一种定向降解酱油二次沉淀蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种定向降解酱油二次沉淀蛋白的方法，属于酱油酿造【技术领域】。本发明在大曲低盐发酵至3-15d时，添加以豆粕粉、花生粕粉、麸皮、玉米淀粉、面粉等为底物、以黑曲霉、米曲霉和红曲霉中的一种或数种为发酵菌种、以固态发酵法制备的粗酶制剂继续发酵3-10d后，补加食盐使酱醪食盐浓度达到15-25%（w/w），继续发酵1-5个月。以此工艺生产的酱油通过凝胶电泳检测证实导致酱油二次沉淀产生的碱性亚基消失。以常规工艺生产的酱油为对照，新工艺生产的酱油包装存放3个月后，其二次沉淀产生量比对照下降92%以上。本发明提供的方法是一种高效和经济的去除酱油二次沉淀、提高酱油质量和竞争力的方法。
【专利说明】一种定向降解酱油二次沉淀蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种定向降解酱油二次沉淀蛋白的方法，属于酱油酿造【技术领域】。
【背景技术】
[0002]2013年1-10月份我国酱油产量达612万吨，其总产量超过我国调味品总产量的50%，是我国调味品和食品工业的重要组成部分。近十年来我国酱油行业在生产技术、设备和科学研究等方面取得了一定的进步，使我国酱油的风味、企业的经济效益和形象不断改善。但随着我国人民生活水平的不断提高和国外(主要是日本、韩国)高档次酱油进入国内市场的影响，目前消费者不但要求酱油具有良好的调味、去腥和上色功能，而且对酱油的外观质量要求也越来越高(如是否有沉淀、长霉等)。近年来消费者对国产酱油投诉最多，也是我国酱油行业普遍存在的质量问题，即为酱油在储存和销售过程中的沉淀(酱油脚或二次沉淀)问题，其严重影响了产品的外观稳定性、消费者的购买欲和企业的形象，导致企业的竞争力下降。
[0003]目前，对酱油二次沉淀的主要成分、二次沉淀蛋白的分离、鉴定的初步研究结果显示蛋白质(25-27%)、糖类物质(16-26%)、脂肪(2%)、食盐(37%)是酱油二次沉淀的主要组成部分，其中蛋白质是酱油二次沉淀的最重要的有机物组成部分，是酱油二次沉淀形成的关键物质。研究结果还表明酱油二次沉淀蛋白是由大豆蛋白碱性亚基B3引起的，碱性亚基的高疏水性和高级结构的差异性(与可溶性对照蛋白质相比)是导致酱油二次沉淀形成的关键因素。
[0004]目前国外(日本和韩国)主要采用膜过滤截留酱油原液中大分子物质(蛋白质和多糖等)的方法减少酱油二次沉淀的形成，并取得了一定的效果。然而该方法具有膜运行成本高、无针对性(会截留一部分营养和呈味物质)及占用车间空间和增加劳动力成本等劣势，目前国内真正采用此方法以去除酱油二次沉淀的企业尚未见报道。而解决我国酱油二次沉淀问题已成为提高国产酱油产品质量和国内外市场竞争力亟待解决的问题。与国外膜过滤法相比，本发明的关键区别点在于本发明主要采用生物技术法经济和有针对性地高效降解导致酱油二次沉淀形成的蛋白质，显著减少酱油二次沉淀现象的形成和资源浪费。因此本发明具有重要的经济意义和社会意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了解决我国酱油的二次沉淀问题。具体地，本发明提供了一种高效和经济的降解导致酱油二次沉淀形成的关键蛋白质-大豆蛋白碱性亚基B3的方法。
[0006]本发明定向降解酱油二次沉淀蛋白的方法，包括如下步骤:
[0007](I)大豆或豆柏经常规润水、蒸煮、接种米曲霉制备大曲后，大曲在低盐下(3-12%NaCl, w/w)进行常温快速发酵3_15d得到醪液，充分释放大豆蛋白碱性亚基。
[0008](2)制备酶制剂:以豆柏粉、花生柏粉、麸皮、玉米淀粉、面粉中的一种或者多种为主要培养基，充分混合润水、121 °C蒸煮20min后接种曲霉菌种，接种量为1.0X 105-5.0X IO7个孢子/g底物，然后进行固态培养；固态培养条件如下:初始培养温度为24-35 °C，相对湿度85-100%，培养至10_30h时进行翻曲，控制温度24-35 °C ;培养至30-50h时降低相对湿度至65%-90%以促进目标蛋白酶的分泌；培养至35-70h使目标蛋白酶分泌量达到最大值，酶制剂制备结束。收集所得曲即为粗酶制剂，测定酶活、备用。
[0009](3)测定醪液(I)蛋白质含量，根据步骤(I)所得醪液蛋白质含量添加粗酶制剂，使蛋白酶酶活与醪液蛋白质之比控制在500-10000IU/g底物蛋白质，继续常温发酵3-10d。
[0010](4)补加食盐使酱醪食盐浓度达到15-25% (w/w)，继续常温发酵1_5个月。
[0011]所述步骤(I)所采用的食盐浓度优选3-8% (w/w)，低盐常温发酵时间为5-10d。
[0012]所述步骤(2)中培养基原料润水时，物料与水的质量比为1:0.7-1.2。
[0013]所述步骤(2)中接种的曲霉菌种为黑曲霉ATCC16404、米曲霉CCTCC NO:M2012265、米曲霉ATCC42149和红曲霉CCTCC NO:AF93208中的一种或数种。
[0014]所述步骤(2)以豆柏粉、花生柏粉、麸皮、玉米淀粉、面粉的混合物为主要培养基时，各物质质量比为:20-60:20-30:20-50:10-30:5-20。
[0015]所述步骤(2)以豆柏粉、麸皮、玉米淀粉、面粉的混合物为主要培养基时，各物质质量比为30-60:30-50:10-20:8-15,混合培养基润水质量比为1:0.8_1，接种的微生物为黑曲霉ATCC16404、米曲霉CCTCC NO:M2012265和红曲霉CCTCC NO:AF93208中的一种或数种(1.0X 105-5.0X IO7个孢子/g底物)；培养条件为初始温度24-32°C，相对湿度85_95%，培养至35-50h时降湿至相对湿度70-85%，总培养时间为35_60h。
[0016]所述步骤(3)酶制剂添加量优选500-5000IU/g底物蛋白质，继续低盐常温发酵5-10d。
[0017]所述步骤(4)醪液补加食盐，使醪液食盐含量达到18-25% (w/w)，继续常温发酵1-5个月。
[0018]本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果:
[0019]( I)不需要添加昂贵设备，如膜过滤设备(膜过滤设备的运行成本更高)等；(2)不需要对现有车间进行改造，节约成本；(3)关键在于从根本上高效降解导致酱油二次沉淀的蛋白质，同时增加酱油低分子量呈味物质，改善酱油外观质量的同时，也提高了酱油的内在品质；(4)所使用的菌种均为我国传统食品行业应用的微生物，安全且不影响酱油原有的色、香、味、体等质量指标。因此，本发明与现有技术相比，具有高效和经济等优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1采用本发明方法生产的酱油二次沉淀蛋白质降解情况注，I为大豆蛋白质对照，2 - 4为采用本发明方法生产的高盐稀态酱油二次沉淀蛋白降解情况，5-6为采用本发明方法生产的低盐固态酱油二次沉淀蛋白降解情况，M为标准品。
【具体实施方式】
[0021]下面结合实例对本发明的【具体实施方式】作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。
[0022]酱油二次沉淀蛋白的检测方法:酱油二次沉淀蛋白的检测采用SDS-PAGE电泳法。样品收集及处理:将酱油预冷至_7°C，在功率950W、频率20KHz的条件下超声8min，重新将样品预冷至-7°C，之后样品在相对离心力(RCF)为3600g时离心30min并收集沉淀。4倍体积去离子水洗涤沉淀并盛入截留分子量为3500Da的透析袋进行脱盐透析，得到高纯度酱油二次沉淀蛋白混悬液。将混悬液真空冷冻干燥得高纯度酱油二次沉淀蛋白。SDS-PAGE电泳法检测酱油二次沉淀蛋白方法参照文献(Gao Xianli, Sun Peng-fei, Lu Jian, etal.Characterization and formation mechanism of proteins in the secondaryprecipitate of soy sauce, European Food research and Technology，2013，237 (4):647-654X
[0023]蛋白酶测定方法:参照文献(GaoXianli, Zhao Haifengj Zhao Mourning, et al.Acomparative study on physicochemical properties of Chinese-type soy saucesprepared using pure koji and mixed kojis.African Journal of Biotechnology, 2010,9 (40):6740-6747)o
[0024]实施例1粗酶制剂的制备
[0025]以豆柏粉和玉米淀粉为主要培养基，充分混合润水、蒸煮(121°C /20min)后接种黑曲霉ATCC16404 (1.0X IO6个孢子/g底物)进行固态培养。固态培养条件如下:初始培养温度为28 V，相对湿度90%，培养至13h时进行翻曲，控制温度30°C ;培养至45h时进行降湿以促进目标蛋白酶的分泌；培养至55h使目标蛋白酶分泌量达到最大值，酶制剂制备结束，收集上述曲得到粗酶制剂。
[0026]实施例2高盐稀态法
[0027]大曲(大豆、豆柏、面粉、焙炒小麦)入池或落罐后,保持醪液中食盐浓度6%，低盐发酵10d，添加实施例1所制备的酶制剂，酶制剂添加量为3000IU/g底物蛋白质，继续低盐发酵6d。醪液补加食盐，补加量为使醪液食盐含量达到20% (w/w)，继续发酵5个月。醪液经滤纸过滤后采用SDS-PAGE电泳法测定发酵液中的酱油二次沉淀蛋白降解情况，同时将过滤后醪液进行巴氏杀菌后包装，常温储存3个月观察二次沉淀生成情况。SDS-PAGE电泳实验结果证明采用此发明方法生产的高盐稀态酱油其二次沉淀蛋白基本全部降解(见图1)，存放3个月之后的酱油也基本未观察到蛋白质沉淀。
[0028]相比以常规工艺生产的酱油，新工艺生产的酱油包装存放3个月后，其二次沉淀产生量比对照下降92%以上。
[0029]实施例3低盐固态法
[0030]大曲(豆柏、大豆、面粉、麸皮)入池或落罐后，保持醪液中食盐浓度5%，发酵温度42-45°C，低盐发酵4d，添加实施例1所制备的酶制剂，酶制剂添加量为5000IU/g底物蛋白质，继续低盐发酵5d。醪液补加食盐，补加量为使醪液食盐含量达到14% (w/w)，继续发酵I个月。醪液经滤纸过滤后采用SDS-PAGE电泳法测定发酵液中的酱油二次沉淀蛋白降解情况，同时将过滤后醪液进行巴氏杀菌后包装，常温储存3个月观察二次沉淀生成情况。SDS-PAGE电泳实验结果证明采用此发明方法生产的高盐稀态酱油其二次沉淀蛋白基本全部降解(见图1)，存放3个月之后的酱油也基本未观察到蛋白质沉淀。
[0031]相比以常规工艺生产的酱油，新工艺生产的酱油包装存放3个月后，其二次沉淀产生量比对照下降92%以上。
[0032]本发明是高效和经济的解决困扰我国酱油行业发展的二次沉淀问题的关键技术。因此本发明具有重要现实和经济意义。[0033]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一种定向降解酱油二次沉淀蛋白的方法，包括如下步骤: (1)大豆或豆柏经常规润水、蒸煮、接种米曲霉制备大曲后，大曲在3-12%NaCl条件下进行快速常温发酵3-15d得到醪液； (2)制备酶制剂:以豆柏粉、花生柏粉、麸皮、玉米淀粉、面粉中的一种或者多种为主要培养基，充分混合润水后接种曲霉菌种进行固态培养得到粗酶制剂； (3)测定步骤(I)所得醪液的蛋白质含量，根据其蛋白质含量添加粗酶制剂，使蛋白酶酶活与醪液蛋白质之比控制在500-10000IU/g底物蛋白质，继续常温发酵3-10d ； (4)补加食盐使酱醪食盐浓度达到质量分数15-25%，继续常温发酵1-5个月。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中固态培养条件如下:初始培养温度为24-35°C，相对湿度85-100%，培养至10_30h时进行翻曲，控制温度24_35°C ;培养至30-50h时降低相对湿度至65%-90%以促进目标蛋白酶的分泌；培养至35-70h使目标蛋白酶分泌量达到最大值，收集目标酶制剂得到粗酶制剂，测定酶活、备用。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)所采用的NaCl终浓度为质量分数3-8%，发酵时间为5-10d。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中培养基原料润水时，物料与水的质量比:1:0.7-1.2。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2冲接种的曲霉菌种为黑曲霉ATCC16404、米曲霉 CCTCC NO:M2012265、米曲霉 ATCC42149 和红曲霉 CCTCC NO:AF93208 中的一种或数种，接种量为1.0X 105-5.0X IO7个孢子/g底物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)以豆柏粉、花生柏粉、麸皮、玉米淀粉、面粉的混合物为主要培养基时，各物质质量比为:20-60:20-30:20-50:10-30:5-20。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)以豆柏粉、麸皮、玉米淀粉、面粉的混合物为主要培养基时，各物质质量比为30-60:30-50:10-20:8-15，混合培养基润水质量比为1:0.8-1，接种的微生物为黑曲霉ATCC16404、米曲霉CCTCC NO:M2012265和红曲霉CCTCC NO:AF93208中的一种或数种；培养条件为初始温度24_32°C，相对湿度85_95%，培养至35-50h时降湿至相对湿度70-85%，总培养时间为35_60h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)酶制剂添加量为500-5000IU/g底物蛋白质，继续低盐常温发酵时间为5-10d。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)醪液补加食盐，使醪液NaCl质量分数达到18-25%，继续常温发酵1-5个月。
10.权利要求1-9任一所述方法在酱油酿造中的应用。
【文档编号】A23L1/238GK103766847SQ201410036214
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月24日 优先权日:2014年1月24日
【发明者】高献礼, 孙鹏飞, 陆健 申请人:江南大学