专利名称：番茄溃疡病菌快速ims-pcr检测试剂盒和制备方法及其使用方法
技术领域：
本发明涉及一种在番茄溃疡病菌基因水平上快速检测的试剂盒，属于植物 检疫和植物保护领域，专一针对番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)的检测。本试剂盒适用于番茄溃疡病的田间预防和出入境植物检疫 及植物保护中番茄溃疡病菌的快速检测。
背景技术：
番茄溃疡病(Bacterial canker of tomato)是影响番茄生产最重要的细菌性病 害。该病分布广泛，在世界范围内已经广泛流行并造成了巨大的经济损失，在我国的东北、 华北、西北及东部沿海等地均有发生，部分地区产量减少在80%以上，导致我国番茄产量锐 减并造成了巨大的经济损失，同时严重威胁着我国外繁种子基地的健康发展。番茄植株从幼苗到坐果期都可发病，发病的植株常表现为病苗矮化枯死、茎杆增 粗溃疡、叶片坏死萎蔫、果实皱缩畸形等症状，严重影响了番茄的产量和品质，给各国番茄 主要生产区造成了严重的经济损失。在苗期染病，症状初始于下部叶缘，随后向上蔓延引 起整株叶片萎蔫，造成病苗矮化或枯死。在成株期染病，主要表现为植株叶片萎蔫、下垂、卷 缩，植株茎杆产生狭长稍凹陷的开裂状条斑，茎杆增粗。病菌侵染种子时，通常表现为萎蔫， 此时维管束受到严重破坏；病菌通过植株表面的毛孔、水孔等自然孔口侵染后，则会出现叶 片边缘坏死、萎蔫等局部症状；病菌侵染维管束时，则造成果实皱缩、畸形；病菌侵染果实 时则出现白色圆形小点，后变黄褐色，病斑中央粗糙突起，四周有白色晕圈，呈“鸟眼状”。 在叶片，最初的症状是叶片出现可逆性的萎蔫，在叶片的叶脉之间产生白色随后转为褐色 的坏死条斑，最后表现出永久性萎蔫，使整个植株干枯死亡。在田间，最初的症状主要是低 位叶片的小叶边缘出现卷缩、下垂、凋萎、似缺水状，最后造成大片的缺株断垄，危害十分严 重。番茄溃疡病远距离广泛传播最主要的途径是种子中携带的番茄溃疡病菌，有研究 表明0.01%的种子传病率就能引起该病的大面积流行。更有研究表明，导致病害在田间流 行并造成较大经济损失的最主要原因是初侵染，而初侵染最重要的来源是种子带菌。至今， 尚无成功防治该病害的抗病品种和有效的药物。因此，严格控制带菌种子流入市场是防止 该病暴发的最重要的措施之一。但是，番茄种子的带菌率普遍较低，一般为1 %，常规的检测 方法常常导致漏检。目前国内外对番茄溃疡病菌检测采用的方法主要有育苗检测、分离培 养检测、免疫血清学和PCR检测等方法。育苗检测、分离检测所需检测时间较长，无法满足 多批次种子进出口检测要求；免疫血清学如ELISA检测灵敏度相对较低，且常有交叉反应， 种子样品中的杂质和其他抑制剂等因素也使得PCR的检测灵敏度较低。因此，发展一种将 病原富集技术和PCR高灵敏检测有效结合的方法，是出入境商用番茄种子快速检测急需解 决的实际问题。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足提提供一种番茄溃疡病菌快速免疫磁珠 分离PCR(Immunomagnetic separation-PCR, IMS-PCR)检测试剂盒，以克服现有植物病原菌 检测方法灵敏性低、特异性差、检测周期长的缺点。本发明是将免疫磁珠分离技术和分子生 物学检测技术结合起来，首先利用免疫磁珠对番茄溃疡病菌进行富集，然后再利用分子生 物学的高检测灵敏度，进行PCR扩增，从而建立了一种将免疫磁珠分离技术和分子生物学 技术有机结合起来的检测方法。该方法检测灵敏度高、特异性强、方便快捷、能直接对带菌 种子进行检测，同时省去了核酸提取的过程，降低了操作过程中病原的损失，极大地提高了 检测的准确性和灵敏度，缩短了检测周期，是一种特别适用于番茄种子等植物材料中微量 病原的检测方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检 测试剂盒，其主要特点是包括有10XPCR Buffer 1管，2. 5mM dNTPsl管，5U Taq DNA聚合 酶 1 管，5 ii M 上游引物 5 ‘ -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 200u L,5uM 下游引物 5 ‘ -TA CTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘ 200 u L，去离子水1管，PBST洗液1管，番茄溃疡病菌特异性免 疫磁珠1管，体积为2 5_X 2 5_X 2 5_的普通磁体1块，阳性对照1管。所述的免疫磁珠购买于Promega公司。一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒的使用方法，其主要特点是步骤为(1)病菌富集取检测样品lmL置于离心管中，然后在每个离心管内加入50 PL 番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠，磁珠量为105-106个/mL，在摇床上室温摇动2h，转速为 150rpm，然后将检测样品置于磁体上静置5min，待磁珠被收集到管壁的一侧时，用移液器小 心吸去检测样品，然后再用PBST洗涤离心管3次，每次2min，在磁体上静置5min，然后弃去 洗液；(2)PCR扩增将富集病菌后的免疫磁珠重悬于50iiL去离子水中，离心混 勻后再转移到PCR管内，然后放于PCR仪中，99°C热裂解15min，然后迅速转移到冰 上冷却5min，再5000rpm离心2min，取其上清36. 6yL转移至另一 PCR管中，再在 该管内加入再加入 10XPCR buffer 5u L,2. 5mM dNTPs4 u L.5U/u L Taq DNA 聚合 酶 0. 4 ii L、5 ii M 上游引物 5 ' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 2 ii L，5 ii M 下游弓 | 物 5' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘ 2 ii L，扩增条件为 94 °C 2min ；94°C 30s, 62. 5 °C 45s, 72°C 45s，35个循环，然后72°C延伸7min，最后4°C保存，阳性样品可扩增出大小为270bp的 特异性目标片段。(3)结果分析灌制1.5%琼脂糖凝胶，取10yL PCR产物进行电泳分离，在凝胶成 像系统下进行拍照并分析，若阳性对照和检测样品在270bp处可见特异性目标条带，阴性 对照没有特异性目标条带，则判定检测样品为阳性。一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒特异性免疫磁珠的制备方法，其主要 特点是步骤为(1)将N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHS-Biotin)溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，调整 生物素浓度为50 u g/mL ；(2)测定抗体的浓度，并用pH为9. 6的碳酸盐缓冲液将抗体稀释到10 u g/mL ；(3)按生物素与抗体的质量比为1 10的比例混合，室温振荡反应4h;
(4)将透析孔径为8000-14000的透析膜剪成长度为5-lOcm的小段，然后在500mL 2%的NaHC03和lmmol/L pH为8. 0的Na2EDTA 2H20中将透析膜煮沸lOmin,再用去离子 水彻底清洗透析膜，然后放于lmmol/L Na2EDTA -2H20中将之煮沸lOmin，冷却后放于4°C冰 箱，确保透析膜始终浸没在溶液内，最后用去离子水将透析膜内外冲洗干净，结扎透析膜的 一端后将生物素化的抗体移入透析袋中，然后再结扎透析袋的另一端，放于250mL PBS中透 析过夜，期间更换缓冲液2次；(5)将链霉亲和素磁珠用碳酸盐缓冲液洗涤3次，每次2min，然后在磁体上静置 5min,弃去链霉亲和素磁珠保存液，链霉亲和素磁珠保存液为pH7. 4,0. 1% BSA和0. 02 % NaN3的溶液，然后将链霉亲和素磁珠重悬于相同体积的碳酸盐缓冲液中；(6)将经过透析后的生物素化抗体全部转移至链霉亲和素磁珠储存管内，在振荡 器上室温振荡2h，让链霉亲和素和生物素充分反应；(7)将连接抗体后的磁珠在磁体上静置5min，去除未结合到链霉亲和素磁珠上的 过量抗体，然后用PBST洗涤3次，每次2min，最后将连接抗化后的磁珠重悬于碳酸盐缓冲液 中，从而制备出番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠。一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒植物病原抽提方法，其主要特点是步 骤为(1)植物样品病原抽提按照种子重量与病原提取液为1 4的比例(g/mL)，称取 2g番茄种子，置于研钵中用棒杵研磨至种皮破裂，加入8mL普通病原抽提缓冲液，然后将病 原抽提缓冲液和种子碎片一同转移到10mL离心管中，混勻，此时，抽提缓冲液与种子的种 皮内外层充分接触，室温静置lh或4°C过夜后，则种子上携带的植物病原的多数位于抽提 缓冲液的上清部分中；(2)抽提缓冲液配方为硫酸钠0. 13g/mL，聚乙烯吡咯烷酮2g/mL，叠氮化钠 0. 02g/mL,吐温-20 0. 5ml/L,调 pH 值至 7. 4。一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒模板DNA快速获取方法，其主要特点 是步骤为取检测样品lmL置于离心管中，然后在每个离心管内加入50 y L番茄溃疡病菌 特异性免疫磁珠，在摇床上室温摇动2h，然后将检测样品置于磁体上静置5min，待磁珠被 收集到管壁的一侧时，用移液器小心吸去检测样品，然后再用PBST洗涤离心管3次，每次 2min，在磁体上静置5min，然后弃去洗液，将富集病菌后的免疫磁珠重悬于50 y L去离子水 中，离心混勻后再转移到PCR管内，将PCR管放于PCR仪中，99°C裂解15min，然后迅速转移 到冰上冷却5min，再5000rpm离心2min，则其上清部分即为可用于PCR扩增的DNA。番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒，属于植物检疫和植物保护范畴， 本发明是属于基因水平检测，检测的基因位于16S-23S rRNA间隔区，上游引物 序列为，Cmm F1 5 ‘ -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘，下游引物序列为，Cmm R1 5 ‘ -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘，引物具有亚种特异性，专一针对番茄溃疡病的病原密 执安棒形杆菌密执安棒形亚种。使用本发明试剂盒对参试的番茄溃疡病菌菌株进行检测， 可以扩增得到270bp大小的特异性目标片段，而参试的其余非番茄溃疡病菌菌株均未扩增 出特异性目标片段。同时用本试剂盒对ELISA检测为阳性的样品进行回顾性检验验证，阳 性样品符合率为100%，说明本试剂盒具有较好的检测灵敏度。
番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒，是将免疫磁珠分离技术和PCR特异性扩 增结合起来的一种新技术，该技术集病原分离富集、特异性抗体捕捉和PCR扩增于一体，是 一种检测灵敏度高、检测周期短、结果准确、使用方便的植物病原检测试剂盒，尤其适用于 植物保护和植物检疫部门对可能含有微量番茄溃疡病菌的样品进行快速检测。本发明试剂盒的有益效果番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒，涉及到检测 危险性植物病原菌的一种新技术，试剂盒提供了一种依赖免疫磁珠分离技术富集病原和 PCR扩增的检测技术，克服了现有植物病原菌检测方法灵敏性低、特异性差、检测周期长的 缺点，具有检测灵敏度高，特异性强，检测周期短，操作简便快捷的优点，可以在5h内就完 成整个检测过程。本试剂盒可以直接从番茄种子等植物组织中检测番茄溃疡病菌，大大简 化了检测程序，提高了我国口岸的检疫水平，同时为病害防治策略的制定提供了依据。试剂盒特异性验证试验通过使用番茄溃疡病菌亚种特异性引物Cmm F1和Cmm R1对番茄溃疡病菌菌株和非番茄溃疡病菌菌株进行检测，结果表明引物Cmm F1和Cmm R1 在优化的PCR扩增条件下在番茄溃疡病菌株中扩增出了大小约270bp的特异性目标片段， 而在其他7个参试的非番茄溃疡病菌菌株中均未扩增出特异性目标片段，说明本发明中使 用的引物对番茄溃疡病菌具有较高的特异性。试剂盒灵敏度验证试验在梯度稀释的纯菌悬液中，本试剂盒的检测灵敏度可以 达到102cfu/mL，也即是4. 3X102cfu/mL ；在梯度稀释的模拟带菌种子提取液中，本试剂盒 的检测灵敏度同样可以达到102cfu/mL，也即是4. 3X102cfu/mL。而使用直接PCR在梯度稀 释的纯菌悬液和模拟带菌种子提取液中的检测灵敏度仅为104cfu/mL和106cfu/mL。也即是 说，本试剂盒在模拟带菌种子提取液中的检测灵敏度比普通PCR高104倍，比常规的ELISA 方法检测灵敏度也高104倍。试剂盒实用性验证使用本试剂盒对可能自然感染番茄溃疡病菌的5批番茄种子 进行检测，结果在5批种子中均扩增出大小为270bp的目标片段，而采用ELISA方法在同样 的5批番茄种子中只有2批检测为阳性，实验结果表明本试剂盒的检测灵敏度比ELISA试 剂盒高，更适用于实际的种子病原检测。
图1番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒原理图；图2试剂盒使用流程图；图3试剂盒特异性验证结果；图中1-7 号泳道分别为 Cmm、Pss、Pst、Xcv、Xcc、Xcp、Psl，细菌浓度均为 107cfu/ mL，M 为 lOObp DNA ladder。图4梯度稀释纯菌液直接PCR结果；图中1-7号泳道细菌浓度为2. 4X107-2. 4X101cfu/mL, N为阴性对照，P为阳性 对照，M 为 lOObp DNA laddero图5梯度稀释纯菌液IMS-PCR结果；图中1_6号泳道细菌浓度为4. 3X106_4. SXlOicfu/mLN为阴性对照，M为lOObp DNA laddero图6梯度稀释模拟带菌种子提取液直接PCR结果；
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图中1-7号泳道细菌分别为2. 4X107-2.4X IO1CfuAiI^N为阴性对照，M为IOObp DNA ladder。 图7梯度稀释模拟带菌种子提取液IMS-PCR结果；图中1_6号泳道细菌浓度为4. 3X 106-4.3Χ10、 \ι/ιΛ，N为阴性对照，M为IOObp DNA ladder。图8自然感染种子IMS-PCR结果。图中1-5号泳道分别为5批自然感染的番茄种子，P为阳性对照，M为IOObp DNA Iadder0
具体实施例方式以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并 非用于限定本发明的范围。实施例1 一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒，包括有IOXPCRBuffer 1 管，2. 5mM dNTPs 1 管，5U Taq DNA 聚合酶 1 管，5 μ M 上游引物 5' -TCATTGGTCAATTCTGTCTC CC-3' 200 μ L，5 μ M 下游引物 5' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘ 200 μ L,去离子水 1 管， PBST洗液1管，番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠1管，体积为2mmX3mmX5mm的普通磁体1 块，阳性对照1管。实施例2 见图2，一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒的使用方法，其主要 特点是步骤为(1)病菌富集取检测样品ImL置于离心管中，然后在每个离心管内加入50 μ L 番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠，磁珠量为IO5-IO6个/mL，在摇床上室温摇动2h，转速为 150rpm，然后将检测样品置于磁体上静置5min，待磁珠被收集到管壁的一侧时，用移液器小 心吸去检测样品，然后再用PBST洗涤离心管3次，每次2min，在磁体上静置5min，然后弃去 洗液；(2)PCR扩增将富集病菌后的免疫磁珠重悬于50μ L去离子水中，离心混 勻后再转移到PCR管内，然后放于PCR仪中，99 °C热裂解15min，然后迅速转移到冰 上冷却5min，再5000rpm离心2min，取其上清36. 6yL转移至另一 PCR管中，再在 该管内加入再加入 10XPCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTPs4 μ L、5U/μ L Taq DNA 聚合 酶 0. 4 μ L、5 μ M 上游引物 5 ‘ -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 2 μ L，5 μ M 下游弓| 物 5' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘ 2 μ L，扩增条件为 94 °C 2min ；94 °C 30s, 62. 5 °C 45s, 72°C 45s，35个循环，然后72°C延伸7min，最后4°C保存，阳性样品可扩增出大小为270bp的 特异性目标片段。(3)结果分析灌制1.5%琼脂糖凝胶，取IOyL PCR产物进行电泳分离，在凝胶成 像系统下进行拍照并分析，若阳性对照和检测样品在270bp处可见特异性目标条带，阴性 对照没有特异性目标条带，则判定检测样品为阳性。实施例3 —种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒特异性免疫磁珠的制备方 法，其主要特点是步骤为(1)将N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHS-Biotin)溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，调整 生物素浓度为50 μ g/mL ；
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(2)测定抗体的浓度，并用pH为9. 6的碳酸盐缓冲液将抗体稀释到10 μ g/mL ；(3)按生物素与抗体的质量比为1 10的比例混合，室温振荡反应4h;(4)将透析分子量为8000-14000的透析膜剪成长度为5-lOcm的小段，然后在 500mL 2% 的 NaHCO3 和 lmmol/L pH 为 8. 0 的 Na2EDTA · 2H20 中将透析膜煮沸 IOmin,再用 去离子水彻底清洗透析膜，然后放于lmmol/L Na2EDTA · 2H20中将之煮沸lOmin，冷却后放 于4°C冰箱，确保透析膜始终浸没在溶液内，最后用去离子水将透析膜内外冲洗干净，结扎 透析膜的一端后将生物素化的抗体移入透析袋中，然后再结扎透析袋的另一端，放于250mL PBS中透析过夜，期间更换缓冲液2次；(5)将链霉亲和素磁珠用碳酸盐缓冲液洗涤3次，每次2min，然后在磁体上静置 5min，弃去链霉亲和素磁珠保存液，链霉亲和素磁珠保存液为pH7. 4,0. 1 % BSA和0. 02% NaN3的溶液，然后将链霉亲和素磁珠重悬于相同体积的碳酸盐缓冲液中；(6)将经过透析后的生物素化抗体全部转移至链霉亲和素磁珠储存管内，在振荡 器上室温振荡2h，让链霉亲和素和生物素充分反应；(7)将连接抗体后的磁珠在磁体上静置5min，去除未结合到链霉亲和素磁珠上的 过量抗体，然后用PBST洗涤3次，每次2min，最后将连接抗化后的磁珠重悬于碳酸盐缓冲液 中，从而制备出番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠。实施例4 一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒植物病原抽提方法，其步骤 为(1)植物样品病原抽提按照种子重量与病原提取液为1 4的比例(g/mL)，称取 2g番茄种子，置于研钵中用棒杵研磨至种皮破裂，加入SmL普通病原抽提缓冲液，然后将病 原抽提缓冲液和种子碎片一同转移到IOmL离心管中，混勻，此时，抽提缓冲液与种子的种 皮内外层充分接触，室温静置Ih或4°C过夜后，则种子上携带的植物病原的多数位于抽提 缓冲液的上清部分中；(2)抽提缓冲液配方为硫酸钠0. 13g/mL,聚乙烯吡咯烷酮2g/mL，叠氮化钠 0. 02g/mL,吐温-200. 5ml/L,调 pH 值至 7. 4。实施例5 —种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒模板DNA快速获取方法，其 步骤为取检测样品ImL置于离心管中，然后在每个离心管内加入50 μ L番茄溃疡病菌 特异性免疫磁珠，在摇床上室温摇动2h，然后将检测样品置于磁体上静置5min，待磁珠被 收集到管壁的一侧时，用移液器小心吸去检测样品，然后再用PBST洗涤离心管3次，每次 2min，在磁体上静置5min，然后弃去洗液，将富集病菌后的免疫磁珠重悬于50 μ L去离子水 中，离心混勻后再转移到PCR管内，将PCR管放于PCR仪中，99°C裂解15min，然后迅速转移 到冰上冷却5min，再5000rpm离心2min，则其上清部分即为可用于PCR扩增的DNA。实施例6 见图3，对番茄溃疡病菌和非番茄溃疡病菌菌株特异性性验证试验收集 1 株番爺馈荡病菌(Clavibacter michiganensi s subsp. michiganensis， Cmm)和6株非番茄溃疡病菌菌株验证本试剂盒的特异性，这6株病菌分别为丁香假 单胞杆菌丁香致病型(Pseudomonas syringae pv. syringae，Pss)，番爺细菌性叶斑
(Pseudomonas syringae pv. toma to, Pst),番茄细菌性疮痂病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xcv),十字花禾斗蔬菜黑腐致病变禾中(Xanthomonas
9campestris pv. campestris, Xcc),大丑细菌斑疫病菌(Xanthomonas campestris phaseoli，Xcp)，甜瓜细菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv· lachrymans，Psl)。分别取上述6株非番茄溃疡病菌菌株和1株番茄溃疡病菌菌株纯菌液(细菌浓度 为107CfU/mL)各ImL置于离心管中，然后在每个离心管内加入50yL番茄溃疡病菌特异性 免疫磁珠(磁珠量约为106/mL)，在摇床上室温摇动2h，转速为150rpm。然后将检测样品置 于磁体上静置5min，待磁珠被收集到管壁的一侧时，用移液器小心吸去检测样品，然后再用 PBST洗涤离心管3次，每次2min，在磁体上静置5min，然后弃去洗液。将富集病菌后的免 疫磁珠重悬于50 μ L去离子水中，离心混勻后再转移到PCR管内，然后放于PCR仪中，99°C 热裂解15min，然后迅速转移到冰上冷却5min，再5000rpm离心2min，取其上清36. 6 μ L转 移至另一 PCR 管中，再在该管内加入 IOXPCRbuffer 5μ L,2. 5mM dNTPs 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L、5 μ M 上游引物 5' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 2μ L，5yM 下游引物 5' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3‘ 2 μ L，扩增条件为 94°C 2min，94°C 30s,62. 5°C 45s, 72°C 45、35个循环，然后721延伸71^11，最后41保存。取10 μ L PCR产物在1. 5%琼脂 糖凝胶中进行电泳分离，在凝胶成像系统下进行拍照并分析。实验结果如图3所示，图中只有1号泳道可见特异性目标条带，大小约为270bp， 2-7号泳道均未见特异性目标条带。实验结果表明，本试剂盒特异性针对番茄溃疡病菌，而 在参试的其他6株非番茄溃疡病菌菌株上均未扩增出特异性的目标条带，说明本试剂盒对 番茄溃疡病菌具有较高的特异性。实施例7 梯度稀释番茄溃疡病菌纯菌液直接PCR检测试验(见图4)将标准菌培养12h后，测其吸光值(A6。。J，待A6tltlnm值=0.25_0.3(此时菌液 浓度约为108CfU/mL)，取此菌液2mL依次10倍稀释到无菌PBS中，并分别标记为10人 10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7，然后取 10_5、10_6、10_7 梯度纯菌液各 100 μ L 于培养皿 中进行平板菌落计数。取浓度为ZjXKfjjXlOkfu/mL的梯度纯菌液各5μ L于 PCR管中，加入31.6yL去离子水，在PCR仪上99 °C裂解IOmin，然后迅速置于冰上冷 却 5min，离心后加入 10XPCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTPs 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚 合酶 0. 4 μ L、5 μ M 上游引物 5 ' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 2 μ L，5 μ M 下游弓 | 物 5' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3‘ 2 μ L, PCR反应成分同实施例6，然后再进行PCR扩增。实验结果如图4所示，图中1-4号泳道均可见特异性目标条带，片段大小约为 270bp，且亮度依次减弱；5-7号泳道未见特异性目标条带。试验结果表明，在纯菌液中直接 PCR的检测灵敏度为104cfu/mL。实施例8 梯度稀释番茄溃疡病菌纯菌液IMS-PCR检测试验，见图5，取番茄溃疡病菌浓度分别为4. 3X106-4. 3X IO1CfuAiL的梯度稀释纯菌液各ImL 置于离心管中，然后在每个离心管内加入50 μ L番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠(磁珠量约 为IO6个/mL)，在摇床上室温摇动2h，转速为150rpm。然后将检测样品置于磁力架上静置 5min，待磁珠被收集到管壁的一侧时，用移液器小心吸去检测样品，然后再用PBST洗涤离 心管3次，每次2min，在磁力架上静置5min，然后弃去洗液。将富集病菌后的免疫磁珠重 悬于50 μ L去离子水中，离心混勻后再转移到PCR管内，将PCR管放于PCR仪中，99°C热裂 解15min，然后迅速转移到冰上冷却5min，再5000rpm离心2min，取其上清36. 6 μ L转移 至另一 PCR 管中，再在该管内加入 10XPCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTPs 4μ L,5U/y L TaqDNA 聚合酶 0. 4 μ L、5 μ M 上游引物 5 ‘ -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 2 μ L，5 μ M 下游弓丨 物 5' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3‘ 2 μ L，扩增条件为 94°C 2min ；94°C 30s,62. 5°C 45s, 72°C 45s，35个循环；72°C 7min，4°C保存。取10 μ L PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶中进行电 泳分离，在凝胶成像系统下进行拍照并分析。实验结果如图5所示，图中1-5号泳道均可见特异性目标条带，大小约为270bp，且 条带亮度依次减弱，而6号泳道未见特异性目标条带。实验结果表明，本试剂盒在梯度稀释 的纯菌液中可以检出浓度为IO2CfuAiL的番茄溃疡病菌，具有较高的检测灵敏度。实施例9 梯度稀释模拟带菌种子提取液直接PCR试验，见图6称取50g经检测不带番茄溃疡病菌的种子放于研钵内，用钵杵将番茄种子在研钵 内研碎后，加入200mL普通种子病原提取液，将种子病原提取液及种子碎片全部转移至锥 形瓶中4°C冰箱过夜，次日取出经抽提病原后的病原提取液，取其上清分装到小锥形瓶中。 然后取经过计数后的上一梯度纯菌液2mL依次10倍稀释到种子病原提取液中，并分别标记 为 10人 10_2、ΙΟ—3、10人 1(Γ5、ΙΟ—6、1(Γ7。取番茄溃疡病菌浓度为 2. 4X 107_2· 4X IO1CfuAiL 的 模拟带菌种子提取液各5 μ L于PCR管中，再加入31. 6 μ L去离子水，在PCR仪中99°C裂解 lOmin，其余方法同实施例6。实验结果如图6所示，图中只有1、2号泳道可见较淡的特异性目标条带，大小约为 270bp，其余泳道均未见到明显目标条带。试验表明直接PCR在模拟带菌种子提取液中的检 测灵敏度仅为106cfu/mL。实施例10 梯度稀释模拟带菌种子提取液IMS-PCR试验，见图7取4. 3 X 106-4. 3 X IO1CfuZmL梯度稀释模拟带菌种子液各ImL置于离心管 中，然后在每个离心管内加入50 μ L番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠，在摇床上室温摇 动2h，转速为150rpm，然后将检测样品置于磁体上静置5min，待磁珠被收集到管壁的 一侧时，用移液器小心吸去检测样品，然后再用PBST洗涤离心管3次，每次2min，在磁 体上静置5min，然后弃去洗液。将富集病菌后的免疫磁珠重悬于50μ L去离子水中， 离心混勻后再转移到PCR管内，将PCR管放于PCR仪中，99 °C热裂解15min，然后迅速 转移到冰上冷却5min，再5000rpm离心2min，取其上清36. 6 μ L转移至另一 PCR管 中，再在该管内加入 IOXPCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTPs 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合 酶 0. 4 μ L、5 μ M 上游引物 5 ' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 2 μ L，5 μ M 下游弓| 物 5 ‘ -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘ 2 μ L,其余步骤同实施例 6。实验结果如图7所示，图中可见1-5号泳道均可见特异性目标条带，大小约为 270bp，且条带亮度依次减弱，6号泳道未见特异性目标条带。实验结果表明，本试剂盒在模 拟带菌种子提取液中的检测灵敏度为102cfu/mL，比传统的ELISA检测试剂盒的检测灵敏度 高IO4倍。实施例11 自然感染番茄溃疡病菌的出口种子检测试验，见图8 选取5批可能自然感染番茄溃疡病菌的出口番茄种子，各称量2g置于研钵中用棒 杵研磨至种皮破裂，加入8mL普通病原抽提缓冲液，然后将病原抽提缓冲液和种子碎片一 同转移到IOmL离心管中，混勻。此时，抽提缓冲液与种皮的内外层充分接触，室温静置Ih 或4°C过夜对种皮上的病原进行抽提，则种子上携带的植物病原大部分被抽提到缓冲液的 上清部分中。然后再取上清部分ImL置于离心管中，在每个离心管内加入50 μ L番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠，在摇床上室温摇动2h，转速为150rpm。然后将检测样品置于磁体上 静置5min，待磁珠被收集到管壁的一侧时，用移液器小心吸去检测样品，然后再用PBST洗 涤离心管3次，每次2min，在磁体上静置5min，然后弃去洗液。将富集病菌后的免疫磁珠 重悬于50 μ L去离子水中，离心混勻后再转移到PCR管内，将PCR管放于PCR仪中，99°C热 裂解15min，然后迅速转移到冰上冷却5min，再5000rpm离心2min，取其上清36. 6 μ L转移 至另一 PCR 管中，再在该管内加入 10XPCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTPs 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L、5 μ M 上游引物 5' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 2μ L，5yM 下游弓丨物 5 ‘ -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘ 2 μ L,其余步骤同实施例 6。实验结果如图8所示，图中可见1-5号泳道可见特异性目标条带，大小约为270bp， 其中2、3号泳道条带较亮，1、4、5泳道条带较淡。实验结果表明，在可能自然感染番茄溃疡 病菌的5批出口番茄种子中均能扩增出特异性的目标条带，而采用ELISA方法时从同样的5 批种子中只有2批检测为阳性。同时试验表明，本试剂盒在实际的种子病原检测中具有较 高的实用价值，能直接对带菌番茄种子进行检测，具有较大的推广应用基础以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1权利要求
一种番茄溃疡病菌快速IMS PCR检测试剂盒，其特征是包括有10×PCRBuffer 1管，2.5mM dNTPs 1管，5U Taq DNA聚合酶1管，5μM上游引物5′ TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC 3′200μL，5μM下游引物5′ TACTGAGATGTTTCACTTCCCC 3′200μL，去离子水1管，PBST洗液1管，番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠1管，体积为2～5mm×2～5mm×2～5mm的普通磁体1块，阳性对照1管。
2.一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是步骤为(1)病菌富集取检测样品lmL置于离心管中，然后在每个离心管内加入50y L番茄溃 疡病菌特异性免疫磁珠，磁珠量为105_106个/mL，在摇床上室温摇动2h，转速为150rpm，然 后将检测样品置于磁体上静置5min，待磁珠被收集到管壁的一侧时，用移液器小心吸去检 测样品，然后再用PBST洗涤离心管3次，每次2min，在磁体上静置5min，然后弃去洗液；(2)PCR扩增将富集病菌后的免疫磁珠重悬于5 0 y L去离子水中，离心混勻 后再转移到PCR管内，然后放于PCR仪中，99°C热裂解15min，然后迅速转移到冰上 冷却5min，再5000rpm离心2min，取其上清36. 6 y L转移至另一 PCR管中，再在该 管内加入再加入 10XPCR buffer 5u L,2. 5mM dNTPs4 u L.5U/u L Taq DNA 聚合 酶 0. 4 ii L、5 ii M 上游引物 5 ' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 2 ii L，5 ii M 下游弓 | 物 5 ' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘ 2 u L,扩增条件为 94 °C 2min ；94°C 30s, 62. 5 °C 45s, 72°C 45s，35个循环，然后72°C延伸7min，最后4。C保存，阳性样品可扩增出大小为270bp的 特异性目标片段。
3.一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒特异性免疫磁珠的制备方法，其特征是 步骤为(1)将N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶于二甲基甲酰胺中，调整生物素浓度为50yg/mL ；(2)测定抗体的浓度，并用pH为9.6的碳酸盐缓冲液将抗体稀释到10 u g/mL ；(3)按生物素与抗体的质量比为1 10的比例混合，室温振荡反应4h;(4)将透析分子量为8000-14000的透析膜剪成长度为5-lOcm的小段，然后在500mL 2 %的NaHC03和lmmol/L pH为8. 0的Na2EDTA 2H20中将透析膜煮沸lOmin,再用去离子 水彻底清洗透析膜，然后放于lmmol/L Na2EDTA -2H20中将之煮沸lOmin，冷却后放于4°C冰 箱，确保透析膜始终浸没在溶液内，最后用去离子水将透析膜内外冲洗干净，结扎透析膜的 一端后将生物素化的抗体移入透析袋中，然后再结扎透析袋的另一端，放于250mL PBS中透 析过夜，期间更换缓冲液2次；(5)将链霉亲和素磁珠用碳酸盐缓冲液洗涤3次，每次2min，然后在磁体上静置5min， 弃去链霉亲和素磁珠保存液，链霉亲和素磁珠保存液为PH7. 4,0. 1%BSA和0. 02 % NaN3的 溶液；然后将链霉亲和素磁珠重悬于相同体积的碳酸盐缓冲液中；(6)将经过透析后的生物素化抗体全部转移至链霉亲和素磁珠储存管内，在振荡器上 室温振荡2h，让链霉亲和素和生物素充分反应；(7)将连接抗体后的磁珠在磁体上静置5min，去除未结合到链霉亲和素磁珠上的过量 抗体，然后用PBST洗涤3次，每次2min，最后将连接抗化后的磁珠重悬于碳酸盐缓冲液中， 从而制备出番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠。
4.一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒植物病原抽提方法，其特征是步骤为(1)植物样品病原抽提按照种子重量与病原提取液为1 4的比例(g/mL)，称取2g番茄种子，置于研钵中用棒杵研磨至种皮破裂，加入8mL普通病原抽提缓冲液，然后将病原 抽提缓冲液和种子碎片一同转移到10mL离心管中，混勻，此时，抽提缓冲液与种子的种皮 内外层充分接触，室温静置lh或4°C过夜后，则种子上携带的植物病原的多数位于抽提缓 冲液的上清部分中；(2)抽提缓冲液配方为硫酸钠0. 13g/mL，聚乙烯吡咯烷酮2g/mL，叠氮化钠0. 02g/mL, 吐温-200. 5ml/L,调 pH 值至 7. 4。
5. 一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒模板DNA快速获取方法，其特征是步骤为取检测样品lmL置于离心管中，然后在每个离心管内加入50 y L番茄溃疡病菌特异性 免疫磁珠，在摇床上室温摇动2h，然后将检测样品置于磁体上静置5min，待磁珠被收集到 管壁的一侧时，用移液器小心吸去检测样品，然后再用PBST洗涤离心管3次，每次2min，在 磁体上静置5min，然后弃去洗液，将富集病菌后的免疫磁珠重悬于50 y L去离子水中，离心 混勻后再转移到PCR管内，将PCR管放于PCR仪中，99°C裂解15min，然后迅速转移到冰上冷 却5min，再5000rpm离心2min，则其上清部分即为可用于PCR扩增的DNA。
全文摘要
本发明涉及一种在番茄溃疡病菌基因水平上快速检测的试剂盒，属于植物检疫和植物保护领域，专一针对番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm)的检测。本试剂盒适用于番茄溃疡病的田间预防和出入境植物检疫及植物保护中番茄溃疡病菌的快速检测。一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒，其主要特点是包括有10×PCR Buffer 1管，2.5mm dNTPs 1管，5U Taq DNA聚合酶1管，5μm上游引物5′-TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3′200μl，5μm下游引物5′-TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3′200μl，去离子水1管，PBST洗液1管，番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠1管，普通磁体1块，阳性对照1管。
文档编号C12Q1/68GK101948916SQ20101026627
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月29日 优先权日2010年8月29日
发明者刘箐, 闵现华 申请人:甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心