专利名称：用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌及其分泌的活性蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及枯草芽孢杆菌，特别是涉及一种用于降解黄曲霉毒素B1、G1和Ml的枯 草芽孢杆菌及其所分泌的活性蛋白。
背景技术：
霉菌毒素是霉菌生长过程中产生的次级代谢产物。霉菌毒素污染一直是全球畜牧 业和食品工业的重大威胁。霉菌毒素具有高毒性，严重威胁动物的生产性能和人类健康，每 年给饲料工业和畜牧业生产带来巨大的经济损失。据联合国粮农组织(FAO)估计，全世界 谷物供应25%受真菌毒素污染而不能食用。目前对畜牧业威胁最大的霉菌毒素有黄曲霉 毒素、单端孢霉烯族毒素以及玉米赤霉烯酮等。霉菌毒素对畜牧业及人类产生如此严重的 危害，因此自上个世纪被发现以来，科学工作者便不断地研究霉菌毒素的预防和解毒、去毒 方法。传统的霉菌毒素去毒方法有物理和化学方法，包括氨化法、碱法、高温法、紫外线照射 法、超滤-渗滤法等，这些方法存在效果不稳定，营养成分损失较大，难以规模化生产等缺 点；目前还有添加霉菌吸附剂的办法，这种方法在吸附毒素的同时会吸附一些营养成分，也 不能彻底去除黄曲霉毒素的毒性，动物生产性能仍然受到很大的影响。因此，霉菌毒素污染 的控制急切需要一种高效率、特异性强、以及对饲料和环境没有污染的技术。微生物或生物 酶因其反应的准确性、有效性和环保性而成为人们关注的热点。
利用微生物脱毒的报道，多集中在近十年。国内研究不多，只有刘大岭等(真菌提 取液对黄曲霉毒素解毒作用的研究[J].广东药学院学报，1995，11 O) :92 94.)发现一 种真菌代谢产物具有降解黄曲霉毒素的作用。国外对黄曲霉毒素的研究报道比较多的集中 在乳酸菌、双歧杆菌、酵母菌和白腐真菌等，还有橙色黄杆菌、红球菌、假密环菌、根霉菌等。 对于乳酸菌、双歧杆菌和酵母菌的研究表明，大部分去除毒素的效率在50%以下，而且最关 键的是这种去除机制是可逆的结合，而不是对毒素的降解。其他一些细菌和真菌的解毒研 究表明，大部分菌的降解效率不高，降解效率受作用时间、溶液PH值、菌体数量、毒素浓度、 金属离子浓度等影响，尚未发现一种微生物能完全的不可逆的降解饲料中的黄曲霉毒素。
至今为止，未见关于枯草芽孢杆菌及其所产胞外酶能同时降解黄曲霉毒素Bi、Gl 和Ml的相关报道。发明内容
本发明的目的是提供一种用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏号为CGMCC No. 3609。及其所分泌的活性蛋白，
本发明的另一目的是提供上述枯草芽孢杆菌的培养方法及其所分泌的活性蛋白 的制备方法。
本发明的进一步目的是提供上述枯草芽孢杆菌及其所分泌的活性蛋白在降解黄曲霉毒素中应用。
所述枯草芽孢杆菌是从发霉饲料、深海土壤、海洋生物消化道中分离并筛选得到的Bacillus subtilis ANSB324。其分离筛选方法为以香豆素为唯一碳源进行初筛、再用 黄曲霉毒素Bl进行复筛得到。其细胞理化特征见表1:
表1.细胞理化特征
权利要求
1.枯草芽孢杆菌(Bacillussubti 1 is)ANSB324，其保藏编号为 CGMCC No. 3609。
2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，取所述枯草芽孢杆菌种 子液0. 5-2. 5ml，接种到50-100ml培养基中进行摇瓶发酵培养，所述培养基由如下组分组 成胰蛋白胨8-12g、酵母浸膏l_3g、葡萄糖l-30g、牛肉膏2-5g、氯化钠3_6g、磷酸氢二钠 2_5g、七水硫酸镁 0. 5-1. 5g、硫酸锰 l_3g、蒸馏水 800-1200mL, pH 值为 7. 0-7. 4。
3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，所述摇瓶发酵的条 件为发酵温度为30-40°C，发酵时间20-30h，pH值7. 0-7. 4，转速180-220r/min。
4.权利要求1所述枯草芽孢杆菌分泌的活性蛋白，其通过以下方法制备得到1)对枯草芽孢杆菌进行发酵培养；2)发酵结束后，离心除菌体，用萃取剂提取上清液中的活性蛋白，在0°C沉淀114h，然 后离心得到沉淀；其中，所用萃取剂为95 %甲醇、95 %乙醇、40 %硫酸铵溶液、60 %硫酸铵溶液或80 %硫 酸铵溶液；3)将得到的沉淀溶于PBS缓冲液，冻干浓缩即得活性蛋白。
5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌或权利要求4所述的活性蛋白在降解黄曲霉毒素中 的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用为降解饲料或食品中的黄曲霉 毒素BUGl和Ml0
7.一种降解黄曲霉毒素Bl的方法，其特征在于，取权利要求1所述枯草芽孢杆菌 的发酵液或权利要求6所述活性蛋白的PBS溶液600-900 μ 1，加入黄曲霉毒素Bl溶液 100-400 μ 1，将反应体系的pH值调节为6. 5-7. 5，在30_40°C反应2_72h。
8.一种降解黄曲霉毒素Gl的方法，其特征在于，取权利要求1所述枯草芽孢杆菌 的发酵液或权利要求6所述活性蛋白的PBS溶液600-900 μ 1，加入黄曲霉毒素Gl溶液 100-400 μ 1，将反应体系调整至pH值为6. 5-7. 5，在25_45°C反应48_72h。
9.一种降解黄曲霉毒素Ml的方法，其特征在于，取权利要求1所述枯草芽孢杆菌 的发酵液或权利要求6所述活性蛋白的PBS溶液600-900 μ 1，加入黄曲霉毒素Ml溶液 100-400 μ 1，将反应体系调整至pH值为6. 5-7. 5，在20-40°C反应36_72h。
10.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在抑制鸡白痢沙门氏菌和/或大肠杆菌和/或金 黄色葡萄球菌中的应用。
11.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在模拟胃液和/或模拟胆盐和/或75-90°C 高温环境中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis ANSB324 CGMCC No.3609，其所分泌的蛋白及应用。本发明还提供了所述菌株的发酵液或其分泌的蛋白用于降解黄曲霉毒素B1、G1和M1的方法，通过所述方法，枯草芽孢杆菌与黄曲霉毒素B1反应48小时后对B1的降解率达到85％，枯草芽孢杆菌与黄曲霉毒素G1反应72小时后对G1的降解率达到66％左右，枯草芽孢杆菌与黄曲霉毒素M1反应72小时后对M1的降解率达到68％左右，本发明的枯草芽孢杆菌及其所分泌的活性蛋白解毒活性高、特异性强、作用效果温和，适用于降解及去除饲料中的黄曲霉毒素。同时，本发明的枯草芽孢杆菌具有生物活性强、益生性和抗逆性能好等优点，不会破坏饲料中的营养成分。
文档编号A61K35/74GK102031234SQ20101053998
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月9日 优先权日2010年11月9日
发明者计成, 赵丽红, 雷元培, 马秋刚, 高欣 申请人:中国农业大学