liBW25113/ PlJ790中使其发生重组，涂布于LB筛选平板（含100yg/mL氨节青霉素，50yg/mL卡那霉 素，50yg/血壮观霉素）上，37°C过夜培养。从平板上挑出阳性单克隆，抽提质粒，重组质 粒命名为delnrfnO和delnrfnH，delnrfnO和delnrfnH中的mfnO和mfnO基因的部分片段分别 被转移原点和壮观霉素抗性基因取代。（4)将构建好的重组突变质粒delnrfnO和delnrfnH 分别转化到E.COliET12567/pUZ8002 中，获得重组菌株E.COliET12567/pUZ8002/delmfn0 和E.COliET12567/pUZ8002/delmfnH，作为接合转移的供体菌。
[0046] 野生型链霉菌Str巧tomyces化ozdowicziiSCSIO10141菌株在ISP2培养基 (麦芽提取物4g，酵母提取物4g，葡萄糖4g，海盐30g，琼脂粉20g，加水至比，pH7. 2)平 板中划线培养3-5天，长出的抱子用无菌棉签收集于的TSB培养基中，满旋振荡，使抱子分 散。过滤分离菌丝体和抱子，抱子悬浮于5血的TSB培养基中，50°C热激lOmin，然后于28°C 萌发2-4小时，作为接合转移的受体菌。当供体菌E.COliET12567/pUZ8002/delmfn0和 E.COliET12567/pUZ8002/delmf址分别在50血含50yg/血卡那霉素，25yg/血氯霉素 和50yg/mL壮观霉素的LB液体培养基中于37°C生长至0D600值约为0. 6时，离屯、收集菌 体（400化pm，IOmin)，用LB清洗菌体3遍，悬浮于300yLLB培养基中，作为接合转移的供 体菌。取上述受体菌400yL和供体菌100yL混合均匀，涂布于不含任何抗生素的M-ISP4 固体培养基（可溶性淀粉lOg，酵母提取物0. 5g，蛋白腺Ig,化ClIg,M拆〇4 ? 7&0Ig, (NH4)2S042g，K2HP04lg，CaC032g，海盐30g，微量元素100yレ加水至lL，pH7.2)上，吹干后， 于28°C培养18-20h。然后将平板取出，用含有抗生素的水覆盖平板，其终浓度为100yg/mL 壮观霉素和50yg/mL甲氧节氨喀晚，吹干后，置于28°C培养箱中，培养3-4天后观察。
[0047] 当接合转移平板上长出小菌落后，用无菌牙签将其转接到含有100yg/血壮观霉 素和50yg/血甲氧节氨喀晚的ISP2平板上，28°C培养2-3天后，抽取各个突变株的基因组 DNA，利用检测引物（引物序列见于表2中的nrfnO和IirfnH的检测引物序列）通过PCR检测 获得阳性克隆，即获得氨基转移酶IrfnO基因敲除双交换突变菌株AIrfnO和异构酶Irf址基 因敲除双交换突变菌株AnrfnH。 W48] 表1 :构建nrfnO和IrfnH基因突变株所需的敲除引物名称和序列
[0049]
[0050] 表2:构建nrfnO和nrfnH基因突变株所需的检测引物名称和序列
[0051]
阳〇5引 实施例2
[0054] dsaD基因（其核巧酸序列如SEQ ID NO. 3所示，其编码的氨基转移酶化aD的氨基 酸序列如SEQ ID NO. 7所示）和ds址基因（其核巧酸序列如SEQ ID NO. 4所示，其编码的异 构酶化址的氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示）的同框缺失突变及在异源宿主Streptomyces coelicolor M1152中的表达 阳化5] 首先是对dsaD和ds址基因进行同框缺失突变。具体操作过程如下：（1)参照文 献报道的PCR-targeting系统，首先通过内切酶EcoR I和Hind III酶切质粒PIJ773,回收 其中约1.4化含有转移原点（oriT)和阿普拉霉素（apramycin)抗性基因的DNA片段，作为 PCR扩增敲除dsaD和ds址基因所需的DNA片段。似根据dsaD和ds址基因的序列，分别 设计一对敲除引物，此引物特点在于，有39个核巧酸与目标缺失突变基因同源（见表3,大 写字母所示），有19或者20个核巧酸与抗性基因片段左端或者右端同源（见表3,小写字母 所示），此外，在39个核巧酸和19/20个核巧酸之间加入了内切酶SpeI位点（见表3, SpeI 位点用下划线标出）。利用此引物，W回收的1. 4化含有转移原点（oriT)和阿普拉霉素 (apramycin)抗性基因的DNA片段作为模板，进行PCR扩增获得1. 4化的PCR产物，50 y L的 PCR反应体系：高保真DNA聚合酶抓，IOXBuffer 5yL，dNTPs 0.5mmol/L，DMS0 2.5yL，引 物各0. 5 y mol/l，DNA模板约Ing，加水补至50 y L。PCR反应条件为：预变性94°C 5min ;扩 增循环为94°C变性45s，58°C退火45s，72°C延伸90s，30个循环；最后72°C延伸lOmin。将 1. 4化的PCR产物分别回收纯化待用。（3)接下来选择SuperCos1质粒来源的粘粒07-細作 为对dsaD和ds址进行同框缺失突变的起始粘粒，此粘粒含有desotamides的生物合成基 因簇（desotamides的生物合成基因簇的核巧酸序列的GenBank登录号为：KP769807. 1)。将 粘粒07-細转入大肠杆菌E.COliBW25113/pIJ790 中获得E.COliBW25113/pIJ790/07-細， 用1〇1111的心阿拉伯糖诱导A/red重组系统表达，并将其制备成为电转感受态细胞待用。 (4)分别将（2)步骤中获得的1.地bPCR产物电转入（3)步骤中制备的感受态细胞E.COli BW25113/PIJ790/07-細中使其发生重组，涂布于LB筛选平板（含100yg/mL氨节青霉 素，50yg/血卡那霉素，50yg/血阿普拉霉素）上，37°C过夜培养。从平板上挑出阳性单 克隆，抽提质粒，重组粘粒命名为07-6H-DK0和07-6H-EK0,07-6H-DK0和07-6H-EK0中的 dsaD和ds址基因的部分片段分别被转移原点和阿普拉霉素抗性基因取代。（5)利用SpeI 对重组粘粒07-6H-DK0和07-6H-EK0进行酶切，经酪：氯仿抽提，乙醇沉淀后，用T4连接酶 进行连接，转化感受态细胞E.COliD册，涂布于含有100yg/mL氨节青霉素，50yg/mL卡 那霉素的LB平板上，于37°C过夜培养。利用检测引物（见表4)对克隆进行PCR鉴定，挑 取丢失转移原点和阿普拉霉素抗性基因DNA片段而自连的粘粒，命名为07-6H-DK0-IF和 07-細-EKO-IF。
[0056] 接下来是将dsaD和ds址基因已经被同框缺失突变的粘粒07-6H-DK0-IF和 07-6H-EK0-IF导入到异源宿主StreptomycescoelicolorM1152中进行表达。在导入 StreptomycescoelicolorM1152 之前，首先要对粘粒 07-6H-DK0-IF和 07-6H-EK0-IF进 行改造，W适合进行异源表达。改造的策略是利用大肠杆菌的A/red重组系统将粘粒 07-6H-DK0-IF和07-6H-EK0-IF上的来源于质粒SuperCosl的卡那霉素抗性基因分别用 含有阿普拉霉素抗性基因aac(3)IV，接合转移原点原件oriT，整合酶基因和int4C31整 合位点的NDA片段替换。此aac(3)IV-oriT-int4C3的DNA片段来源于本实验室构建的 质粒PSET152AB，利用BamHI/EcoRI完全酶切质粒PSET152AB后，回收5. 5化左右片段， 此片段含有aac(3)IV-〇riT-int^C3DNA片段W及与被替换的卡那霉素基因两侧同源的 1. 0化DNA片段）。将 07-6H-DK0-IF和 07-6H-EK0-IF转入到E.COliBW25113/pIJ790 中， 获得E.COliBW25113/pIJ790/07-6H-DK0-IF和E.COliBW25113/pIJ790/07-6H-EK0-IF。 将约IOOmg回收的 5. 5化DNA片段分别加入到E.COliBW25113/pIJ790/07-6H-DK0-IF 和E.coliBW25113/pIJ790/07-6H-EK0-IF感受态细胞中，转入电击杯中，1. 4kv电压进行 电转化。电击完成后迅速加入预冷的0. 5mL的LB培养基，37°C复苏1小时后涂布于含有 100yg/mL氨节青霉素和50yg/mL阿普拉霉素的LB平板。12小时后待转化子长出后， 通过检测引物（表4)利用PCR验证阳性的重组质粒，阳性重组质粒命名为07-6H-DK0-AB 和07-6H-EK0-AB。将构建好的重组质粒电转到E.COliET12567/pUZ8002中，获得E.COli ET12567/pUZ8002/07-6H-DK0-AB和E.COliET12567/pUZ8002/07-6H-EK0-AB作为接合转 移的供体菌。
[0057] 接下是将E.COliET12567/pUZ8002/07-6H-DK0-AB和E.COliET12567/ PUZ8002/07-6H-EK0-AB与StreptomycescoelicolorMl152 进行接合转移。将菌株E.COli ET12567/pUZ8002/07-6H-DK0-AB和 07-6H-EK0-AB分别接种于 3血的LB液体培养基（含 有含有100yg/mL氨节青霉素，50yg/mL阿普拉霉素，25yg/mL氯霉素和50yg/mL卡那霉 素）中，37°C培养12小时后，取40 y L菌液转接于4mL相同培养基中培养至OD为0.6,离屯、 收集菌体，用不含任何抗生素的LB液体培养基洗涂2次，洗去抗生素，离屯、浓缩菌体，备用。 与此同时，10%甘油收集S. coelicolor M1152抱子，经过滤器过滤后，3600巧m离屯、8min， 弃上清，加入适量LB培养基悬浮抱子，置于5(TC水浴中热激10分钟。将转化菌株E. COli ET12567/pUZ8002/07-6H-DK0-AB和07-6H-EK0-AB分别与S. coelicolor M1152抱子按照 体积比2:1比例混合，涂布于MS+MgCl2(终浓度为IOmM)固体平板上。20~24小时后，将 平板取出，用含有抗生素的水覆盖平板，其终浓度为100y g/mL阿普拉霉素和50 y g/mL甲 氧节氨喀晚，吹干后，置于28°C培养箱中，培养3-4天后观察。当接合转移平板上长出小菌 落后，用无菌牙签将其转接到含有100 y g/mL阿普拉霉素和50 y g/mL甲氧节氨喀晚的MS 培养基（大豆粉20g，甘露醇20g，琼脂粉20g，加水至1L，pH 7. 2)平板上，28°C培养2-3天 后，抽取各个突变株的基因组DNA，利用检测引物（引物序列见于表4)通过PCR检测获得阳 性克隆，分别获得dsaD和ds址基因已经被同框缺失突变的desotamides生物合成基因簇 异源表达菌株Streptomyces coelicolor M1152/07-6H-DK0和Str巧tomyces coelicolor M1152/07-6H-EK0。
[0058] 表3:构建dsaD和ds址基因突变株所需的敲除引物名称和序列
[0059]
W60]表4:构建dsaD和ds址基因突变株所需的检测引物名称和序列
[0061]
阳0创实施例3
[0063]marformycins的生物发酵与检测：
[0064]将海