专利名称：44个snp位点多色荧光复合检测的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及法医学个体识别，特别涉及SNP位点的基因分型，尤其是一种用于法 医学个体识别的44个SNP位点多色荧光复合检测的方法及试剂盒。
背景技术：
法医检案工作中，由于高温、潮湿、暴晒、微生物等因素的影响，生物性检材中的 DNA分子经常被损坏，发生断裂，分子变小，大片段丢失，无法进行有效的STR分型，使案件 侦破限于困境。目前，法医DNA分析中解决高度降解检材DNA样本分型的技术主要集中在 两个方面一种是miniSTR(小片段短串联重复)分析技术。这种技术是通过将STR(短 串联重复)遗传标记的扩增引物设计的尽可能接近重复区域而缩短PCR产物片段长度， 应用于高度降解检材和微量检材中可以提高DNA分型的成功率。但在分析高度降解检材 方面，miniSTR基因座分析的DNA片段范围在80 150bp，对于< IOObp的高度降解DNA， miniSTR基因座分析技术仍然具有局限性。而且，由于扩增片段长度和荧光染料种类的限 制，在一个复合扩增体系中只可以同时扩增较少的miniSTR基因座，一般为一种荧光物质 标记一个基因座，一个扩增体系最多可同时复合4个miniSTR基因座，要想达到个体识别效 能，就必须增加复合扩增系统的数量，至少需要3 4个复合扩增系统，因此，不适合微量检 材的应用。另一种是SNPs分析技术，SNPs (单核苷酸多态性)是继限制性片段长度多态性 (restriction fragmeng length polymorphism, RELP)禾口短串联重复序列(short tandem repeats, STRs)之后被发现的又一种人类遗传性标记，被称为第三代遗传标记，指人类基因 组中特定部位的单个碱基序列的变异，其在人类基因组中分布极为广泛，大约每1000个碱 基中就存在一个SNP，估计在人类基因组中大约有数百万个SNPs，数量超出STR基因座数目 的几个数量级，而且，SNPs具有突变率低，扩增片段短，适合高通量检测和易于分型等特点， 因此在法医学个体识别应用中具有广阔前景。选用可靠的多重分型方法，许多SNPs位点可 以在短至45 55bp (变异位点两侧引物序列长度)的扩增片段内分型，因此，当DNA样本 严重降解或遇到检材微量时，SNPs分析将更有价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于个体识别的44个SNP位点多色荧光复 合检测的方法及试剂盒，使待测靶DNA的片段范围缩短至69 125bp，提高对高度降解DNA 分型的成功率。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是用于个体识别的44个SNP位 点多色荧光复合检测的试剂盒，其包括a)扩增体系PCR缓冲溶液、MgCl2、dNTPs, PCR 引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA，b)扩增产物纯化试剂核酸外切酶I (Exo I)及其缓 冲溶液(Exo I Buffer)、虾碱性磷酸酶(SAP)及其缓冲溶液(SAP Buffer), c)延伸反 应试剂延伸引物和SNaPshot反应混合液，d)测试试剂=Hi-Di甲酰胺和GeneScan Size Standards-120LIZ，所述PCR引物和延伸引物由44个SNP基因位点的引物组成，所述44个SNP基因位点在NCBI中SNP数据库的rs号分别为rs 1109037，rs3780962, rs987640,rs9951171,rs430046,rs338882,rs2342747,rsl0092491,rsl821380,rs321198, rs7041158, rsl3218440, rs560681, rs445251, rs8078417, rsl0488710, rs7520386, rs214955, rs4530059, rsl3182883, rs722290, rs6811238, rs279844, rs9905977, rs6955448, rs4288409, rs315791, rs740598, rs2272998, rs7205345, rsl0773760, rs221956,rs576261,rsl498553,rs2399332, rsl058083,rs993934,rsl336071, rsl294331, rsl523537, rs2269355, rsl2997453,rsl736442 和 rsl0776839。上述SNP基因位点根据以下标准进行选取(1)具有高的杂合度(彡0. 4)；⑵等 位基因频率在全球各大人群之间差异小(Fst < 0. 06) ； (3)系统内SNPs之间要处于连锁平 衡状态，位点之间的物理距离至少大于1Mb ;(4)系统内的SNP数目要足够多以达到个体识 别效能；所有SNP位点的群体遗传学数据已经在公开刊物上发表。其相关信息见表1。表ISNP基因位点相关信息
4 所述44个SNP基因位点的PCR引物和延伸引物的序列参见表2。根据NCBI的SNP 数据库(dbSNP)提供的DNA序列，设计44个SNP位点的PCR引物，PCR引物长度20 29个 碱基，扩增产物长度69 125bp，退火温度60士5°C，GC含量40 60%。又设计了延伸 引物，延伸引物的3’末端位于多态性位点的上游1个碱基处，延伸引物与模板DNA互补部 分的特异性引物长度18 30个碱基，退火温度50士2°C。同一反应管中，被检测突变相同 的位点的引物长度相差3 6个碱基，为了改变引物的长度，区分不同的位点，在特异性引 物的 5，端加 poly(dT)或 poly(dCT)。表2 44个SNP基因位点的PCR引物和延伸引物的序列表 利用上述的试剂盒进行个体识别的测试方法，按照下列步骤进行a)提取DNA，得DNA提取液；b)在扩增体系中加入步骤一所得的DNA提取液，然后在扩增仪中进行扩增，扩增 条件为95°C、5min预变性；然后依次在95°C、30s，60°C、30s，65°C、30s，进行35个循环；再 在65°C保持7min ；最终在4°C保存，获得扩增产物；c)应用核酸外切酶I和虾碱性磷酸酶纯化扩增产物，纯化反应条件37°C、lh，然 后8(TC、15min，最终在4°C保存，得纯化后的扩增产物；d)对纯化后的扩增产物进行延伸反应将纯化后的扩增产物加入至所述的延伸反应试剂中进行延伸反应；所述的延伸反应 的条件依次在96°C、10s, 50°C、5s，60°C、30s进行25个循环，最终保存在4°C，得延伸产物；e)应用虾碱性磷酸酶纯化延伸产物将延伸产物加入至虾碱性磷酸酶及其缓冲溶液的混合液中，在下列条件下进行纯 化反应371、111，651、151^11，最终保存在41，得纯化后的延伸产物；f)检测、确定产物，将步骤e)中得到的纯化后的延伸产物中加入至所述的测试试剂中，混勻；然后 95°C变性3min，4°C迅速冷却后进行电泳检测；最后根据延伸产物峰的位置和颜色确定44 个SNP基因位点的基因型。采用本发明产生的有益效果在于采用本发明可以快速、准确地获得44个SNP位 点的基因分型，并通过荧光自动分型设备检测分析，对人类生物检材进行个体识别。本发明 在对高度降解检材DNA的法医学个体识别方面具有很大的优势和潜力。
图1和图2分别是本发明的检测结果的附图。
具体实施例方式
用于个体识别的44个SNP位点多色荧光复合检测的试剂盒，其包括a)扩增体系PCR缓冲溶液、MgCl2、dNTPs、PCR引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA，b)扩增产物纯化试剂 核酸外切酶I及其缓冲溶液、虾碱性磷酸酶及其缓冲溶液，c)延伸反应试剂延伸引物和 SNaPshot 反应混合液，d)测试试剂Hi_Di 甲酰胺和 GeneScan Size Standards_120LIZ， 所述PCR引物和延伸引物由44个SNP基因位点的引物组成，所述44个SNP基因位点在 NCBI 中 SNP 数据库的 rs 号分别为 rsl 109037, rs3780962, rs987640, rs9951171, rs430046, rs338882, rs2342747, rsl0092491, rsl821380, rs321198, rs7041158, rsl3218440, rs560681, rs445251, rs8078417, rsl0488710, rs7520386, rs214955, rs4530059, rsl3182883, rs722290, rs6811238, rs279844, rs9905977, rs6955448, rs4288409, rs315791,rs740598,rs2272998,rs7205345,rsl0773760,rs221956,rs576261,rsl498553, rs2399332, rsl058083, rs993934, rsl336071, rsl294331, rsl523537, rs2269355, rsl2997453,rsl736442 和 rsl0776839。所述PCR引物和延伸引物的序列表、浓度分别参见表2和表3。所述延伸引物由延伸引物混合物I (26个位点)和延伸引物混合物II (18个位点) 由不同长度的延伸引物组成，分别针对44个SNP位点的多态性位点。表3PCR引物和延伸引物的浓度 利用上述的试剂盒进行个体识别的测试方法，按照下列步骤进行a)提取DNA，得DNA提取液；b)多重PCR扩增包含44个SNP位点的DNA片段
在扩增体系中加入步骤一所得的DNA提取液，然后在扩增仪中进行扩增。所述PCR 扩增体系的总体积为25 y L，扩增体系的组分、浓度或含量如下
10XPCR缓冲溶液 Mg2+ (25mM) dNTPs(lOmM)
PCR引物(浓度参见表3) Taq DNA 聚合酶(5U/ u L) 模板 DNA(1 lOng/iiL) 去离子水
扩增的热循环参数
2. 5u L 5. 5 u L 2u L
1 u L 0. 3u L 1 u L 12. 7u L
35循环
95°C 95 °C 60 °C 65 °C 65°C
4°C
得扩增产物；
c)应用核酸外切酶I (Exo I)和虾碱性磷酸酶(SAP)纯化步骤b)所得的扩增产
5min
30s
30s
30s
7min
保存
物，纯化反应体系和纯化反应条件如下扩增产物的纯化反应体系，体积10 ii L 10 X Exo I Buffer1 u L10 X SAP Buffer1 u LExo I (5U/ u L)2u LSAP(lU/u L)2u L扩增产物4 ii L扩增产物纯化反应的条件37 °Clh80 °C15min4°C保存得到纯化后的扩增产物；d)将纯化后的扩增产物加入至所述的延伸反应试剂中进行延伸反应；延伸反应 试剂和延伸反应条件如下延伸反应体系，反应体积10 ii L SNaPshot 反应混合液5 ii L纯化后的扩增产物3iiL延伸引物(3. 3 13. 3 iiM，具体参见表3) luL去离子水1 ii L
13
延伸反应的热循环参数
96°C10s ,
50°C5s I 25 循环
60 °C30s ‘
4°C保存得延伸产物；e)应用虾碱性磷酸酶纯化延伸产物延伸产物纯化反应体系，反应体积10 ii L 10 X SAP Buffer1 u LSAP (5U/ u L)2u L去离子水5 ii L延伸产物2u L延伸产物纯化反应条件37 °Clh65 °C15min4°C保存得纯化后的延伸产物；f)检测、确定产物，将步骤e)中得到的纯化后的延伸产物中加入11. 5ii L Hi_Di甲酰胺和0. 5 y L GeneScan Size Standards-120 LIZ 混勻；然后 95°C变性 3min，4°C迅速冷却后，用美国 AB 公司的DNA自动分析仪进行电泳检测，检测条件1500V电压，36cm毛细管，P0P4凝胶，电泳 20min;应用Data Collection 3. 0软件收集数据，GenemapperV 3. 2软件进行结果分析。其 中一实施例的结果图见附图1和图2。
1权利要求
44个SNP位点多色荧光复合检测的试剂盒，其包括a)扩增体系PCR缓冲溶液、MgCl2、dNTPs、PCR引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA，b)扩增产物纯化试剂核酸外切酶Ⅰ及其缓冲溶液、虾碱性磷酸酶及其缓冲溶液，c)延伸反应试剂延伸引物和SNaPshot反应混合液，d)测试试剂Hi Di甲酰胺和GeneScanTM Size Standards 120LIZ，其特征在于，所述PCR引物和延伸引物由44个SNP基因位点的引物组成，所述44个SNP基因位点在NCBI中SNP数据库的rs号分别为rs1109037，rs3780962，rs987640，rs9951171，rs430046，rs338882，rs2342747，rs10092491，rs1821380，rs321198，rs7041158，rs13218440，rs560681，rs445251，rs8078417，rs10488710，rs7520386，rs214955，rs4530059，rs13182883，rs722290，rs6811238，rs279844，rs9905977，rs6955448，rs4288409，rs315791，rs740598，rs2272998，rs7205345，rs10773760，rs221956，rs576261，rs1498553，rs2399332，rs1058083，rs993934，rs1336071，rs1294331，rs1523537，rs2269355，rs12997453，rs1736442和rs10776839。
2.根据权利要求1所述的44个SNP位点多色荧光复合检测的试剂盒，其特征在于所述 44个SNP基因位点的PCR引物和延伸引物的序列参见表2。
3.根据权利要求1或2所述的44个SNP位点多色荧光复合检测的试剂盒，其特征在于 同时复合扩增包含44个SNPs位点的DNA片段。
4.利用权利要求1所述的试剂盒进行个体识别的测试方法，其特征在于按照下列步骤 进行a)提取DNA，得DNA提取液；b)在扩增体系中加入步骤一所得的DNA提取液，然后在扩增仪中进行扩增，扩增条件 为95°C、5min预变性；然后依次在95°C、30s，60°C、30s，65°C、30s，进行35个循环；再在 65°C保持7min ；最终在4°C保存，获得扩增产物；c)应用核酸外切酶I和虾碱性磷酸酶纯化扩增产物，纯化反应条件37°C、lh，然后 80°C、15min,最终在4°C保存，得纯化后的扩增产物；d)对纯化后的扩增产物进行延伸反应将纯化后的扩增产物加入至所述的延伸反应试剂中进行延伸反应；所述的延伸反应的 条件依次在96°C、10s, 50°C、5s，60°C、30s进行25个循环，最终保存在4°C，得延伸产物；e)应用虾碱性磷酸酶纯化延伸产物将延伸产物加入至虾碱性磷酸酶及其缓冲溶液的混合液中，在下列条件下进行纯化反 应371、111，651、151^11，最终保存在41，得纯化后的延伸产物；f)检测、确定产物，将步骤e)中得到的纯化后的延伸产物中加入至所述的测试试剂中，混勻；然后95°C变 性3min，4°C迅速冷却后进行电泳检测；最后根据延伸产物峰的位置和颜色确定44个SNP 基因位点的基因型。
全文摘要
本发明公开了一种用于个体识别的44个SNPs位点多色荧光复合检测试剂盒和检测方法，所述试剂盒包括PCR引物，DNA聚合酶，PCR缓冲液，核酸外切酶Ⅰ，虾碱性磷酸酶，延伸引物和SNaPshot反应混合液；PCR引物和延伸引物由44个SNP基因位点的引物，分别针对包含44个SNP位点的DNA片段。采用本发明可以快速、准确地获得44个SNP位点的基因分型，并通过荧光自动分型设备检测分析，对人类生物检材进行个体识别。
文档编号C12Q1/68GK101921860SQ201010265870
公开日2010年12月22日 申请日期2010年8月30日 优先权日2010年8月30日
发明者丛斌, 娄春光, 李淑瑾 申请人:河北医科大学