. 2ym)与 CDA_S_R34 (3.2 μ m)，以及 Bigdye Terminator V3. 1(购买自美国 Applied Biosystems 公 司），其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶（SAP) 0. 6U和核酸外切酶I (EXONI) I. 2U。
[0056] 检测体系PCR反应液配制如下：
[0057]
[0058] 阳性对照品：含有CDA序列的洛液。
[0059] 阴性对照品：无 CDA序列的溶液。
[0060] 空白对照品：2 μ 1生理盐水或不加任何物质。
[0061] 实施例2
[0062] 血液DNA抽提试剂盒（天根生物）的操作流程：
[0063] (1)抽提血液中的基因组DNA:
[0064] 1)抽取500uL血液加入1000 uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再 颠倒混勾几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至 彻底混匀。
[0065] 2)加入20 μ 1蛋白酶K溶液，混匀。
[0066] 3)加入200 μ 1缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，溶液应变清亮，简短 离心以去除管盖内壁的水珠。
[0067] 4)加入200 μ 1无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离 心以去除管盖内壁的水珠。
[0068] 5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12, 000rpm(13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
[0069] 6)向吸附柱CB3中加入500 μ 1缓冲液⑶（使用前请先检查是否已加入无水乙 醇），12, 000rpm(13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0070] 7)向吸附柱CB3中加入700 μ 1漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙 醇），12, 000rpm(13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0071] 8)向吸附柱CB3中加入500 μ 1漂洗液PW，12, 000rpm(13, 400Xg)离心30秒，倒 掉废液。
[0072] 9)将吸附柱CB3放回收集管中，12, OOOrpm (13, 400 X g)离心2分钟，倒掉废液。将 吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0073] 10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 100 μ 1洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12, OOOrpm (13, 400 X g)离心2分钟，将溶液收集 到离心管中。
[0074] (2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X μ 1，每人份18 μ 1分 装：
[0075] X = 18 μ 1反应液X (η份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照）
[0076] η为检测标本数。
[0077] (3)加样：加入3个检测体系PCR反应液中各2 μ I DNA ;阳性对照和阴性对照直接 加 2 μ 1阳性对照品和阴性对照品；空白对照加 2 μ 1生理盐水或不加任何物质。
[0078] (4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti (美国Applied Biosystems公司）等。反应条件如下：
[0079]
[0080] (5) sanger 测序：
[0081] 取9 μ I PCR产物与2 μ 1纯化体系。按照以下程序进行纯化：
[0082]
[0083] 将1 μ 1纯化产物分别与测序引物：测序_F(3. 2 μL?)与测序_R(3. 2 μL?)按照如下 体系进行混合：
[0084]
[0085]
[0086] 测序反应程序：
[0087]
[0088] 沉淀环节：
[0089] 向完成测序反应的产物中加入2μ1 125mmol的EDTA，静置5min ;加入15ml无 水乙醇，漩祸混勾；3700rpm离心30min ;倒置离心15sec，加入50ml70%乙醇，漩祸混勾； 3700rpm离心15min ;倒置离心15sec，置于95°C金属浴上；加入10 μ I HIDI后进行变性试 验。变性程序：
[0090]
[0091] 变性程序结束后，上测序仪（ΑΒΙ3730)测序。
[0092] (7)结果判断：将测序结果与野生型参考序列进行比对，根据实际突变情况对结 果进行报告。
[0093] 实施例3
[0094] 取临床乳腺癌患者样本4份，检测该4份样本是否存在CDA基因突变。按实施例 2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入检测体系PCR反应液中2 μ 1。同 时做阳性，阴性，空白对照各一份。用普通PCR仪检测，时间为160分钟。
[0095]
[0096] 样品1序列的第79位点的正向测序结果如图如1所示，为野生型。样品2序列的 第79位点正向测序结果如图2所示，为杂合突变型。
[0097] 样品1、样品2、样品3和样品4的208、435位点经过测序比对，未见突变，上述位 点为野生型。
[0098] 从检测结果可以看出，本发明所述引物能够检测出CDA基因第79、208和435位 点，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩增出CDA基因第79、208和435 位点，无论是野生型还是突变型。对阳性标本的检测表明本发明所述引物和方法及试剂盒 能够检测出CDA基因突变。
【主权项】
1. 检测CDA基因第79位点、第208位点和第435位点的引物，其特征在于，包括：扩增 覆盖CDA基因第79、208和435位点的正、反向引物和测序引物；其碱基序列为： CDA79-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTGTGAAGCACACGTAGG ； CDA79-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCGCCTCTTCCTGTACATC ； CDA208-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTGCTCTCTTCTCAGGGT ； CDA208-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTGTTGGCTAAAGAGATGAATG ； CDA435-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCTCACGCCAGCTTTGCC ； CDA435-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCAGGCTGGAGTGTAATCTG ； 测序-F :TGTAAAACGACGGCCAGT ; 测序-R :AACAGCTATGACCATG。2. 如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述正、反向引物的使用浓度比为： CDA79-F:CDA79-R = I:I, CDA7208-F:CDA208-R = I:I, CDA435-F:CDA435-R = 1:1〇3. 如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述测序引物的使用浓度比为：测序-F:测 序-R = 1:1 〇4. 一种检测检测CDA基因第79位点、第208和第435位点的方法，其包括如下步骤： (1) 提取样品DNA ; (2) 利用扩增引物 CDA79-F/CDA79-R，CDA208-F/CDA208-R，CDA435-F/CDA435-R 对（1) 中的DNA分别进行扩增，获得检测CDA基因第79、208和435位点的扩增产物； (3) 利用测序引物测序-F与测序-R对（2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获 得所述扩增产物的基因序列； (4) 将⑶中的基因序列与野生型CDA基因序列进行比较，确定突变位点是否存在； 其中所述引物序列为： CDA79-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTGTGAAGCACACGTAGG ； CDA79-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCGCCTCTTCCTGTACATC ； CDA208-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTGCTCTCTTCTCAGGGT ； CDA208-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTGTTGGCTAAAGAGATGAATG ； CDA435-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCTCACGCCAGCTTTGCC ； CDA435-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCAGGCTGGAGTGTAATCTG ； 测序-F :TGTAAAACGACGGCCAGT ; 测序-R :AACAGCTATGACCATG。
【专利摘要】本发明公开了检测编码胞苷脱氨酶的基因CDA第79、208和435位点的引物和方法，所述引物包括扩增CDA基因第79，208和435位点正、反向引物和测序引物。基于采用Sanger测序法，利用所述引物和方法可用于快速检测CDA基因第79，208和435位点的突变情况，并为患者使用二氟核普类抗代谢抗肿瘤药吉西他滨的用药情况提供参考。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104975014
【申请号】CN201510397418
【发明人】孙翠莲, 黎洪奋, 王淑一
【申请人】南昌艾迪康临床检验所有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年7月8日