制备和筛选表达双特异性抗体细胞株的方法

制备和筛选表达双特异性抗体细胞株的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及抗体制备领域，特别是涉及一种制备和筛选表达双特异性抗体细胞株 的方法。
【背景技术】
[0002] 双特异性抗体（bispecificantibody，heteroconjugateantibody)是一类具 有双功能的抗体分子，两价抗体中的Fab段具有不同特异性，能与不同的配体结合。抗肿 瘤和抗免疫活性细胞CD16或CD3的双特异性抗体，不仅具有激活NK细胞或T细胞作用， 而且可以通过抗肿瘤的Fab段特异性结合肿瘤细胞发挥作用，提高局部NK细胞或T细胞 浓度，增强效应分子杀伤肿瘤能力。也可通过抗体与某些细胞因子融合制备免疫细胞因 子（immunocytokine)，加强肿瘤细胞附近细胞因子浓度，激发机体免疫功能，有效地杀伤肿 瘤，减少毒副作用。另外，也可以应用人源性抗肿瘤单抗或人源性Fc段和鼠源性Fab段的 嵌和性抗体，克服鼠源性抗体免疫原性，增强抗体介导细胞毒作用，达到杀伤肿瘤作用。双 特异性抗体中包含着两种不同识别特异性抗原的Fab段，通过特异结合肿瘤抗原同时结合 不同效应细胞和分子，达到有效杀伤肿瘤的作用。
[0003] 目前，中国仓鼠卵巢细胞（CH0(Cricetulusgriseus,hamster,Chinese,ovary)广 泛用于生产抗体，通常高产的细胞株一方面是通过甲氨蝶呤（methotrexate,MTX)或者蛋 氨酸亚氨基代砜（methioninesulfoximine，MSX)进行加压扩增来得到，另一方面也有很多 报道通过基因工程来得到高产细胞株。许多公司通过构建高转染效率的质粒如引入慢病毒 载体（lentiviralvectors(LVs))来增强外源基因的整合效率，从而提高抗体产量或者通 过增加增强子及隔离子来增强启动子的活力进而寻找高产细胞株；也有些公司改良转染方 式，如采用Ca3(P04)2试剂、PEI试剂或电穿孔等转染手段来提高转染效率等等，通过以上方 法提高了转染效率后，从中筛选出找出稳定高产细胞株，进入下游的放大生产，仍需要一个 漫长的过程。从传统的实验流程上来看，该过程通常需要6到12个月才能得到稳定的细胞 株系，且需要消耗大量的人力物力，最终也不一定能够获得理想的高产细胞株。因此在大规 模生产生物制品中，除了构建良好的高表达的质粒载体，提高转染效率等途径外，还需要找 到一种方便快捷的能够提前筛选出高产细胞株，以及后期监测细胞株稳定性的方法，这样 不仅能够缩短试验周期，并且可以减少人力物力的投入，这也是制备双特异性抗体成功的 关键。
[0004]目前，缺少一套完善的能够早期筛选、鉴定稳定表达双特异性抗体细胞株的方法； 大多数公司通过外源的包被来检测并筛选高产克隆细胞株，但是不能够完全真实地反映克 隆细胞株的表达状态。

【发明内容】

[0005] 因此，为了解决目前筛选表达双特异性抗体细胞株稳定性方法耗时长，鉴定过程 繁琐，且准确性不高等不足之处，本发明提供一种新的制备和筛选表达双特异性抗体细胞 株的方法。
[0006] 本发明的关键在于所使用的质粒为双启动子质粒，且引入了荧光蛋白作为指示标 签。荧光蛋白家族是从水螅虫纲和珊瑚类动物中发现的分子量为20_30kD的一类同源性蛋 白，主要包括绿色荧光蛋白和它的一些突变体，如蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝绿荧光 蛋白等等，还有从珊瑚中发现的红色荧光蛋白。它们具有自动发光、易检测等特点，在生物 中它们常常作为报告基因。
[0007] 内部核糖体进入位序列（internalribosomeentrysite,IRES)，是一段核酸序 列，它的存在能够使蛋白质翻译起始不依赖于5'帽结构，从而使得直接从信使RNA(mRNA) 中间起始翻译成为可能。它可在同一个载体中协同共表达两个目的基因，无需担心共转染 的效率及其他共转染过程中可能产生的问题。当报告基因与目的基因协同共表达，其对目 的蛋白生物活性的影响最低。常用构建于真核生物双顺反子（bicistronicmRNA)中间， 如此一来，第一个蛋白通常靠5'帽子结构起始翻译，而第二个蛋白则依靠IRES起始翻译。 IRES前后的两个蛋白的表达通常是成比例的，因此可以根据其中一个报告基因的表达情况 来反映另外一个蛋白的表达情况。
[0008] 本发明可以用于筛选表达双特异性抗体CH0细胞系。其中，双特异性抗体包括两 个结构单元：单元一和单元二。单元一有两种形式，其一为两条多肽如重链轻链配对，其二 为一条多肽如可变区片段单链（ScFv，singlechainvariablefragments)或者ScFv与重 链恒定区融合蛋白，与抗原一特异结合；单元二具有与单元一相同的两种形式，但单元二与 单元一的形式可以相同，也可以不同。每个单元构建在一个双启动子表达载体上，若是两条 多肽形式，则荧光蛋白利用内部核糖体进入位序列连接在一条多肽的C端；若是一条多肽 形式，则焚光蛋白直接插入到载体的另一个启动子下游多克隆位点处（multiplecloning site，（MCS))。本发明通过在表达双特异性抗体的双启动子双质粒系统（质粒A和质粒B， 均为双启动子载体）上进行改造。其中，质粒A(图1)表达单元A，含有一条多肽，将荧光蛋 白A(FPA)的cDNA连入表达单元A的质粒A的空闲启动子下游多克隆位点中，质粒B(图3) 表达单元B，含有两条多肽，将内部核糖体进入位序列、荧光蛋白B(FPB)的cDNA依次连入 表达单元B的质粒B中的任一条多肽后面；质粒A和质粒B共转染哺乳动物细胞中共表达 后，通过流式细胞仪分析细胞的荧光情况，来判断细胞中该双抗的两个单元是否均表达，并 且通过直接检测内源的荧光信号，根据荧光信号强度来筛选高产双特异性抗体的细胞株。
[0009] 本发明提供的制备和筛选表达双特异性抗体细胞株的方法，其包括以下步骤：
[0010] 步骤1 :构建表达双特异性抗体的的两个质粒，两个质粒都含双启动子，其中一个 质粒表达的蛋白为特异结合肿瘤抗原的一条或两条多肽；另一个质粒表达的蛋白为特异结 合免疫活性细胞抗原的一条或两条多肽；所述两个含双启动子的质粒还分别表达一种不同 的荧光蛋白；若质粒表达的蛋白是两条多肽形式，则荧光蛋白利用内部核糖体进入位序列 连接在一条多肽的C端，若是一条多肽形式，则荧光蛋白直接插入到载体的另一个启动子 下游多克隆位点；
[0011] 步骤2 :将步骤1中得到的两种重组质粒进行转化、培养和提取；
[0012] 步骤3 :将步骤2中提取的两种重组质粒共转染至宿主细胞中；
[0013] 步骤4 :筛选表达双荧光的阳性单克隆细胞株。
[0014] 在一种实施方式中，上述步骤1中是选择表达载体的构建，分别构建单元A-FPA， 单元B-IRES-FPB表达载体。根据单元A、B、IRES、FPA、FPB基因序列及载体中的多克隆 位点设计引物，其中将FPA这段基因用DNA聚合酶扩增出来后，切胶回收，分别酶切质粒A 和FPA回收产物，将FPA插入到质粒A中，由此得到的新的质粒记为质粒ANF(图2)，单元 B-IRES-FPB分别进行两次PCR后，切胶回收，随后进行重叠PCR，切胶回收后，分别酶切单 元B-IRES-FPB片段，和质粒B，即用单元B-IRES-FPB代替原始质粒中的单元B，由此得到的 新质粒记为质粒BIF(图4)。
[0015] 在一种实施方式中，若所述质粒表达的蛋白为一条多肽，则质粒上一个启动子用 于起始转录蛋白单元，另一个启动子用于起始转录焚光蛋白；若质粒表达的蛋白为单元为 两条多肽，则质粒上的一条多肽的DNA编码序列的3'通过IRES连接荧光蛋白的DNA编码 序列。
[0016] 在一种实施方式中，在上述步骤2中还包括无菌纯化提取的质粒。将两种重组质 粒分别转化大肠杆菌，挑取单克隆菌落进行大量培养，利用无内毒素试剂盒提取质粒，检测 质粒浓度和纯度。将所提质粒进行无菌纯化，并进行无菌检测。
[0017] 在一种实施方式中，在上述步骤3中还包括添加筛选压力。在步骤3中将质粒ANF 和质粒BIF共转染至哺乳动物细胞中，转染后两天添加相应的筛选压力。筛选压力可以为 嘌呤霉素、潮霉素或甲氨蝶呤。
[0018] 在一种实施方式中，在上述步骤4中用流式细胞仪或者荧光显微镜进行筛选。培 养2周后，筛选高产细胞株，用流式细胞仪或者荧光显微镜分选表达阳性单克隆细胞。
[0019] 在一种实施方式中，还包括将筛选后的阳性单克隆细胞株进行扩大培养，用流式 细胞仪或荧光显微镜检测其荧光强度。将分选后的单克隆细胞培养，扩大培养后，用流式细 胞仪或荧光显微镜检测检测其荧光强度，用ELISA检测其抗体产量，比较二者之间的联系。
[0020] 在一种实施方式中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是中国仓 鼠卵巢细胞。
[0021] 在一种实施方式中，所述荧光蛋白能够正确指示转染后蛋白表达情况，可以为绿 色荧光蛋白，红色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，橙色荧光蛋白或蓝色荧光蛋白等等。
[0022] 在一种实施方式中，根据上述方法制备和筛选得到的表达双特异性抗体细胞株。
[0023] 在一种实施方式中，质粒ANF使用的载体为Freedom?pCHO1.OExpression Vector(简称pCHO,购自Lifetechnologies，货号A13696-01)，但需要进行改造，其中将含 有嘌呤霉素抗性基因替换为潮霉素（