基于微生物转化合成3-羟基β-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物转化领域，采用分散泛菌降解叶黄素生成香味物质3-羟基β -紫罗兰酮和β -紫罗兰酮，涉及泛菌微生物的转化培养基优化及其应用。
【背景技术】
[0002]叶黄素广泛存在于鲜花、果蔬、烟草等植物中，是许多重要香气成分的前体物。在烤烟成熟和燃烧过程中，叶黄素可降解转化为β -紫罗兰酮、巨豆三烯酮等，它们具有浓郁的花香和果香，且香气阈值很低，在制备香精香料方面具有重要价值。然而关于叶黄素的降解目前主要集中在物理化学降解，缺乏专一性。生物降解法尤其是利用酶和微生物来降解叶黄素产生香味物质的研究还很少。生物法降解叶黄素与物理降解和化学降解相比较具有以下两个方面的显著优点:首先生物法降解利用了酶催化的专一性，得到成分相对单一的香味物质。其次，生物法降解得到的香味物质被认定为“天然成分”。生物降解叶黄素将越来越受到大家的关注。
[0003]分散泛菌最早发现于植物、种子中，是一类产类黄色素的黄色菌群，属于泛菌属。多数分散泛菌可发酵L-阿拉伯糖、D-乳糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖和木糖。但是未有文献报道其可以降解叶黄素生成3-羟基β -紫罗兰酮和β -紫罗兰酮。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是利用微生物降解叶黄素生成香味物质3-羟基紫罗兰酮和β -紫罗兰酮，在香精香料制备行业具有广阔的应用前景。本发明属于生物法制备3-羟基β-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮，其产物被认定为“天然成分”，在应用上具有一定的优势。同时本发明还确定了降解叶黄素时最优培养基，为产业化制备3-羟基紫罗兰酮和紫罗兰酮奠定基础。
[0005]本发明的技术方案是:一种微生物转化合成3-羟基β-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮方法，它的步骤如下:
(1)分散泛菌培养，将分散泛菌菌株接种到装有种子培养基的三角瓶中，在ρΗ=6.5，30-34 °C的条件下，180-200r/min振荡培养10_18h，得到种子液；
(2)种子罐发酵:将种子液按体积比1%的接种量接种至装有种子罐液体发酵培养基的种子罐中进行发酵，至菌体进入对数生长期，所述种子罐液体发酵培养基为:以I L水的质量为基准，按以下质量加入下列成分:叶黄素0.015 g，葡萄糖11 g，蔗糖I g，酵母膏1.8g，K2HPO40.5 mg，发酵温度为30-34°C，通风比为0.5?0.8:1，得到发酵种子液；
(3)将步骤(2)种子罐的发酵种子液按体积比5-10%的接种量接种至装有液体发酵培养基的发酵罐中进行发酵，发酵48 h后，菌体量达到50?80X 108cfu/mL，出罐，所述液体发酵培养基为:以I L水的质量为基准，按以下质量加入下列成分:叶黄素0.015 g，葡萄糖11 g，蔗糖I g，酵母膏1.8 g，K2HPO40.5 mg，发酵温度为30_34°C，通风比为0.5?0.8: 1，得到3-羟基β -紫罗兰酮和β -紫罗兰酮。
[0006]所述步骤(I)中种子培养基配方:蒸馏水I L，蔗糖10g，天门冬酰胺4.5g，K2HPO4
1.5g，MgSO4 0.5g，酵母膏 3.0g, FeSO4 0.0lg0
[0007]本发明的有益效果是:二氯甲烷萃取获得分散泛菌的发酵液后，通过GC-MS分析比对发酵前后的产物，发现本发明的分散泛菌菌株发酵液中含有3-羟基β -紫罗兰酮和β-紫罗兰酮，其中3-羟基β-紫罗兰酮含量为30%，β -紫罗兰酮含量为20%。产生的发酵液具有挥发性的紫罗兰香味，可通过深加工获得高品质的香味物质。
[0008]本发明通过对其发酵培养基进行摸索，得到了能够高效降解叶黄素最优发酵培养基方案并能够生成具有香味物质的3-羟基β -紫罗兰酮和β -紫罗兰酮。3-羟基β -紫罗兰酮和β -紫罗兰酮是重要的香味物质，烟草中添加少量的此种香味物质可在很大程度上提升烟草品质。本发明在利用生物降解叶黄素，并产生天然香味物质方面呈现出巨大的应用前景。
【附图说明】
[0009]图1为分散泛菌在以叶黄素为底物的固体培养基上的生长情况；
图2为分散泛菌降解叶黄素过程的紫外吸收光图；
图3为叶黄素降解过程的薄层层析图；
图4为叶黄素降解后的产物GC-MS图。
【具体实施方式】
[0010]一种微生物转化合成3-羟基β -紫罗兰酮和β -紫罗兰酮方法，它的步骤如下: (O分散泛菌在一 80°c超低温冻结保存，保护剂为20%丙三醇；分散泛菌培养，将分散泛菌菌株接种到装有种子培养基的三角瓶中，种子培养基配方:蒸馏水I L，蔗糖10g，天门冬酰胺 4.5g，K2HPO4 1.5g，MgSO4 0.5g，酵母膏 3.0g, FeSO4 0.0lg，在 ρΗ=6.5，30-34。。的条件下，180-200r/min振荡培养10_18h，得到种子液；
(2)种子罐发酵:将种子液按体积比1%的接种量接种至装有种子罐液体发酵培养基的种子罐中进行发酵，至菌体进入对数生长期，所述种子罐液体发酵培养基为:以I L水的质量为基准，按以下质量加入下列成分:叶黄素0.015 g，葡萄糖11 g，蔗糖I g，酵母膏1.8g，K2HPO40.5 mg，发酵温度为30-34°C，通风比为0.5?0.8:1，得到发酵种子液；
(3)将步骤(2)种子罐的发酵种子液按体积比5-10%的接种量接种至装有液体发酵培养基的发酵罐中进行发酵，发酵48 h后，菌体量达到50?80X 108cfu/mL，出罐，所述液体发酵培养基为:以I L水的质量为基准，按以下质量加入下列成分:叶黄素0.015 g，葡萄糖11 g，蔗糖I g，酵母膏1.8 g，K2HPO40.5 mg，发酵温度为30_34°C，通风比为0.5?0.8: 1，得到发酵液，发酵液在避光条件下，12000r/min离心lOmin，取上清液，加入等体积二氯甲烷反复萃取3次，得叶黄素发酵液的提取物，包含有反应产物3-羟基β -紫罗兰酮和β -紫罗兰酮，加无水Na2S04干燥过夜，并与等体积不接菌培养基作为对照。
[0011]分散泛菌保藏于美国模式培养物集存库(American type culture collect1n),保藏号为ATCC29922。分散泛菌还可以是美洲爱文氏菌(Ewingellaamericana)0
[0012]图1显示在以叶黄素为底物的固体培养基上，经过微生物划线后的部位全部为白色，说明叶黄素得到了降解。
[0013]对0h、24h、48h、96h不同时间发酵萃取液进行紫外吸收光谱图全波长扫描:是在一定的波长范围内对样品进行测量，以反映样品在不同波长下的吸收值。用于多生物组分的分析时，不需经过分离就能同时将各组分测定出来。测定条件:扫描范围200-600nm，每个样品扫描3次，扫描速度600nm/min，0.5nm间隔采集。图2表明:叶黄素的三个特征吸收峰分别为430nm, 448nm, 460nm，叶黄素降解生成特征香味物质的吸收峰为250_300nm。图2中0h，叶黄素含量最高，此时几乎没有香味物质产生。随着时间变化，在48h,叶黄素的含量明显下降，香味物质逐渐增多。到达96h时，大部分叶黄素已经被降解，香味物质含量明显增高。整个变化过程和变化规律从扫描图谱中清晰的体现出来。
[0014]薄层层析法:分别取叶黄素标准品，紫罗兰酮标准品，发酵48h发酵液，发酵96h发酵液5uL，以此点在同一块薄板上。以石油醚:二氯甲烷:乙酸乙酯=7:2:1为展开剂，展开，取出晾干，在5%的硫酸甲醇中显色，取出放入90° C烘箱中烘干，将显色斑点的位置与标准品对比，以确定发酵液中的成分变化。图3中，从左到右样品依次为叶黄素标样、紫罗兰酮标样、发酵48h萃取液、发酵96h萃取液。从图中可以看出，由于叶黄素自身带有颜色，染色前，叶黄素标样Rf值为0.57，发酵48h萃取液在相同位置也有黄色斑点，说明此时叶黄素还有一部分没有降解，而发酵96h萃取液中几乎已经没有黄色斑点，说明此时大部分叶黄素已经被降解。
[0015]用5%硫酸甲醇进行显色，结果染色后所示，紫罗兰酮的标样清晰显现出来，Rf值为0.79，此时发酵48h萃取液已经有紫罗兰酮存在，但含量很低，而发酵96h萃取液中，Rf值为0.79处斑点明显。因此降解产物中含有紫罗兰酮。
[0016]GC-MS分析的条件:
分析方法:用色谱纯二氯甲烷萃取发酵液，收集有机相于三角瓶中。由于发酵萃取液中残余的水分可能对气象色谱仪器造成影响，故添加一定量的无水硫酸钠4°C静置过夜，取出残留在萃取液中的水分。经浓缩处理，放在进样瓶中，进行GC-MS定性分析。
[0017]气相条件:色谱柱:HP-5 (30mX0.25mm ；0.25rm);升温程序:初始温度45°C，保持2min，以 4°C /min 升到 120°C，保留 2min，以 1°C /min 升到 160°C，保留 5min，以 3°C /min 升到200。。，以50C /min升到280°C，保留5min ;进样口温度:270°C ;传输线温度:270°C ;分流比:10:1 ;载气:He气；流速:lmL/min
质谱条件:电离方式EI，电离电压70eV ;离子源温度230°C;质量扫描范围:30_550amu。
[0018]图4为发酵产物的GC-MS分析图，图4为发酵48h样品，经GC-MS分析主要降解产物为3-羟基β -紫罗兰酮和β -紫罗兰酮两种。
【主权项】
1.一种微生物转化合成3-羟基β -紫罗兰酮和β -紫罗兰酮方法，其特征在于，它的步骤如下: (1)分散泛菌培养，将分散泛菌菌株接种到装有种子培养基的三角瓶中，在ρΗ=6.5，30-34 °C的条件下，180-200r/min振荡培养10_18h，得到种子液； (2)种子罐发酵:将种子液按体积比1%的接种量接种至装有种子罐液体发酵培养基的种子罐中进行发酵，至菌体进入对数生长期，所述种子罐液体发酵培养基为:以I L水的质量为基准，按以下质量加入下列成分:叶黄素0.015 g，葡萄糖11 g，蔗糖I g，酵母膏1.8g，K2HPO40.5 mg，发酵温度为30-34°C，通风比为0.5?0.8:1，得到发酵种子液； (3)将步骤(2)种子罐的发酵种子液按体积比5-10%的接种量接种至装有液体发酵培养基的发酵罐中进行发酵，发酵48 h后，菌体量达到50?80X 108cfu/mL，出罐，所述液体发酵培养基为:以I L水的质量为基准，按以下质量加入下列成分:叶黄素0.015 g，葡萄糖11 g，蔗糖I g，酵母膏1.8 g，K2HPO40.5 mg，发酵温度为30_34°C，通风比为0.5?0.8: 1，得到3-羟基β -紫罗兰酮和β -紫罗兰酮。2.根据权利要求1所述的微生物转化合成3-羟基β-紫罗兰酮和β -紫罗兰酮方法，其特征在于:所述步骤(I)中种子培养基配方:蒸馏水I L，蔗糖10g，天门冬酰胺4.5g，K2HPO4 1.5g，MgSO4 0.5g，酵母膏 3.0g，FeSO4 0.01go
【专利摘要】一种微生物转化合成3-羟基β-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮方法，它的步骤如下：（1）分散泛菌培养，将分散泛菌菌株接种到装有种子培养基的三角瓶中，在pH=6.5，30-34℃的条件下，180-200r/min振荡培养10-18h，得到种子液；（2）种子罐发酵；（3）得到3-羟基β-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮。本发明通过对其发酵培养基进行摸索，得到了能够高效降解叶黄素最优发酵培养基方案并能够生成具有香味物质的3-羟基β-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮。3-羟基β-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮是重要的香味物质，烟草中添加少量的此种香味物质可在很大程度上提升烟草品质。本发明在利用生物降解叶黄素，并产生天然香味物质方面呈现出巨大的应用前景。
【IPC分类】C12P7/26, C12R1/01
【公开号】CN105154479
【申请号】CN201510466265
【发明人】杨雪鹏, 叶建斌, 毛多斌, 赵越, 张展, 马科, 胡仙妹, 邵化
【申请人】郑州轻工业学院
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年7月31日