白菜转化植株外源基因以多拷贝形式插入，见图9(1、2)，阳性质粒DNA也出现了杂交信号，如图9(4)，大白菜非转化植株则没有杂交信号出现，见图9(3)。至此，我们已经完全证明了外源基因成功的整合到了大白菜的基因组中。
[0066]实施例7、再生阳性植株倍性鉴定过程
待再生阳性植株生根后，将再生植株移栽到温室进行培养，温室内温度白天应为20-25°C，晚间温度应为5-10°C。
[0067]我们主要利用流式细胞仪对再生植株进行倍性鉴定(图10)，筛选出双单倍体植株。取直径为l_2cm大小的新鲜嫩叶放入培养皿内，加入2.0 mL Chopping Buffer缓冲液(15 mmol.L—1三羟甲基氨基甲烷，2 mmol.L ―1乙二胺四乙酸二钠，0.5 mmol.L ―1精胺，80mmol.L—1氯化钾，20 mmol.L ―1氯化钠，0.1% [v/v]聚乙二醇辛基苯基醚和15 mmol.L—1二巯基乙醇，PH 7.5)，用手术剪刀将叶片剪碎，吸取上清液，用300目筛网将样品过滤到离心管内，100rpm离心lOmin，离心后弃上清，沉淀加ImL PI (碘化丙啶)染液，混勾避光染色15min后，将样品用500目筛网过滤到上样管中，混匀上机检测，20s后分析仪自动形成代表该样品倍性的DNA含量峰值图；以已知二倍体的大白菜‘FT’为对照，使对照的DNA吸收峰处在200道(X轴)位置，每个待测植株分别测定3次，DNA吸收峰值处在X轴200道的样本即为二倍体，而峰值处在100为单倍体，既有200峰值也有400峰值或者既有400峰值也有800峰值的则为嵌合体。
[0068]Chopping Buffer缓冲液包含15 mmol.I/1三轻甲基氨基甲烧，2 mmol.L-1乙二胺四乙酸二钠，0.5 mmol.171 精胺，80 mmol ?厂1 氯化钾，20 mmol ?1^1氯化钠，0.1% [v/v]聚乙二醇辛基苯基醚和15 mmol.L—1 二巯基乙醇，pH为7.5。
【主权项】
1.一种借助细胞穿透肽和小孢子培养建立大白菜遗传转化体系的方法，其特征在于过程包括: (1)进行分离纯化小孢子:在大白菜开花期，选取其长度为2-4mm的未开放花蕾，花蕾在超净工作台内经浓度75%乙醇溶液，浓度0.1% HgCl2溶液消毒后，再用无菌水冲洗3次；将消毒后的花蕾在85培养基中进行分离纯化，收集得到的沉淀物即为纯净小孢子；将纯化后的小孢子用NLN-13培养基稀释后分装入直径60 mm的无菌培养皿内，置入33°C恒温箱中，热激预处理24h ； 其中，B5培养基为含130g.L—1蔗糖，PH值为5.8的^培养基，NLN-13培养基为含130g.Γ1 蔗糖，添加激素 0.05mg.L 6-BA 和 0.05mg.Γ1 NAA, PH 值为 5.8 的 NLN-13 培养基; (2)转染小孢子的基因表达组件的获得:将载体pBI221-GFP质粒DNA转入大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，并在添加氨苄青霉素的LB培养基上进行扩大培养；以2μ?菌液为模板，用引物PI GATGGTTAGAGAGGCTTACGCAG，p2 CACAATAAAGTGACAGATAGCTGGG，p3 AGT T CA CCT TGA TGC CGTTC 和 p4 GTG CTT CA G CCG CTACCC 进行 PCR 扩增，再用紫外凝胶成像系统拍照鉴定；使用天根无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒DNA提取，将质粒DNA利用限制性内切酶AiJ进行酶切反应；采用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒回收用于转染的目的DNA表达片段； LB培养基包含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，用氢氧化钠溶液调pH至 7.0 ; (3)获取用于小孢子转染的体外复合物:将10PL含有Mg目的DNA表达片段的溶液与ΙΟΟμ?含有4Pg细胞穿透肽的溶液混合，室温反应15分钟后再向200μ?混合液中加入4μ?无RNA酶的DNA酶，室温放置15分钟，立即放置冰上终止反应；以未加细胞穿透肽的DNA片段作为空白对照；然后用天根通用型DNA纯化回收试剂盒回收反应产物，用质量体积比为I %的琼脂糖凝胶进行电泳检测； (4)小孢子转染与培养过程:100μ?含有Mg目的DNA表达片段的溶液与ΙΟΟμ?含有4Pg细胞穿透肽的溶液混合反应后，将200μ?反应混合物添加到经热激预处理的小孢子悬浮液中，再置于33°c恒温箱中继续热激处理24h，最后转移至25°C培养箱暗培养；将得到的胚状体转接到MS培养基上进一步培养获得小孢子再生植株； 获得小孢子再生植株后，再进一步将再生植株接种到植株生根的MS培养基上进行人工诱导生根培养； 诱导再生植株的MS培养基为含30g.L—1蔗糖，7.5g.L ―1琼脂，pH值为5.8，未添加任何激素的MS培养基； 诱导再生植株生根的MS培养基为含30g.L—1蔗糖，5.5g.L ―1琼脂，0.1mg.L ―1 NAA, pH值为5.8的MS培养基； (5 )对再生植株进行转基因鉴定:在再生植株继代培养的过程中，于超净工作台中取出再生植株的叶片，利用天根新型植物基因组提取试剂盒提取大白菜转化与未转化植株的基因组总DNA，然后通过1PL的PCR反应体系进行扩增反应，产物经质量体积比为I %的琼脂糖凝胶电泳分离，紫外凝胶成像系统检测； 于超净工作台中，从三角瓶里取PCR阳性再生植株的嫩叶，采用新型植物RNA提取试剂盒提取大白菜总RNA，然后进行反转录PCR扩增反应，产物经质量体积比为1%的琼脂糖凝胶电泳分离，紫外凝胶成像系统检测； 于超净工作台中取出阳性与非转化再生植株的幼叶，用Fluor Cam便携式Chl/GFP荧光仪和激光共聚焦显微镜对PCR阳性转化植株进行检测； 采用罗氏地高辛标记试剂盒II对阳性植株进行Southern Blot检测； ΙΟμ? 的 PCR 反应体系包含 0.5μ? 模板 DNA，?μ?ΙΟΧ buffer 缓冲液，0.8PLdNTPs，0.5μ?引物 plp2 或 ρ3ρ4，0.2KLTaq DNA 聚合酶； (6)利用流式细胞仪对再生植株进行倍性鉴定:取直径为l_2cm大小的新鲜嫩叶放入培养皿内，加入2.0 mL Chopping Buffer缓冲液，用手术剪刀将叶片剪碎，吸取上清液，用300目筛网将样品过滤到离心管内，100rpm离心lOmin，离心后弃上清，沉淀加ImL PI (碘化丙啶)染液，混匀避光染色15min后，将样品用500目筛网过滤到上样管中，混匀上机检测，20s后分析仪自动形成代表该样品倍性的DNA含量峰值图；以已知二倍体的材料为对照，使对照的DNA吸收峰处在X轴200道位置，每个待测植株分别测定3次，DNA吸收峰值处在200道的样本即为二倍体，而峰值处在100为单倍体，既有200峰值也有400峰值或者既有400峰值也有800峰值的则为嵌合体； Chopping Buffer缓冲液包含15 mmol.L4三轻甲基氨基甲烧，2 mmol.厂1乙二胺四乙酸二钠，0.5 mmol.L—1 精胺，80 mmol.L ―1 氯化钾，20 mmol.L—1 氯化钠，0.1% [v/v]聚乙二醇辛基苯基醚和15 mmol.L—1 二巯基乙醇，pH为7.5。
【专利摘要】本发明属于植物细胞工程技术和分子生物学领域，具体涉及一种借助细胞穿透肽和小孢子培养建立大白菜遗传转化体系的方法，利用细胞穿透肽的穿膜功能，先在体外合成转染复合物，再将复合物添加到分离出的小孢子悬浮液中，最后利用游离小孢子培养技术获得再生植株并对再生植株进行鉴定。该方法旨在建立基于游离小孢子培养的大白菜遗传转化体系，为大白菜遗传育种提供研究平台,并为大白菜功能基因组学研究奠定方法基础。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-87, A01H4-00
【公开号】CN104818296
【申请号】CN201510154857
【发明人】冯辉, 孟茜, 刘志勇, 章云, 李承彧, 冀瑞琴, 王玉刚
【申请人】沈阳农业大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年4月3日