用于紫罗兰酮检测的纳米杯阵列生物传感器件的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于紫罗兰酮检测的纳米杯阵列生物传感器件的制备方法，该方法采用纳米压印技术构造纳米尺寸杯状结构，并在纳米杯侧壁沉积纳米金颗粒，依赖纳米金属颗粒的静电吸附作用将气味结合蛋白Acer-ASP2固定于纳米杯侧壁；检测时，目标分子紫罗兰酮与气味结合蛋白Acer-ASP2的特异性结合引起纳米杯侧壁光学折射特性的改变，导致通过器件的透射光光谱的相应变化，实现对目标分子紫罗兰酮的检测；较传统的紫罗兰酮检测手段，本发明在光学检测手段的高灵敏度和特异性的优点的基础上，避免了光学检测所需的复杂光路，其操作简单便捷。
【专利说明】用于紫罗兰酮检测的纳米杯阵列生物传感器件的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物传感器件的制备技术，尤其涉及一种用于食用香精紫罗兰酮 检测的纳米杯阵列生物传感器件的制备方法。
【背景技术】
[0002]紫罗兰酮是一种被广泛用于食品工业的食用香精。对其检测，一般采用吸光度检 测和滴定等传统的物理化学方法，通常存在着操作复杂、检测效率低下的问题。气味结合蛋 白Acer-ASP2作为蜜蜂的嗅觉感受受体，能够与特定的目标分子结合特异性结合，作为生 物敏感元件构建生物传感器。光学生物传感器件主要是利用生物元件(蛋白、细胞和组织) 与目标分子特异性反应引起的光学变化进行检测的一种手段，由于具有灵敏度高，无标记， 分析时间短等优点，一直以来都是生物传感器研究中的重点内容。但是，其普遍需要的复杂 的光学系统设计阻碍了进一步的应用。因此，基于亚波长异常透射效应(EOT)的纳米杯阵 列传感技术，作为一种可以在简单的光路的条件下实现对目标分子高灵敏度和高特异性检 测的光学检测技术，开始得到广泛的研究并被应用于生物传感器的构建。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于紫罗兰酮检测的纳米杯阵 列生物传感器件的制备方法。
[0004]发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种用于紫罗兰酮检测的纳米杯阵列 生物传感器件的制备方法，包括以下步骤:
(1)加工传感器件纳米杯阵列结构:首先在聚对苯二甲酸乙二醇酯材料上均匀涂敷UV 固化胶作为粘附层，接着使用锥形纳米柱阵列模板在粘附层压印纳米杯几何结构阵列；而 后在室温下以105mW/cm2功率密度照射紫外光60s，使纳米杯阵列传感器件固化成型；
(2)沉积传感器件纳米金颗粒:首先，用IMNaOH水溶液浸泡纳米杯阵列器件 5-10min (优选IOmin)，用于除去纳米结构表面的无机污染物；然后，在纳米杯侧壁上沉积 一层5-10nm厚的钛金属作为中间粘连层，以提高纳米金颗粒的沉积效率。最后，采用电子 束蒸发的方式在粘连层上沉积90nm厚的纳米金颗粒层。
[0005](3)固定传感器件气味结合蛋白Acer_ASP2:首先，依次使用无水乙醇和超纯水超 声清洗步骤(2)沉积了纳米金颗粒的纳米杯阵列传感器件各5min。将清洗后的器件浸泡在 600 u g/ml的气味结合蛋白Acer-ASP2溶液中，室温下浸泡2h，气味结合蛋白Acer-ASP2溶 液的溶剂为PBS缓冲液，取出后用PBS缓冲液反复清洗，洗去纳米结构表面的非静电吸附的 气味结合蛋白Acer-ASP2，用氮气吹干，获得所述的用于紫罗兰酮检测的纳米杯阵列生物传 感器件，放在4°C条件下保存备用。
[0006]进一步地，所述步骤(3)中，所述PBS缓冲液的pH为7.2，PBS缓冲液中磷酸盐的 摩尔浓度为0.1M。
[0007]本发明的有益效果是，本发明采用纳米压印技术构造纳米尺寸杯状结构，并在纳米杯侧壁沉积纳米金颗粒，依赖纳米金属颗粒的静电吸附作用将气味结合蛋白Acer-ASP2 固定于纳米杯侧壁，制备了一种用于食用香精紫罗兰酮检测的纳米杯阵列传感器件。检测 时，目标分子紫罗兰酮与气味结合蛋白Acer-ASP2的特异性结合引起纳米杯侧壁光学折射 特性的改变，导致通过器件的透射光光谱的相应变化，实现对目标分子紫罗兰酮的检测。较 传统的紫罗兰酮检测手段，本发明在光学检测手段的高灵敏度和特异性的优点的基础上， 避免了光学检测所需的复杂光路，其操作简单便捷。本发明所述的生物纳米传感器灵敏度 下限为I U Mo
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1为本发明纳米杯阵列传感器件结构示意图；
图2为本发明纳米杯阵列传感器件的制备图；
图3为本发明纳米杯阵列传感器件测试示意图；
图4为本发明纳米杯阵列传感器件固定气味结合蛋白Acer-ASP2前后的透射光谱曲
线.图5为本发明纳米杯阵列传感器件对紫罗兰酮的特异性检测的透射光谱曲线；
图6为本发明纳米杯阵列传感器件对紫罗兰酮的特异性检测的透射峰变化统计柱状
图；
图7为本发明纳米杯阵列传感器件分别检测不同浓度的紫罗兰酮后，透射光谱峰值变 化与紫罗兰酮浓度的对数之间的线性关系图。
【具体实施方式】
[0009]以下结合附图及具体实施例对本发明作详细描述，但并不是限制本发明。
[0010]本发明用于紫罗兰酮检测的纳米杯阵列生物传感器件的制备方法，包括以下步 骤:
1、传感器件纳米杯阵列结构的加工。传感器纳米杯结构的加工采用标准的纳米压印技 术。传感器以厚度为250 iim，长为2cm的正方形PET (聚对苯二甲酸乙二醇酯)材料为基 底，首先在PET材料均匀涂敷UV固化胶作为粘附层，接着使用规则的锥形纳米柱阵列模板 在粘附层压印纳米杯几何结构阵列；而后使用DYMAX EC系列紫外光照射系统在室温下以 105mff/cm2功率密度照射60s使纳米杯阵列传感器件固化成型如图1所示。每个纳米杯I 的尺寸为上孔径p=350nm,底部孔径d=180nm,圆台高度h=500nm。
[0011]2、传感器件纳米金颗粒沉积。首先，用IM NaOH水溶液浸泡纳米杯阵列器件 5-10min(优选IOmin)，用于除去纳米结构表面的无机污染物。然后，在纳米杯侧壁上沉积 一层5-10nm厚的钛金属作为中间粘连层以提高纳米金颗粒的沉积效率。最后，如图2腔 体2所示，采用电子束蒸发的方式沉积90nm厚的纳米金颗粒层，单个纳米金颗粒的粒径为 10_30nmo
[0012]3、传感器件气味结合蛋白Acer_ASP2的固定。首先，依次使用无水 乙醇和超纯水超声清洗纳米杯阵列器件各5min。将处理后的器件浸泡在600
的气味结合蛋白Acer-ASP2溶液(溶剂为0.1M PBS缓冲液，pH=7.2,0.1M指的是PBS 缓冲液中磷酸盐的摩尔浓度，本申请中使用的PBS缓冲液均是指0.1M，pH=7.2的PBS缓冲液)中，室温下浸泡2h，取出后用PBS缓冲液反复清洗，洗去纳米结构表面的非静电吸附的 气味结合蛋白Acer-ASP2，用氮气吹干，形成如图2腔体3所示结构。获得所述的用于紫罗 兰酮检测的生物纳米传感器，放在4°C条件下备用。
[0013]以上每一步处理完毕后，都需要对纳米阵列器件进行透射光谱扫描用于对传感器 件进行光学表征和对气味结合蛋白Acer-ASP2的固定情况进行验证。对纳米阵列器件的 光学检测原理如图3所示，CCD (电荷耦合元件)镜头4、纳米杯阵列传感器件7与氙灯光 源8被依次从上到下置于一条直线上。光束由氙灯光源8发出，透过传感器件7发生改 变，最终由CCD镜头采集接收。在对目标物质溶液的液相检测时，需在器件表面上覆盖相 应大小的盖玻片5形成一层薄薄液体6以减少液体本身对光学透射的影响。实际检测中， 以分光光度计作为仪器平台对传感器件进行透射光谱扫描。具体测试参数为:光谱扫描 范围为320nm-1000nm,扫描步进为lnm。气相条件下,传感器件中纳米杯侧壁固定气味结 合蛋白Acer-ASP2前后得到的透射光谱曲线如图4所示。从图中可以看出，气味结合蛋白 Acer-ASP2固定后,透射光谱中的透射峰幅度明显下降，出峰位置从532nm移动至551nm,出 现红移现象。说明在器件纳米杯侧壁上已成功地固定了气味结合蛋白Acer-ASP2。
[0014]用本发明的方法制备的纳米杯阵列传感器件可用于食用香精紫罗兰酮的检测:纳 米杯阵列传感器件制备好之后，使用紫罗兰酮类似物丁二酮作为阴性对照验证传感器件的 特异性。分别在3片不同的传感器件表面滴加10 mM紫罗兰酮、阴性对照10 mM丁二酮溶液 (溶剂皆为甲醇)和空白对照甲醇，37°C下处理10 min，之后用PBS缓冲液反复清洗，洗去非 特异性结合在气味结合蛋白Acer-ASP2上的分子。使用分光光度计分别测试相应的透射光 谱，具体测试参数为:光谱扫描范围为320nm-1000nm,扫描步进为lnm。结果如图5所示,可 见添加紫罗兰酮的传感器件的透射光谱由于紫罗兰酮分子与气味结合蛋白Acer-ASP2特 异性结合与空白对照相比发生了显著的下降。而阴性对照丁二酮的透射光谱则与空白对照 (甲醇溶液)近似。将这组实验重复20次，统计紫罗兰酮和丁二酮与空白对照透射光谱透射 峰的幅值差。结果如图6所示，紫罗兰酮引起的器件响应远大于丁二酮，说明本发明纳米杯 阵列传感器件对紫罗兰酮检测具有良好的特异性。
[0015]使用不同浓度的紫罗兰酮溶液(浓度范围为10_6?10_2M，溶剂为甲醇)对传感器件进 行测试以确定传感器件检测的线性范围及检测下限，分别在不同的传感器件表面滴加不同 浓度的紫罗兰酮溶液，37°C下处理lOmin，之后用PBS缓冲液反复清洗，洗去非特异性结合 在气味结合蛋白Acer-ASP2表面的紫罗兰酮分子。以分光光度计作为仪器平台对不同浓度 施加的传感器件的透射光谱进行测试，测试参数如上:光谱扫描范围为320nm-1000nm，扫 描步进为lnm。系列实验重复10次，对不同浓度紫罗兰酮引起的透射光谱透射峰幅值改变 进行统计。以光谱透射峰幅值的变化值为纵坐标，紫罗兰酮浓度的对数值为横坐标，制作线 性曲线，结果如图7所示。线性关系公式为Ap= 0.20241g[C]+1.333，线性度为0.97。表 明传感器件在10_6?10_2M浓度范围，透射峰值变化A p与浓度对数呈线性，最低检测下限为 I 。
【权利要求】
1.一种用于紫罗兰酮检测的纳米杯阵列生物传感器件的制备方法，其特征在于，包括 以下步骤:(1)加工传感器件纳米杯阵列结构:首先在聚对苯二甲酸乙二醇酯材料上均匀涂敷UV 固化胶作为粘附层，接着使用锥形纳米柱阵列模板在粘附层压印纳米杯几何结构阵列；而 后在室温下以105mW/cm2功率密度照射紫外光60s，使纳米杯阵列传感器件固化成型；(2)沉积传感器件纳米金颗粒:首先，用IMNaOH水溶液浸泡纳米杯阵列器件 5-10min (优选IOmin)，用于除去纳米结构表面的无机污染物；然后，在纳米杯侧壁上沉积 一层5-10nm厚的钛金属作为中间粘连层，以提高纳米金颗粒的沉积效率；最后，采用电子 束蒸发的方式在粘连层上沉积90nm厚的纳米金颗粒层；(3)固定传感器件气味结合蛋白(Acer-ASP2):首先，依次使用无水乙醇和超纯水 超声清洗步骤(2)沉积了纳米金颗粒的纳米杯阵列传感器件各5min ;将清洗后的器件 浸泡在600 ii g/ml的气味结合蛋白(Acer-ASP2 )溶液中，室温下浸泡2h，气味结合蛋白 (Acer-ASP2)溶液的溶剂为PBS缓冲液，取出后用PBS缓冲液反复清洗，洗去纳米结构表面 的非静电吸附的气味结合蛋白(Acer-ASP2)，用氮气吹干，获得所述的用于紫罗兰酮检测的 纳米杯阵列生物传感器件，放在4°C条件下保存备用。
2.根据权利要求1所述用于紫罗兰酮检测的纳米杯阵列生物传感器件的制备方法，其 特征在于，所述步骤(3)中，所述PBS缓冲液的pH为7.2，PBS缓冲液中磷酸盐的摩尔浓度 为 0.1M0
【文档编号】G01N21/25GK103439255SQ201310335882
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月5日 优先权日:2013年8月5日
【发明者】刘清君, 张迪鸣, 王平, 卢妍利, 张倩 申请人:浙江大学