专利名称：用于评价动物肠道微生物群落多样性的微生物基因组dna间接提取方法
技术领域：
本发明涉及一种用于评价动物肠道微生物群落多样性的微生物基因组DNA间接提取方法。
背景技术：
动物肠道内存在着大量的微生物菌群，这些微生物对机体的营养、免疫、生长发育等方面有着巨大的影响。它们的分离和鉴定对于研究肠道菌群功能及与机体的相互关系非常重要。传统方法主要是把肠道微生物通过选择性培养基分离培养后，再进行纯菌的分类 鉴定。该技术不仅费时、费力，只能检测可培养微生物，而对肠道中大量未知的不可培养微生物无能为力。随着近年来现代生物技术的快速发展，大量分子生物学技术应用于肠道微生态学研究中，从动物肠道中提取基因组DNA是非常有用的方法，可用于检测不可培养的微生物，反映肠道微生物之间及微生物与宿主间的真实相互关系，使我们能够对肠道微生物有更完整的评价，也可以用来揭示肠道微生物生态系统中的基因的多样性及其随肠道环境的变化。这就要求从动物粪便样品中抽提和纯化肠道微生物基因组DNA。通过对样品中微生物基因组DNA的研究从而间接了解其中微生物的分布和组成情况。而建立高效、准确的微生物基因组DNA间接提取方法也成为了肠道微生物分子生态学研究的一个技术关键所在。基因组DNA提取的主要目标是获得最高的DNA回收，从而从微生物群落中获得最具代表性的DNA，并进行进一步的分子操作(如PCR、SSCP, DGGE, TGGE, AFLP等)。但是来自动物肠道的样品含有非常复杂的成分，尤其是脂类、酸类等有机物质在基因组DNA提取过程中很难去除，直接影响后续的PCR扩增、杂交、内切酶消化和细菌转化等。此外，细胞裂解后粗提DNA的每一个纯化步骤，例如在DNA分子研究之前进行的重复性纯化步骤，不可避免的引起了 DNA的损失。大部分基因组DNA提取方法全都存在缺陷，例如细胞裂解不完全，DNA吸附于样品表层，样品提取物中含有酶抑制剂以及DNA的丢失、降解和剪切。另外，目前还大多沿用传统的DNA制备方法，即酚/氯仿抽提法。该技术操作步骤复杂，样品需要量大，DNA收率低，难以快速处理大量标本。另外，酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染，有损操作者的健康。因此，需要研究适用于动物肠道微生物DNA提取的方便、快捷、实用的方法，以解决使用常规方法所获得的DNA样品存在酸类等PCR抑制物以及细胞裂解率低、DNA损失严
重等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于评价动物肠道微生物群落多样性的微生物基因组DNA间接提取方法，利用细菌的平均密度(I. I U g/cm3)小于粪便样品的平均密度(I. 7-2. 3 ii g/cm3)，在细胞裂解以前对样品进行前处理，将微生物细胞从它们肠道样品中分离出来，以解决在肠道微生物细胞裂解后，纯化步骤存在污染物去除困难和DNA回收率低等问题。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。所述的用于评价动物肠道微生物群落多样性的微生物基因组DNA间接提取方法，包括以下步骤I)向0. I-IOg动物粪便样品中加入0. I-IOmL预冷的无菌水混匀后，漩涡震荡5-20分钟，然后加入0. I-IOmL匀浆缓冲液A，漩涡震荡5-20分钟，室温40_400g离心，收集上清液转移至另一离心瓶中；2)向上述步骤I)得到的沉淀物中加入0. 2-20mL预冷的匀浆缓冲液B洗涤重悬，漩涡震荡5-20分钟，50-400g室温离心10分钟，取上清液与步骤I)所得上清液合并；3)将上述步骤2)得到的上清液室温下6000-15000rpm离心10-60分钟以回收菌体细胞；4)向上述步骤3)回收得到的菌体细胞中加入I-IOOml的洗涤液C，洗涤2_10分钟，室温下6000-15000rpm离心10-60分钟以沉淀菌体细胞，其中洗涤液C为lg/L的焦磷酸钠；5)向上述步骤4)得到的沉淀后的菌体细胞中加入20-200ul 50mg/ml的溶菌酶和10-50ul 20mg/ml的蛋白酶K，20_40°C水浴10-40分钟，然后加入50-500 细胞裂解液D,轻轻颠倒混勻1-10分钟，6000-15000rpm离心5_10分钟,沉淀碎片；6)将上述步骤5)得到的上清转移到一个干净的离心管中，加入100-1500 U I蛋白去除液E到管中，用手轻轻颠倒混匀，室温放置5-10分钟，8000-15000rpm离心3_10分钟以沉淀蛋白质；7)将上述步骤6)得到的上清转移到一个干净的离心管中，加入2-5倍体积DNA联接液F到离心管中，用手颠倒1-5分钟混匀；8)将上述步骤7)得到混合液加入一个含结合柱的收集管中，室温放置1-5分钟，3000-10000rpm离心1_3分钟，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入离心管中，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕；9)将上述步骤8)含结合柱的收集管放置在一个新的离心管中，加入300-700 ill洗涤液G到结合柱中，10000-13000rpm离心，倒掉收集管中的废液；10)将上述步骤9)的结合柱重新放回收集管中，并加入400-750 i! I洗涤液H到结合柱中，8000-18000rpm离心，倒掉收集管中废液，重复上述步骤一次；11)将上述步骤10)的结合柱重新放回收集管，8000-18000rpm离心1-5分钟；12)将上述步骤11)的结合柱装入新的离心管中，室温放置，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30-50 u I洗脱液I，不戳破膜，室温放置，8000-15000rpm离心1_3分钟，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20°C ;其中洗脱液I为0. ImM的Tris-HCl，pH=9. O。其中，上述间接提取方法中，所述匀浆缓冲液A由20-400mM Tris、15_200mM EDTA,50-350mM NaCl、0. 5-3%pvpp,0. 1-1% TEEPOL(R) 6IOS 组成，pH=6. 0-9. 0，其中 pvpp 的单位为 g/L ;优选由 200mM Tris、100mMEDTA、200mM NaCl、2%pvpp、0. 5%TEEP0L(R)6IOS 组成，pH=7. 5。所述匀浆缓冲液B 由 10-200mM Tris、5_100mM EDTA、25_350mM NaCl,0. 2-1. 5%pvpp 组成，0. 1-1%TEEP0L(R)610 S 组成，pH=6. 0-9. 0 ;优选由 IOOmM TrisUOOmMEDTA、150mMNaCl、l%pvpp、0. 5%TEEP0L(R) 6IOS 组成，pH=7. 5。所述细胞裂解液D由 lwt%SDS(十二烷基硫酸钠)、20-60mM Tris、100_200mM NaCl,40-100mM EDTA 组成，pH=8. 0 ;优选由 lwt%SDS、40mMTris、150mM NaCl、60mM EDTA 组成，pH=8. O0所述蛋白去除液E由2-5M KAc、2_8wt%冰醋酸组成；优选由3M KAc、4wt%冰醋酸组成。所述DNA联接液F由5-10M异硫氰酸胍、200_600mM醋酸钾组成，pH=4. 5-6. 0 ;优选由8M异硫氰酸胍、500mM醋酸钾组成，pH=5. 5。所述洗涤液G由6M异硫氰酸胍、23mM柠檬酸钠组成。所述洗漆液H由70wt%乙醇、150mM醋酸钾组成，pH=5. O。本发明的间接提取方法，具有以下优点⑴操作简单，不需要较为复杂的设备，常规生物化学或微生物学实验室就可完成；并且涉及的试剂均为常规分析、分子生物学使用的试剂，相对于市场上的试剂盒成本低。⑵本发明方法是在细胞裂解以前对样品进行前处理，将微生物细胞从它们粪便样品中分离出来，避免了纯化步骤存在污染物去除困难和DNA回收率低的问题。⑶本发明方法适用性强，提取的肠道微生物DNA的0D26Q/0D23Q及0D26(l/0D28(l接近标准值，可直接应用于分子操作来评价植物根系微生物群落多样性。⑷提取过程不使用酚、氯仿，减少对实验人员的身体健康伤害、所获DNA完整，分子片段大于10kb，产量高。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。EDTA (乙二胺四乙酸)、Tris (三羧基甲基氨基甲烷)、SDS (十二烷基硫酸钠)、NaCl、乙醇、焦磷酸钠、pvpp (交联聚乙烯吡咯烷酮)、硫酸铝、异硫氰酸胍、KAc (醋酸钾)、冰醋酸、醋酸钾、柠檬酸钠等试剂均为国产分析纯药品。TEEPOL (R) 6IOS(洗涤剂)购自SPECTRUM-USP公司。溶菌酶和蛋白酶K为上海生工进口分装。实施例II)向0. 5g试验用小白鼠动物粪便样品中加入0. 5mL预冷的无菌水混匀后，漩涡震荡10分钟，然后加入0. 5mL匀浆缓冲液A，漩涡震荡10分钟，低速(250g)室温离心10分
钟，收集上清液转移至另一离心瓶中。2)向上步所得的沉淀物中加入ImL预冷的匀浆缓冲液B洗涤重悬，漩涡震荡10分钟，低速(250g)室温离心10分钟，取上清液，与步骤I)所得上清液合并，室温下IOOOOrpm离心30分钟以回收菌体细胞，弃上清。3)向上步所得的菌体细胞中加入I. 5ml的洗涤液C，洗涤5分钟，室温下IOOOOrpm离心30分钟以沉淀菌体细胞。向沉淀后的菌体细胞中加入160ul溶菌酶(50mg/ml)和20ul蛋白酶K (20mg/ml)，37°C水浴30-40分钟，然后加入122^1细胞裂解液D，漩涡震荡5_20分钟。13000rpm离心10分钟,沉淀碎片。
4)将上步所得的上清转移到一个干净的离心管中，加入250 iU蛋白去除液E到管中，用手轻轻颠倒混勻10次，室温放置5分钟，13000rpm离心5分钟。5)将上步所得的上清 转移到一个干净的离心管中，加入3倍体积DNA联接液F到离心管中，用手颠倒混匀1-5分钟。6)将上步所得的混合液加入一个含结合柱的收集管中，室温放置2分钟。6000rpm离心I分钟，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入离心管中，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕。7)将上述含结合柱的收集管放置在一个新的离心管中，加入500 ill洗涤液G到结合柱中，13000rpm离心I分钟，倒掉收集管中的废液。8)将结合柱重新放回收集管中，并加入650 ii I洗涤液H到结合柱中，13000rpm离心I分钟，倒掉收集管中的废液，重复上述步骤一次。9)将结合柱重新放回收集管，13000rpm离心2分钟。10)将结合柱装入一个新的离心管中，室温放置数分钟，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30 u I洗脱液I。不要戳破膜，室温放置2分钟。13000rpm离心I分钟，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20°C。以上溶液的加入量均可根据提取样品的量的增加，而成比例增加。用分光光度计测定0D23(i、OD260 和 OD28tl,结果表明 0D26(i/0D23(i=2. 01，OD260/OD280=L 80，接近于标准值(注0D26Q/0D23Q标准值为2. 0，0D26(l/0D28(l标准值为I. 8)，可直接应用于分子操作，来评价评价动物肠道微生物群落多样性。实施例2I)向0. 5g试验用大鼠粪便样品中加入0. 5mL预冷的无菌水混勻后,镟润震荡10分钟，然后加入0. 5mL匀浆缓冲液A，漩涡震荡10分钟，低速(250g)室温离心10分钟，收集
上清液转移至另一离心瓶中。2)向上步所得的沉淀物中加入ImL预冷的匀浆缓冲液B洗涤重悬，漩涡震荡10分钟，低速(250g)室温离心10分钟，取上清液，与步骤I)所得上清液合并，室温下IOOOOrpm离心30分钟以回收菌体细胞，弃上清。3)向上步所得的菌体细胞中加入I. 5ml的洗涤液C，洗涤5分钟，室温下IOOOOrpm离心30分钟以沉淀菌体细胞。向沉淀后的菌体细胞中加入160ul溶菌酶(50mg/ml)和20ul蛋白酶K (20mg/ml)，37°C水浴30-40分钟，然后加入122^1细胞裂解液D，漩涡震荡5_20分钟。13000rpm离心10分钟,沉淀碎片。4)将上步所得的上清转移到一个干净的离心管中，加入250 Ul蛋白去除液E到管中，用手轻轻颠倒混勻10次，室温放置5分钟，13000rpm离心5分钟。5)将上步所得的上清转移到一个干净的离心管中，加入3倍体积DNA联接液F到离心管中，用手颠倒混匀1-5分钟。6)将上步所得的混合液加入一个含结合柱的收集管中，室温放置2分钟。6000rpm离心I分钟，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入离心管中，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕。7)将上述含结合柱的收集管放置在一个新的离心管中，加入500 ill洗涤液G到结合柱中，13000rpm离心I分钟，倒掉收集管中的废液。
8)将上述结合柱重新放回收集管中，并加入650iil洗涤液H到结合柱中，13000rpm离心I分钟，倒掉收集管中废液，重复上述步骤一次。9)将结合柱重新放回收集管，13000rpm离心2分钟。10)将结合柱装入新的离心管中，室温放置数分钟，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30 u I洗脱液I。不要戳破膜，室温放置2分钟。13000rpm离心I分钟，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20°C。以上溶液的加入量均可根据提取样品的量的增加，而成比例增加。
用分光光度计测定OD230^OD260 OD280,结果表明 OD260/OD230=2. 03，OD260/OD280=l. 82，接近于标准值(注OD26tlAD23tl标准值为2. 0，0D26(l/0D■标准值为I. 8)，可直接应用于分子操作，来评价评价动物肠道微生物群落多样性。实施例3I)向0. 5g试验用白兔粪便样品中加入0. 5mL预冷的无菌水混勻后,镟润震荡10分钟，然后加入0. 5mL匀浆缓冲液A，漩涡震荡10分钟，低速(250g)室温离心10分钟，收集
上清液转移至另一离心瓶中。2)向上步所得的沉淀物中加入ImL预冷的匀浆缓冲液B洗涤重悬，漩涡震荡10分钟，低速(250g)室温离心10分钟，取上清液，与步骤I)所得上清液合并，室温下IOOOOrpm离心30分钟以回收菌体细胞，弃上清。3)向上步所得的菌体细胞中加入I. 5ml的洗涤液C，洗涤5分钟，室温下IOOOOrpm离心30分钟以沉淀菌体细胞。向沉淀后的菌体细胞中加入160ul溶菌酶(50mg/ml)和20ul蛋白酶K (20mg/ml)，37°C水浴30-40分钟，然后加入122^1细胞裂解液D，漩涡震荡5_20分钟。13000rpm离心10分钟,沉淀碎片。4)将上步所得的上清转移到一个干净的离心管中，加入250 Ul蛋白去除液E到管中，用手轻轻颠倒混勻10次，室温放置5分钟，13000rpm离心5分钟。5)将上步所得的上清转移到一个干净的离心管中，加入3倍体积DNA联接液F到离心管中，用手颠倒混匀1-5分钟。6)将上步所得的混合液加入一个含结合柱的收集管中中，室温放置2分钟。6000rpm离心I分钟，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入离心管中，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕。7)将上述含结合柱的收集管放置在一个新的离心管中，加入500 ill洗涤液G到结合柱中，13000rpm离心I分钟，倒掉收集管中的废液。8)将上述结合柱重新放回收集管中，并加入650iil洗涤液H到结合柱中，13000rpm离心I分钟，倒掉收集管中废液，重复上述步骤一次。9)将结合柱重新放回收集管，13000rpm离心2分钟。10)将结合柱装入新的离心管中，室温放置数分钟，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30 u I洗脱液I。不要戳破膜，室温放置2分钟。13000rpm离心I分钟，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20°C。以上溶液的加入量均可根据提取样品的量的增加，而成比例增加。用分光光度计测定OD230^OD260 OD280,结果表明 OD260/OD230=2. 03，OD260/OD280=l. 78，接近于标准值(注OD26tlAD23tl标准值为2. 0，0D26(l/0D■标准值为I. 8)，可直接应用于分子操作，来评价评价动物肠道微生物群落多样性 。
权利要求
1.一种用于评价动物肠道微生物群落多样性的微生物基因组DNA间接提取方法，其特征在于，包括以下步骤 1)向O.I-IOg动物粪便样品中加入O. I-IOmL预冷的无菌水混匀后，漩涡震荡5_20分钟，然后加入O. I-IOmL匀浆缓冲液A，漩涡震荡5-20分钟，室温40_400g离心，收集上清液转移至另一离心瓶中； 2)向上述步骤I)得到的沉淀物中加入O.2-20mL预冷的匀浆缓冲液B洗涤重悬，漩涡震荡5-20分钟，室温50-400g离心，取上清液与步骤I)所得上清液合并； 3)将上述步骤2)得到的上清液室温下6000-15000rpm离心10-60分钟以回收菌体细胞； 4)向上述步骤3)回收得到的菌体细胞中加入I-IOOml的洗涤液C，洗涤2_10分钟，室温下6000-15000rpm离心10-60分钟以沉淀菌体细胞，其中洗涤液C为lg/L的焦磷酸钠； 5)向上述步骤4)得到的沉淀后的菌体细胞中加入20-200ul50mg/ml的溶菌酶和10-50ul 20mg/ml的蛋白酶K，20_40°C水浴10-40分钟，然后加入50-500 μ I细胞裂解液D，轻轻颠倒混勻1-10分钟，6000-15000rpm离心5_10分钟,沉淀碎片； 6)将上述步骤5)离心得到的上清转移到一个干净的离心管中，加入100-1500μ I蛋白去除液E到管中，用手轻轻颠倒混匀，室温放置5-10分钟，8000-15000rpm离心3_10分钟以沉淀蛋白质； 7)将上述步骤6)得到的上清转移到一个干净的离心管中，加入2-5倍体积DNA联接液F到离心管中,用手颠倒1-5分钟混匀； 8)将上述步骤7)得到混合液加入一个含结合柱的收集管中，室温放置1-5分钟，3000-10000rpm离心1_3分钟，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入离心管中，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕； 9)将上述步骤8)含结合柱的的收集管放置在一个新的离心管中，加入300-700μ I洗涤液G到结合柱中，10000-13000rpm离心，倒掉收集管中的废液； 10)将上述步骤9)的结合柱重新放回收集管中，并加入400-750μ I洗涤液H到结合柱中，8000-18000rpm离心，倒掉收集管中废液，重复上述步骤一次； 11)将上述步骤10)的结合柱重新放回收集管，8000-18000rpm离心1_5分钟； 12)将上述步骤11)的结合柱装入一新的离心管中，室温放置，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30-50 μ I洗脱液I，不戳破膜，室温放置，8000-15000rpm离心1_3分钟，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20°C ;其中洗脱液I为O. ImM的Tris-HCl，pH=9. O。
2.根据权利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述匀浆缓冲液A由20-400mMTris,15-200mM EDTA、50_350mM NaCl、0. 5_3%pvpp，O. 1_1%TEEP0L(R) 610S 组成，pH=6. 0-9. 0,其中pvpp的单位为g/L。
3.根据权利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述匀浆缓冲液B为10-200mMTris、5-100mM EDTA、25_350mM NaCl、0. 2_1· 5%pvpp 组成，0. 1_1%TEEP0L(R)610S 组成，ρΗ=6· 0-9. O0
4.根据权利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述细胞裂解液D由lwt%SDS、20-60mM TrisU00-200mM NaCl、40_100mM EDTA 组成，ρΗ=8· 0。
5.根据权利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述蛋白去除液E由2-5ΜKAc,2-8被％冰醋酸组成。
6.根据权利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述DNA联接液F由5-10M异硫氰酸胍、200-600mM 醋酸钾组成，ρΗ=4· 5-6. O。
7.根据权利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述洗涤液G由6Μ异硫氰酸胍、23mM柠檬酸钠组成。
8.根据权利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述洗涤液H由70%乙醇、150mM醋酸钾组成，pH=5. O。
全文摘要
本发明涉及一种用于评价动物肠道微生物群落多样性的微生物基因组DNA间接提取方法。该方法在细胞裂解以前先对样品进行前处理，将微生物细胞从它们粪便样品中分离出来，避免了纯化步骤存在污染物去除困难和DNA回收率低的问题。本发明提取过程不使用酚、氯仿，减少了对实验人员的身体健康伤害。所提取的肠道微生物DNA的OD260/OD230及OD260/OD280接近标准值，可直接应用于分子操作，以评价动物肠道微生物群落多样性。
文档编号C12N15/10GK102978198SQ20121049967
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年11月29日
发明者王金斌, 唐雪明, 李文, 祝子坪, 李鹏, 刘华, 白蓝, 蒋玮, 何建华, 陈大超, 赵凯 申请人:上海市农业科学院