专利名称：一种研究大曲细菌群落结构多样性的方法
技术领域：
DGGE技术属于微生物生态学领域，在传统发酵食品中常被用于分析微生物多样性、微生物动态监测、分析代谢活性、发现新的微生物资源、产品质量控制等研究，另外在用于研究和发现发酵过程中优势/功能微生物和原产地识别等方面也显示出强大的生命力。
背景技术：
1993年Muyzer等人首次将DGGE技术应用于微生物生态学研究，并证实了该分子生物学技术在揭示人工或自然环境中复杂微生物区系遗传多样性、种群差异和细菌鉴定等方面具有独特优越性。DGGE的基本原理是根据含有不同序列的DNA片段在具有变性剂梯度的凝胶上由于其解链行为的不同而导致迁移率的不同，部分解链的DNA片段在凝胶中的迁移速率低于完全螺旋形式的DNA分子，含有不同碱基序列的DNA片段就得到有效分离。由于DNA分子中碱基G和C的结合力比碱基A和T的结合力要强，因此GC含量高的区域具有较高的解链温度，基于此原理，GC-Clamp技术被应用到DGGE技术中来，它是在正向引物的一端加上一段长约30 50bp富含GC的序列，形成一个人工高温解链区，这样DNA的片段原有部分相对具有较低的解链温度，在DGGE中可以较好的分离，再将所得DNA片段进行测序，同基因文库中的现有序列比较，即可确定微生物的种类可以将微生物确定到属或种水平。DGGE条带的强度和数量可以反映出样品中微生物群落结构的多样性信息。与传统培养方法相比，DGGE技术以基因组DNA为研究对象，避免对微生物进行培养，这一特性克服了传统培养方法研究微生物群落时造成的微生物信息大量丢失的缺点，可以更为真实、客观、有效的反映样品中微生物群落尤其是复杂微生物群落的组成、结构和功能。另外DGGE可同时对多个样品进行分析，因此非常适合研究微生物群落的时空变化，在传统发酵食品微生物群落结构研究中显示出强大的生命力。大曲是白酒生产的动力，在酿造过程中起着重要糖化、酯化和生香作用，是传统固态发酵蒸馏大曲酒的重要物质保障。由于其开放式的制作环境和自然接种，使得大曲中微生物数量和种类繁多，微生物之间作用机理非常复杂，而以往研究方法又多集中在传统平板分离鉴定方法上，传统培养方法会改变样品中微生物群落组成，也无法分析微生物与环境的相互关系，并且大多数微生物是不可培养的，当前对大曲的微生物群落结构认识尚未十分清晰。应用PCR-DGGE分析白酒大曲中细菌群落结构对判断和鉴别白酒生产中与特征风味物质相关的功能微生物和大曲工艺控制等方面具有重要的理论和实际意义。
发明内容
本发明的目的是针对大曲微生物现有研究方法存在的问题，为解决部分微生物由于不可分离性造成难以直接研究的技术难题，而提供的一种研究白酒大曲细菌群落结构多样性的方法。采用酶法直接提取大曲中基因组DNA，选择细菌通用引物，PCR扩增细菌核糖体DNA中的特异性DNA片段，通过DGGE电泳分离不同种属对用的PCR产物DNA片段，切胶回收DGGE指纹图谱中优势微生物对应条带，重新PCR后将产物连接至T载体，通过蓝白斑筛选阳性克隆并进行阳性克隆验证，确认为阳性克隆后，进行测序，将所得序列在GENEBANK中进行同源性搜索，最终获得DGGE条带对应微生物的种属信息。DGGE技术直接以大曲中基因组DNA为研究对象，可以有效避免传统微生物培养方法造成的微生物信息大量丢失的缺点，与其他微生物群落研究方法结合在一起(包括传统培养方法)可以更好的揭示和认识复杂微生物群落结构多样性。DGGE可用于跟踪大曲在制作过程中微生物动态消长规律、分析发酵过程中微生物代谢活性、丰富酿酒微生物资源以及研究工艺参数对大曲发酵过程的影响等方面的研究，为大曲工艺控制提供理论依据，对稳定大曲质量有重要意义。另外由于大曲带有明显的地域特征，DGGE指纹图谱所揭示的群落组成与地理位置直接相关，因此DGGE技术也可作为原产地识别的重要手段。
附图泳道1和2为同一产地不同批次浓香型白酒大曲平板曲，泳道3和4为同一产地不同批次浓香型白酒大曲包包曲。
具体实施例方式为更好的理解本发明，下面结合实例进一步阐述本发明。a)选择用于分析的大曲样品(同一产地不同批次、不同类型浓香型白酒大曲)；b)称取Ig大曲样品，加入提取液提取样品中的基因组DNA ；c)选择对大多数细菌和古细菌的16S rRNA基因V3区具有特异性的引物对F338gc 和R518引物对，并在引物对正向引物5’端加上GC发夹结构，引物对的序列为F338gc (5' -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGAGGCAGCAG-3'，下划线部分为发夹结构),R518 (5' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ‘)；d)以步骤b)中提取的基因组DNA为模板，以步骤c)中的引物对为引物进行PCR 扩增，PCR反应体系为50 μ L的PCR反应体系组成如下2 μ L(约IOng)的模板、IOymol每种引物 1 μ L、2. 5mmol/L dNTP 混合物 4 μ L、10 XPCR buffer (with MgCl2) 5 μ L、、1. 25U 的 DNA聚合酶、适量的双蒸水补足50 μ L ；PCR扩增策略采用降落PCR(TOUCHDOWN)预变性条件为95°C 5min，前20个循环为95°C lmin、65°C 55°C 50s和72°C 3min (其中每个循环后复性温度下降0. 5°C )，后10个循环为95°C lmin、55°C 50s和72°C 3min，最后在72°C下延伸IOmin ；PCR产物用0. 8%琼脂糖凝胶电泳进行检测；e)将步骤d)中得到的PCR反应产物用DGGE电泳设备进行分离，电泳仪器采用 Bio-Rad 公司基因突变检测系统(Dcode Universal Mutation Detection System)；电泳条件为电压100V，60°C电泳15h，上样量为45 μ L，丙烯酰胺浓度为8%，变性剂梯度为 40% 60%，100%变性剂由7mol/L的尿素和质量浓度为40%的去离子甲酰胺组成；f)电泳结束后使用EB (溴化乙锭)对凝胶进行染色20min后再脱色30min，在凝胶成像系统中拍照保存图像；g)对DGGE图谱中微生物代表的条带进行切胶回收将条带在紫外灯下用无菌手术刀切下，放入无菌离心管中，轻轻捣碎，加入200 μ L无菌双蒸水于4°C冰箱静置过夜；h)切胶条带重新PCR扩增，PCR所用引物为不带GC发夹结构的F338/R518，序列为F338:(5' -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3 ‘ ) ；R518 (5' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ‘ ) ,PCR 产物经胶回收试剂盒纯化后连接T载体、转化大肠杆菌，进行蓝白斑筛选，对筛选到的白色菌落进行阳性克隆验证，直接以菌落为模板，原位验证插入片段大小是否正确，验证所用引物为 T7/SP6，序列为T7(5' -TAATACGACTCACTATAGGGC-3‘ ) ；SP6(5' -ATTTAGGTGACACTA TAGAATACTC-3' )，PCR体系PCR反应体系(20 μ L)模板少许、IOymol每种引物0.4yL、 2. 5mmol/L dNTP 0. 2μ LUOXPCR buffer (with MgCl2) 2 μ L、1. 5U 的 DNA 聚合酶、适量的双蒸水补足20 μ L0 PCR反应程序94°C预变性3min，94°C变性45s，55°C复性45s，72°C延伸 2min，共计循环30次，最后在72°C延伸10min，4°C冷却，PCR产物用0. 8%琼脂糖凝胶检测；i)确认为阳性克隆后，将代表性的阳性克隆转接至LB液体培养基中37°C培养过夜后送交测序公司测序；j)测序公司返回序列去除载体序列，登陆GENEBANK进行同源性搜索，获得DGGE条带对应微生物的种属信息。基因组DNA提取方法称取Ig样品于IOml无菌离心管中加細1 DNA提取液
，200yL 溶菌酶(lOmg/ml)，100 μ L 溶壁酶(500U/ml)，37 °C 水浴 lh，每 15min轻轻摇晃一次。力卩6(^1^蛋白酶1^2011^/1111)，摇勻后，371水浴lh，每15min轻轻摇晃一次。加250μ L的20% SDS溶液，65°C水浴lh，每15min轻轻摇晃一次。6000r/min离心lOmin，转移上清至新的5ml离心管中。加等体积氯仿异戊醇(V V, 24 1)，摇勻， 9000r/min离心8min，转移上清至新的5ml离心管中，重复一次此步骤。转移上清至新的离心管中，加0. 6倍体积异丙醇，室温沉淀过夜。12000r/min室温离心30min，弃去上清。在沉淀中加入预冷的70%乙醇，洗涤2次，13000r/min 4°C离心15min，加50 μ L无菌双蒸水溶解沉淀，_20°C保存备用。本实施例的实验结果参照说明书附图，对附图中标注的优势条带1 13进行切胶回收测序，其中条带2、3、4、5、6、10、13测序结果如下。表DGGE条带分析结果
条带相似序列(登录号)相似性
2Uncultured bacterium (EU585895)99.48%
3Uncultured bacterium(AB441614)100%
4Uncultured bacteriiim(AM9303\S)98.46%
5Uncultured bacterium(GQ505035)100%
6Lactobacillus manihotivorans (EU195444)100% 10Uncultured bacterium(AY 119368)98.97% 13Uncultured bacterium(OQ\29335)99.49% 从表中可以看出，所测13个条带中，有6个条带(2、3、4、5、10、13)与不可培养菌株的序列相似度较高，说明在白酒大曲还存在着较多尚未被认识的微生物，同时也说明使用基于非培养手段的分子生物学技术直接对大曲样品总DNA分析有助于发现新的微生物种类，丰富酿酒微生物菌种资源。另外根据已经报道的研究结果证实，条带6代表的细菌 Lactobacillus manihotivorans只能够通过DGGE才能检测到，而不能用培养的方法鉴定， 因此DGGE技术能够有效克服部分微生物由于不可分离性造成难以直接研究的技术难题，也为更好的揭示大曲微生物群落结构以及深入研究大曲生产过程和酿酒过程中的发酵机理提供强有力的技术支持。
权利要求
1.一种研究大曲细菌群落结构多样性的方法，其特征在于包含以下步骤a)选择用于分析的大曲样品；b)称取一定量的大曲样品，酶法提取基因组DNA;c)选择对大多数细菌和古细菌的16SrRNA基因V3区具有特异性的引物对F338gc和R518引物对，并在引物对正向引物一端加上GC发夹结构，引物对的序列为F338gc (5 ‘ -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3 ‘，下划线部分为发夹结构),R518 (5' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ‘)；d)以步骤b)中提取的基因组DNA为模板，以步骤c)中的引物对为引物进行PCR扩增，PCR产物用0. 8%琼脂糖凝胶电泳进行检测；e)将步骤d)中得到的PCR反应产物用DGGE电泳设备进行分离，电泳仪器采用Bio-Rad公司基因突变检测系统(Dcode Universal Mutation Detection System)；电泳条件为电压100V，60°C电泳15h，丙烯酰胺浓度为8 %，变性剂梯度为40 % 60 %，100 %变性剂由7mol/L的尿素和质量浓度为40%的去离子甲酰胺组成；f)电泳结束后使用EB(溴化乙锭)对凝胶进行染色后脱色，在凝胶成像系统中拍照并保存图像；g)对DGGE图谱中优势微生物代表的条带进行切胶回收将条带在紫外灯下用无菌手术刀切下，放入无菌离心管中，轻轻捣碎，加入200 μ L无菌双蒸水于4°C冰箱静置过夜；h)切胶条带重新PCR扩增经胶回收试剂盒纯化后连接T载体、转化大肠杆菌进行蓝白斑筛选，对筛选到的白色菌落进行阳性克隆验证；i)确认为阳性克隆后，将克隆转接至LB液体培养基中37°C培养过夜后送交测序公司测序；j)序列返回后，登陆GENEBANK进行序列比对。
2.权利要求1的方法，其特征在于步骤b)中称取的是Ig大曲样品，使用酶法提取大曲中基因组DNA。
3.权利要求1的方法，其特征在于步骤d)中PCR扩增策略采用降落PCR(TOUCHDOWN)预变性条件为94°C 5min，前20个循环为94°C lmin、65°C 55°C 50s和72°C 3min(其中每个循环后复性温度下降0. 5°C )，后10个循环为94°C lmin、55°C 50s和72°C 3min，最后在72°C下延伸 IOmin0
全文摘要
本发明涉及一种研究大曲细菌群落结构多样性的方法，即梯度变性凝胶电泳(DGGE)技术，属于微生物生态技术领域，主要步骤如下1)直接提取大曲基因组DNA；2)选择细菌通用引物，扩增细菌核糖体DNA中的特异性DNA片段；3)DGGE电泳分离PCR产物；4)切胶回收DGGE指纹图谱中微生物对应的条带；5)重新PCR，将产物连接至T载体，蓝白斑筛选并进行阳性克隆验证；6)测序获得DGGE条带对应微生物的种属信息。本发明是不依赖于传统培养方法的分子生物学技术，具有灵敏、方便、准确的特点，解决了对某些不能或难以培养的微生物进行研究的难题，为鉴定大曲细菌群落结构、发现新的酿酒微生物或功能微生物提供了技术依据。
文档编号C12Q1/04GK102382877SQ20101026638
公开日2012年3月21日 申请日期2010年8月30日 优先权日2010年8月30日
发明者孟镇, 熊正河, 钟其顶 申请人:中国食品发酵工业研究院