专利名称：对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能降解玉米赤霉烯酮的菌株及其应用，尤其是一种对玉米赤霉 烯酮毒素降解的菌株及其应用。
背景技术：
玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ΖΕΑ)是由镰刀菌产生的一种类雌激素样真菌毒 素，其化学名为6-(10_羟基-6-氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内酯，广泛存在于霉变 的玉米、高粱、小麦、燕麦、大麦等谷类作物以及奶制品中。产生玉米赤霉烯酮最常见 菌属是禾谷镰刀菌，此外为三线镰刀菌、木贼镰刀菌、雪腐镰刀菌、粉红镰刀菌等。研 究表明，玉米赤霉烯酮具有很强的生殖毒性，能降低怀孕动物的胚胎成活率及新生胎儿 的出生重，导致动物的生产性能下降；而且该毒素，对肝脏及肝细胞具有强烈的毒害作 用，具有免疫抑制，对相关肿瘤的发生发展起促进作用。由于饲料和食品生产中所用的谷物(如玉米、小麦)是ZEA产生的最好基质，所 以谷物在田间、收获过程、收获后储藏期间以及饲料和食品成品储存、使用等诸多环节 中，都有可能受到ZEA的污染。王若军(2003)对全国饲料原料及配合饲料检测结果显 示，玉米中ZEA检出率达100%，含量范围4.40 368.13 μ g/kg，平均104.99 μ g/kg ； 蛋白质饲料中检出率达92.9%，含量范围0 476.0μ§/1^，平均110.0 μ g/kg ；配合饲料 中检出率达100%，含量范围39.22 230.30 μ g/kg，平均83.96 μ g/kg。由于玉米赤霉烯酮毒素在谷物中普遍存在，并且具有很大的危害性，因此找到 一种合适的能去除或降低该毒素毒性的方法显得尤为重要。目前对ZEA毒素采用的脱 毒处理方法很多，包括石灰水浸泡法、氯化法、去皮法、脱胚去毒法、化学处理法、使 用吸附剂、脱霉剂等，虽然所有的这些处理都在一定程度上减轻毒素污染，但其最大的 不足是去毒效果有限、可能造成重要营养物质的丢失、成本较高等。因此该领域有关 人士认为脱毒的最佳方法是生物脱毒，即在温和条件下，不用有害的化学药品，不会造 成营养价值的丢失，也不会降低适口性，而使玉米赤霉烯酮毒素脱毒。由于微生物数量 大、种类多，基因资源丰富，降解有机污染物的潜力很大，几乎所有导致环境污染的有 机物都能被微生物所分解，而且干净彻底、无二次污染。因此，微生物去毒是目前消除 玉米赤霉烯酮毒素污染的最好办法。我国是一个植物病害的重发区，而且在农产品的晾晒和储备方面的设备和技术 还是比较落后，这就造成我国农产品中的毒素含量偏高，毒素的存在除了严重危害粮食 的产量和品质，对人畜的健康，造成严重威胁以外，还限制着我国农产品的出口贸易。 对于毒素的处理国内还没有切实可行的方法，市场上一些去毒素产品如天然霉菌毒 素吸附剂，微生物去毒剂等也是从国外进口的，进口产品的高昂价格阻碍了这些产品的 广泛应用。综上所述，为了保障人们的食品安全和身体健康，并保证农产品的顺利出口， 有必要分离筛选高效降解玉米赤霉烯酮的菌株，研究其生物学特性，降解特性以及对玉米赤霉烯酮的解毒机理，并且把降解菌株和适当的材料结合，选择合适的剂型，制成霉 菌去毒剂，进一步研究霉菌毒素去毒剂作为饲料添加剂和植物抑菌去毒剂的去毒效果。 最终为解决饲料中毒素污染问题，提高粮食的使用效率，保证畜牧业的安全生产，并对 粮食产量和食品质量安全控制起到很大的推动作用。
发明内容
本发明的目的在于针对粮食生产和饲料加工和保存过程中玉米赤霉烯酮毒素 广泛污染的问题，开发研制出能对玉米赤霉烯酮降解的菌株及其应用。本发明的目的是这样实现的一株对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株，其特征在 于该菌株的保藏号为CCTCC NO: M2010053,其生物学特性为菌株在营养肉汁琼脂 平板上，30°C，培养24h:菌体呈杆状，0.68 μ mX 2.13 3.22 μ m，革兰氏染色阳性； 芽孢椭圆形，中生，孢囊不膨大；培养48h:菌落乳白色，干燥，不规则，扁平，不透 明，边缘不整齐；能利用的碳源有甘油、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、葡萄糖、果 糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-D-葡萄糖苷、苦杏仁甙、七叶灵、柳 醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、淀粉、糖原，不能利 用的碳源有甘油、赤癣醇、D-阿拉伯糖、L-木糖、阿东醇、β-甲基-D-木糖苷、半 乳糖、山梨糖、鼠李糖、卫茅醇、α-甲基-D-甘露糖苷、N-乙酰-葡糖胺、熊果甙、 菊糖、松三糖、木糖醇、龙胆二糖、D-松二糖、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩藻糖、 L-岩藻糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸盐、2-酮基-葡萄糖酸盐、5-酮 基_葡萄糖酸盐。该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为HM372880。一种上述能对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株的应用，其特征在于a)将菌株原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上获得试管 种备用；b)将试管种置于含有种子培养基的摇瓶中振荡培养至对数期，获得菌种；c)将上述培养好的菌种接种入含有种子培养基的种子罐，培养至对数生长期， 获得种子液； d)将获得的种子液接种入含有发酵培养基的生产罐发酵培养，出罐形成能对玉 米赤霉烯酮毒素降解的液体菌剂。在能对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株的应用中所述的种子培养基由下列组分 按照体积比组成的营养肉汤培养基蛋白胨0.5%，牛肉膏3%，NaCl 0.5%,种子培养 基的pH为7.0 7.2;所述的发酵培养基由下列组分按照体积比组成葡萄糖1.0%， (NH4)2SO4 0.1%, K2HPO4 0.2%, MgSO4 0.02%, NaCl 0.01%, CaCO3 0.3%,蛋白胨 0.05%,蒸馏水适量；发酵培养基的pH为7.2 7.5。在能对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株的应用中所述的种子培养基需要121°C 高压湿热灭菌后冷却至30 35°C使用；所述的菌种按种子罐中种子培养基的10%接种量 接种入种子罐；所述的种子液按生产罐中发酵培养基的10%接种量接种入生产罐。在能对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株的应用中在种子罐的种子培养和生产罐 的发酵培养过程中无菌空气的通气量为1 0.6 1.2，搅拌速度为180 240转/分，培 养温度为30 35°C，它们的培养时间分别为48 60小时，发酵结束后获得液体菌剂，液体菌剂中菌体数量至少达到IO9个/ml。在能对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株的应用中将所述的液体菌剂稀释后喷施 于到谷物中，降解谷物中的玉米赤霉烯酮毒素，稀释后的液体菌剂中菌体数量至少达到 IO7 个/ml。在能对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株的应用中将所述的液体菌剂与采用泥炭 或粘土吸附剂按1 4的重量比吸附，形成固体菌剂。在能对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株的应用中所述的吸附剂为泥炭或粘土。在能对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株的应用中在谷物中按照重量比5%加入 固体菌剂均勻混合，降解谷物中的玉米赤霉烯酮毒素；或在饲料中按照重量比5%加入 固体菌剂均勻混合，降解饲料中的玉米赤霉烯酮毒素。在能对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株的应用中所述的谷物为玉米，或小麦， 或大麦，或稻谷，或高粱，或小米。本发明的优点在于利用保藏号为CCTCC NO M2010053的菌株降解玉米赤 霉烯酮毒素，在解决毒素污染的过程中，不存在二次污染，从而提高农产品的质量，确 保人畜的食用安全；使用保藏号为CCTCC NO : M2010053的菌株生产降解玉米赤霉烯 酮毒素的各种制剂，具有生产使用成本低，使用安全。
图1是ZDS-I液体菌剂在含有毒素的液体培养基中对玉米赤霉烯酮毒素降解的 效果图；图2是是ZDS-I固体制剂在固体饲料中对玉米赤霉烯酮毒素降解的效果图。
具体实施例方式实施例1Bacillus sp.ZDS-1 的获得从江苏省农业科学院的玉米地里采集土样，在实验室中用玉米赤霉烯酮毒素进 行多次传代富集培养(30°C，每周传代一次)，得到能够降解玉米赤霉烯酮毒素的菌悬 液，把菌悬液在LB培养基上进行涂布培养(30°C，3天)，在平板上挑取不同的菌落， 一一验证对玉米赤霉烯酮毒素的降解效果，最终获得能够降解玉米赤霉烯酮毒素的菌 株，并将它定义为Bacillus sp.ZDS-1，加入甘油，在_70°C冰箱保存。通过测定Bacillussp.ZDS-1 的生理生化特性，克隆Bacillus sp.ZDS-1 的 16SrDNA 序列并对该16SrDNA序列进行测序，把测序结果在Genbank进行BLAST比较，确定了 Bacillus sp.ZDS-1的系统发育进化地位。通过Bacillus sp.ZDS-1的生理生化特征结果和 系统发育进化地位等鉴定结果，最终把Bacillus sp.ZDS-1鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)(以下简称为ZDS-1)，并于2010年6月我们首次将ZDS-1的16S rDNA 登陆到Genbank，登陆号为HM372880。2010.03.13我们将Bacillus sp.ZDS-1寄存于中国武汉中国典型培养物保藏中心， 菌种保藏号为CCTCC NO: M2010053,主要生物学特性为菌株在营养肉汁琼脂平板上， 30°C,培养24h:菌体呈杆状，0.68μιηΧ2.13 3.22μιη，革兰氏染色阳性；芽孢椭圆形，中生，孢囊不膨大。培养48h:菌落乳白色，干燥，不规则，扁平，不透明，边缘 不整齐。能利用的碳源有甘油、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、葡萄糖、果糖、甘露 糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-D-葡萄糖苷、苦杏仁甙、七叶灵、柳醇、纤维 二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、淀粉、糖原，不能利用的碳源 有甘油、赤癣醇、D-阿拉伯糖、L-木糖、阿东醇、β-甲基-D-木糖苷、半乳糖、 山梨糖、鼠李糖、卫茅醇、α-甲基-D-甘露糖苷、N-乙酰-葡糖胺、熊果甙、菊糖、 松三糖、木糖醇、龙胆二糖、D-松二糖、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩藻糖、L-岩藻 糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸盐、2-酮基-葡萄糖酸盐、5-酮基-葡 萄糖酸盐。实施例2液体菌剂的制备种子培养基(营养肉汤培养基)为蛋白胨0.5%，牛肉膏3%，NaCl 0.5%,种 子培养基的ρΗ为7.0 7.2。发酵培养基为葡萄糖1.0%，(NH4)2SO4 0.1 %, K2HPO4 0.2 %, MgSO4 0.02%, NaCl 0.01%, CaCO3 0.3%,蛋白胨0.05%，蒸馏水适量；发酵培养基的ρΗ为 7.2 7.5。将ZDS-I菌株在种子培养基上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上获得 试管种备用。将试管种接种于含200mL种子培养基的IOOOmL摇瓶中，恒温振荡培养至对数 期，获得菌种。采用500升的种子罐，种子培养基投料量400升，投料完毕后121°C高压湿热灭 菌，冷却至33°C后，将上述培养好的菌种按种子罐中种子培养基的10%接种量接种入种 子罐，培养至对数生长期，获得种子液，期间搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量 为1 0.8，培养时间约48 60小时。生产罐容量为5吨，发酵培养基投料量4.0吨。投料后的生产罐l.lkg/cm2的 压力下，121°C高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35°C以下，将种子液按生产罐中发酵培养基 的10%接种量接种入生产罐发酵培养，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，生产 罐的培养过程中无菌空气的通气量为1 0.8-1.0，搅拌速度为240转/分，培养时间约 48 60小时，出罐后形成能对玉米赤霉烯酮毒素降解的液体菌剂。实施例3固体菌剂的制备1将实施例2生产出来的ZDS-I液体菌剂和采集来的过筛晒干的泥炭按照1 4的 重量比混合均勻后形成固体状，从而制成ZDS-I的固体菌剂。实施例4固体菌剂的制备2将实施例2获得的液体菌剂与市场上购买的粘土按照1 5的重量比混合后形成 固体状，从而制成ZDS-I的固体菌剂。实施例5ZDS-I液体菌剂对玉米赤霉烯酮毒素的降解效果
含有玉米赤霉烯酮毒素培养基为(NH4)2SO4 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L, K2HPO4 1.5g/L，MgSO4 0.02g/L, NaCl 0.5g/L,蒸馏水适量；培养基的pH值7.0。在培养基中
分别加入的玉米赤霉烯酮毒素含量为lOmg/L (从Sigma公司购买)。将含有玉米赤霉烯酮毒素的培养基分成对照组和试验组进行平行试验，将实施 例2获得的液体菌剂按照的接种量接入试验组中含有毒素的培养基中，对照组接入
由实施例2提供的无菌的发酵培养基，对照组和试验组均置于30°C，180r/min,摇床 培养48小时后分别取样，按1 1的比例加入甲醇混勻，过0.22 μ m液相色谱专用滤头 后，进行高效液相色谱检测，检测结果如图1，对照组的液体培养基中仍然存在大量的 玉米赤霉烯酮毒素，而试验组的液体培养基中已检测不到玉米赤霉烯酮毒素，表明经过 ZDS-I的作用能很好地降解液体培养基中的玉米赤霉烯酮毒素。实施例6ZDS-I固体制剂对饲料中玉米赤霉烯酮毒素的降解效果将ZEA感染的饲料分成对照组和试验组，将实施方案4制成的固体菌剂按照5% 的重量比加入到试验组饲料中，混勻，将对照组和试验组均按1 1的比例加入蒸馏水， 30°C作用2小时后，准确称取5g饲料样品于三角瓶中，加入30mL甲醇，50g/L NaCl溶 液20mL后于摇床(180r/min)充分混勻5min，然后超声提取30min，用滤纸过滤到分液 漏斗中，加入二氯甲烷(分3次，每次20mL)萃取，二氯甲烷层(下层)经无水硫酸钠 脱水并收集于磨口三角瓶中，经旋转蒸发仪蒸干后，用4mL甲醇溶解残渣，即得玉米赤 霉烯酮的粗提液，过自填硅胶柱进行纯化，洗脱液经氮吹浓缩后过0.22 μ m液相色谱专 用滤头后，进行高效液相色谱检测。结果见图2 对照组的饲料中仍然存在大量的玉米 赤霉烯酮毒素，而试验组的饲料中，玉米赤霉烯酮毒素含量明显降低，可见，ZDS-I固 体菌剂能很好地降解饲料中的玉米赤霉烯酮毒素，降解率可达70%。实施例7ZDS-I液体菌剂稀释后对谷物中玉米赤霉烯酮毒素的降解效果。将实施例2获得的ZDS-I液体菌剂用水溶液稀释100倍备用，稀释后的液体菌 剂中，菌体数量为IO7个/ml。将已经被ZEA感染的玉米分成对照组和试验组，将稀释100倍后的ZDS_1液体 菌剂按重量比1 1的比例喷洒到试验组中的玉米中，对照组按重量比1 1的比例喷洒 不含毒素的去离心水，对照组和试验组置于30°c作用2小时后，分别从对照组和试验组 准确称取5g样品于三角瓶中，加入30mL甲醇，50g/L NaCl溶液20mL后于摇床(180r/ min)充分混勻5min，然后超声提取30min，用滤纸过滤到分液漏斗中，加入二氯甲烷 (分3次，每次20mL)萃取，二氯甲烷层(下层)经无水硫酸钠脱水并收集于磨口三角瓶 中，经旋转蒸发仪蒸干后，用4mL甲醇溶解残渣，即得玉米赤霉烯酮的粗提液，过自填 硅胶柱进行纯化，洗脱液经氮吹浓缩后过0.22 μ m液相色谱专用滤头后，用高效液相色 谱检测玉米中玉米赤霉烯酮毒素的含量。结果见表1 表 权利要求
1.一株对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株，其特征在于该菌株的保藏号为CCTCC NO: M2010053,其生物学特性为菌株在营养肉汁琼脂平板上，30°C，培养24h 菌体 呈杆状，0.68μιηΧ2.13 3.22μιη，革兰氏染色阳性；芽孢椭圆形，中生，孢囊不膨 大；培养48h:菌落乳白色，干燥，不规则，扁平，不透明，边缘不整齐；能利用的碳 源有甘油、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山 梨醇、α-甲基-D-葡萄糖苷、苦杏仁甙、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜 二糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、淀粉、糖原；不能利用的碳源有甘油、赤癣醇、D-阿 拉伯糖、L-木糖、阿东醇、甲基-D-木糖苷、半乳糖、山梨糖、鼠李糖、卫茅醇、 α-甲基-D-甘露糖苷、N-乙酰-葡糖胺、熊果甙、菊糖、松三糖、木糖醇、龙胆二糖、 D-松二糖、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉 伯糖醇、葡萄糖酸盐、2-酮基-葡萄糖酸盐、5-酮基-葡萄糖酸盐；该菌株16SrDNA的 Genbank 登陆号为 HM372880。
2.一种如权利要求1所述的能对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株的应用，其特征在于a)将菌株原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上获得试管种备用；b)将试管种置于含有种子培养基的摇瓶中振荡培养至对数期，获得菌种；c)将上述培养好的菌种接种入含有种子培养基的种子罐，培养至对数生长期，获得 种子液；d)将获得的种子液接种入含有发酵培养基的生产罐发酵培养，出罐形成能对玉米赤 霉烯酮毒素降解的液体菌剂。
3.根据权利要求2所述的能对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株的应用，其特征在于 所述的种子培养基由下列组分按照体积比组成的营养肉汤培养基蛋白胨0.5%，牛肉膏 3%, NaCl 0.5%,种子培养基的pH为7.0 7.2 ；所述的发酵培养基由下列组分按照体积 比组成葡萄糖 1.0%，(NH4)2SO4 0.1%, K2HPO4 0.2%, MgSO4 0.02%, NaCl 0.01%, CaCO3 0.3%,蛋白胨0.05%，蒸馏水适量；发酵培养基的pH为7.2 7.5。
4.根据权利要求3所述的能对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株的应用，其特征在于 所述的种子培养基需要121°C高压湿热灭菌后冷却至30 35°C使用；所述的菌种按种 子罐中种子培养基的10%接种量接种入种子罐；所述的种子液按生产罐中发酵培养基的 10%接种量接种入生产罐。
5.根据权利要求2或3或4所述的能对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株的应用，其特 征在于在种子罐的种子培养和生产罐的发酵培养过程中无菌空气的通气量为1 0.6 1.2，搅拌速度为180 240转/分，培养温度为30 35°C，它们的培养时间分别为48 60小时，发酵结束后获得液体菌剂，液体菌剂中菌体数量至少达到IO9个/ml。
6.根据权利要求5所述的能对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株的应用，其特征在于 将所述的液体菌剂稀释后喷施于到谷物中，降解谷物中的玉米赤霉烯酮毒素；稀释后的 液体菌剂中菌体数量至少达到IO7个/ml。
7.根据权利要求5所述的能对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株的应用，其特征在于 将所述的液体菌剂与采用泥炭或粘土吸附剂按1 4的重量比吸附，形成固体菌剂。
8.根据权利要求7所述的能对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株的应用，其特征在于 所述的吸附剂为泥炭或粘土。
9.根据权利要求7或8所述的能对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株的应用，其特征 在于在谷物中按照重量比5%加入固体菌剂均勻混合，降解谷物中的玉米赤霉烯酮毒 素；或在饲料中按照重量比5%加入固体菌剂均勻混合，降解饲料中的玉米赤霉烯酮毒素。
10.根据权利要求6或9所述的能对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株的应用，其特征在 于所述的谷物为玉米，或小麦，或大麦，或稻谷，或高粱，或小米。
全文摘要
本发明涉及一株对玉米赤霉烯酮毒素降解的菌株，其特征在于该菌株的保藏号为CCTCC NOM2010053，该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为HM372880。应用时，将菌株制备成能对玉米赤霉烯酮毒素降解的液体菌剂或固体菌剂，用于降解谷物或饲料中的玉米赤霉烯酮毒素。本发明的优点是利用该菌株降解玉米赤霉烯酮毒素的过程中，不存在二次污染，从而提高农产品的质量，确保人畜的食用安全；使用该菌株生产降解玉米赤霉烯酮毒素的各种制剂，不仅生产使用成本低，而且使用安全。
文档编号A23L1/015GK102010838SQ201010266489
公开日2011年4月13日 申请日期2010年8月27日 优先权日2010年8月27日
发明者史建荣, 吴季荣, 徐剑宏, 林凡云, 王宏杰, 祭芳 申请人:江苏省农业科学院