专利名称：一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的效力检验方法
技术领域：
本发明涉及一种兽用灭活疫苗的效力检验方法，尤其涉及一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力的检验方法，属兽用生物制品检验技术领域。
背景技术：
鸭出血性卵巢炎(Duck Hemorrhagic Ovaritis, DH0)是新近流行的、急性、高度接触性的一种新型鸭传染病，其病原为鸭出血性卵巢炎病毒 (Duck Hemorrhagic OvaritisVirus, DH0V),在病毒分类上属于黄病毒科的成员，感染不同日龄鸭，引起性成熟鸭卵巢出血、睾丸萎缩、产蛋量、受精率和孵化率下降，鸭死淘率增加。在病毒分类地位的研究中，通过对分离病毒株的F4代鸭胚传代病毒的基因组序列与已知的病毒进行序列同源性分析和进化分析，发现该病毒与黄病毒科黄病毒属的坦布苏病毒的遗传距离最近。在诊断方面，曹贞贞、万春和、苏敬良、滕巧泱等人报道可以采用临床症状、大体及组织病理变化、RT-PCR扩增和病毒分离等方法确诊该病。关于该病的防控，北京市农林科学院和瑞普(保定)生物药业有限公司、齐鲁动物保健品有限公司、福建省农业科学院畜牧兽医研究所和重庆市农科院畜牧兽医研究所报道了利用该病暴发期间所分离的毒株制备疫苗的方法。林健、刘月焕等报道了利用产蛋鸭成功建立了鸭出血性卵巢炎的人工感染模型，为疫苗的评价奠定了实验基础。尚未见有客观、可行、操作性强和科学的疫苗效力评价方法的详细报道。
发明内容
本发明目的之一是提供一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力评价鸭的日龄范围。本发明目的之二是提供鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力评价用疫苗免疫次数、采样时间、采集的组织样本。本发明目的之三是提供一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力评价方法。本发明所用病毒毒株命名为鸭出血性卵巢炎病毒HB株，保藏号为CCTCCV201122 ;所述鸭出血性卵巢炎病毒是ssRNA病毒，有囊膜，能够凝集鸽红细胞；病毒颗粒大体呈球状，直径40 60nm ;所述病毒对外界环境的抵抗力较强，在4°C中存放几周，在-20°C中存放几个月，其感染力均不受影响；所述病毒对乙醚、氯仿敏感；大多数去污剂能将它迅速灭活；在371条件下，用0. I %福尔马林熏蒸6h便可把它灭活。该病毒可在9 13日龄鸭胚尿囊腔、胚绒毛尿囊膜，9 10日龄鸡胚尿囊腔、胚绒毛尿囊膜，6日龄鸡胚卵黄囊，7 8日龄鸭胚卵黄囊中培养，也可在鸭胚成纤维细胞和BHK21细胞上培养。本发明所用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的制备方法已于2011年申报发明专利，申请号为 201110255115. I。本发明提供一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力检验方法，该方法使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗免疫鸭，共免疫2次，首免后2周进行二免，采集二免后3飞周的鸭血清进行ELISA抗体检测，非免疫对照组鸭ELISA抗体阳性率为0%，ELISA抗体阳性率为不低于80%判为疫苗效力检验合格。进一步地，本发明方法根据易感性实验结果，确定鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力检验用鸭的日龄为42飞60日龄。进一步地，本发明方法中2次免疫的剂量为0. 5ml/只 2ml/只。进一步地，本发明提供的一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力检验方法是使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗免疫42 560日龄鸭，首免后2周进行二免，采集二免后3飞周的鸭血清，使用ELISA抗体检测试剂盒检测免疫鸭血清，进行效力评价。进一步地，上述ELISA抗体检测是以纯化的黄病毒科病毒为包被抗原的ELISA检测试剂盒。进一步地，所述的鸭为肉用鸭、蛋用鸭或SPF鸭。
本发明提供的一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗效力检验方法，具体是使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗免疫42 560日龄鸭，同时设一定数量的非免疫对照组鸭；首免后2周进行二免，两次免疫的剂量均为0. 5ml/只 2ml/只，采集二免后3飞周的鸭血清，使用ELISA抗体检测试剂盒检测免疫鸭血清，进行效力评价，非免疫对照组鸭ELISA抗体阳性率为0%，免疫组鸭ELISA抗体阳性率> 80%，判定疫苗效力检验合格。进一步地，上述ELISA抗体检测试剂盒是以纯化的黄病毒科病毒为包被抗原的ELISA检测试剂盒。进一步地，所述的鸭为肉用鸭、蛋用鸭或SPF鸭。本发明首次提出了用于鸭出血性卵巢炎灭活疫苗血清学效力检验使用鸭的日龄、 疫苗效力检验时疫苗的免疫次数、取材时间、采集的组织样本，提出了血清学ELISA疫苗效力检验方法、判定标准及疫苗质量合格的标准。解决了鸭出血性卵巢炎灭活疫苗血清学效力评价方法和判定标准的空白。本发明确定的方法客观、全面、操作性强，可用于鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的实验室和临床效力评价。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的生物、化学试剂均为常规市售，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用的北京鸭购自鸭出血性卵巢炎抗体阴性鸭场(北京金星鸭业中心南口种鸭场)，麻鸭购自鸭出血性卵巢炎抗体阴性鸭场(北京延庆县四海镇珍珠泉下花楼村)，SPF鸭由购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心的SPF鸭蛋孵化，SPF鸡隔离器中饲养至试验所需日龄。易感鸭的检验标准5只来自未经鸭出血性卵巢炎灭活疫苗免疫或有鸭出血性卵巢炎流行史鸭群的鸭，每只鸭口服I. 0毫升无菌0. 5%水解乳蛋白Hank’ s液100倍稀释的检验用毒株。攻毒后4-5日，采血，分离血清进行病毒分离。病毒分离率应至少4/5阳性，判断检验用鸭为易感鸭。实施例I鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(ELISA抗体测定法)效力检验用鸭的日龄、免疫剂量、采样时间(I)
使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(批号201101，北京市农林科学院畜牧兽医研究所和瑞普(保定)生物药业有限公司研制)免疫560日龄且未感染DHOV的麻鸭10只，0. 5ml/只，胸部肌肉注射。首免后2周按照相同剂量和相同途径进行二免，采集二次免疫后4周鸭的血清，使用附注的ELISA抗体检测方法检测免疫鸭血清，非免疫对照组鸭ELISA抗体阳性率为0%，免疫组鸭ELISA抗体阳性率为80%，说明疫苗效力检验合格。实施例2鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(ELISA抗体测定法)效力检验用鸭的日龄、免疫剂量、采样时间(2)使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(批号201102，北京市农林科学院畜牧兽医研究所和瑞普(保定)生物药业有限公司研制)免疫42日龄且未感染DHOV的北京鸭10只，Iml/只，胸部肌肉注射。首免后2周按照相同剂量和相同途径二免，采集二次免疫后4周鸭的血 清，使用附注的ELISA抗体检测方法检测免疫鸭血清，非免疫对照组鸭ELISA抗体阳性率为0%，免疫组鸭ELISA抗体阳性率为90%，说明疫苗效力检验合格。实施例3鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(ELISA抗体测定法)效力检验用鸭的日龄、免疫剂量、采样时间(3)使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(批号201103，北京市农林科学院畜牧兽医研究所和瑞普(保定)生物药业有限公司研制)免疫180日龄且未感染DHOV的北京鸭10只，2ml/只，胸部肌肉注射。首免后2周按照相同剂量和相同途径二免，采集二次免疫后4周鸭的血清，使用附注的ELISA抗体检测方法检测免疫鸭血清，非免疫对照组鸭ELISA抗体阳性率为0%，免疫组鸭ELISA抗体阳性率为100%，说明疫苗效力检验合格。实施例4鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(ELISA抗体测定法)效力检验用鸭的日龄、免疫剂量、采样时间(4)使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(批号201104，北京市农林科学院畜牧兽医研究所和瑞普(保定)生物药业有限公司研制)免疫560日龄且未感染DHOV的SPF鸭10只，0. 5ml/只，胸部肌肉注射。首免后2周按照相同剂量和相同途径进行二免，采集二次免疫后3周鸭的血清，使用附注的ELISA抗体检测方法检测免疫鸭血清，非免疫对照组鸭ELISA抗体阳性率为0%，免疫组鸭ELISA抗体阳性率为80%，说明疫苗效力检验合格。实施例5鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(ELISA抗体测定法)效力检验用鸭的日龄、免疫剂量、米样时间(5)使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(批号201105，北京市农林科学院畜牧兽医研究所和瑞普(保定)生物药业有限公司研制)免疫300日龄且未感染DHOV的麻鸭10只，Iml/只，胸部肌肉注射。首免后2周按照相同剂量和相同途径进行二免，采集二次免疫后5周鸭的血清，使用附注的ELISA抗体检测方法检测免疫鸭血清，非免疫对照组鸭ELISA抗体阳性率为0%，免疫组鸭ELISA抗体阳性率为80%，说明疫苗效力检验合格。实施例6鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(ELISA抗体测定法)效力检验用鸭的日龄、免疫剂量、米样时间(6)使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗(批号201106，北京市农林科学院畜牧兽医研究所和瑞普(保定)生物药业有限公司研制)免疫400日龄且未感染DHOV的北京鸭10只，2ml/只，胸部肌肉注射。首免后2周按照相同剂量和相同途径进行二免，采集二次免疫后5周鸭的血清，使用附注的ELISA抗体检测方法检测免疫鸭血清，非免疫对照组鸭ELISA抗体阳性率为0%，免疫组鸭ELISA抗体阳性率为80%，说明疫苗效力检验合格。实施例7直接竞争-ELISA试剂盒的制备与抗体测定I.试剂盒组成
酶标板96孔板阳性对照血清Iml阴性对照血清Iml酶标抗体IOml
底物液(A、B液)5ml 洗液20ml(100倍浓缩液)
样品稀释液I Oml
说明书I份2.材料2. I生物材料抗原纯化病毒抗原抗体抗原病毒单抗辣根过氧化物酶2. 2 耗材酶标板深圳金灿华容器(瓶)深圳金灿华2.3ELISA 板制备2. 3. I病毒的纯化鸭出血性卵巢炎细胞适应病毒株DHOV-HB株(F5代)接种DEF(鸭胚成纤维细胞)，当CPE出现85%时，收获病毒。冻融I次后，3500rpm离心15min，取上清液，再经IOOOOrpm离心30min，取上清液，经中空纤维柱浓缩，PEG6000沉淀，蔗糖密度梯度离心，取30%与45%之间的明亮带，经STE缓冲液稀释和离心处理后获得纯化病毒。2. 3. 2病毒包被利用pH9. 6的碳酸盐缓冲液(配方见附注I)将病毒1000倍稀释，以IOOul/孔的剂量加入到96孔板中，4°C条件下包被12 16h。2. 3. 3洗板洗液洗板5次，每孔加满。每次间隔30秒。2. 3. 4封闭洗板后酶标板，拍干。加入封闭液200ul。4°C过夜，或36度I小时。2. 3. 5干燥封闭后酶标板弃去封闭液，吹干后备用。2. 3. 6包装用铝箔封装。2. 4酶标抗体的制备采用过碘酸钠法将辣根过氧化物酶标记在鸭出血性卵巢炎病毒E蛋白单克隆抗体，制备成紫外分光光度计280nm处A值约为2. 5酶结合物标记的抗体。2. 5待检样本抗体的测定2. 5. I在已经包被的ELISA板各孔中均加入50 ii L样品稀释液；2. 5. 2A1孔和BI孔各加50 U L阳性血清；C1孔和Dl孔各加50 U L阴性血清，见制备方法(7);其余各孔中分别加入50 y L待测血清。2. 5. 321。。±5。。孵育 90min±6min，。2. 5. 4移去各孔液体，用300 ii L冲洗液洗涤3次。2. 5. 5各孔加入100 ii L I倍稀释的辣根过氧化物酶标记抗体。2. 5. 62 TC ± 5 °C 孵育 30min ± 3min。2. 5. 7移去各孔液体，用300 ii L冲洗液洗涤3次。2. 5. 8各孔中加入IOOii L底物溶液。2.5.9避光21°〇 ±5°C鮮育 15min±2min。
·
2. 5. 10在各孔中加入IOOii L终止液(2mol / L硫酸)终止反应。2. 5. 11使用酶标仪在450nm波长下读取并记录OD值。结果判定阴性对照的OD值大于0. 700试验成立。计算每个样品的S/N值S/N=样品OD值/阴性血清OD值X 100，并按下表进行判定。
SZNjt_判定结果
S/N < 40%阳性40% < S/N <
— 可疑
50%
S/N > 50%_哩_注意事项( I)底物溶液需避光保存，勿与氧化物接触。(2)为防止污染，所有在试验中使用过的一次性物品需经过高压灭菌。(3)临界值(cut-off)的确定检测300份阴性血清，计算其95%的可信限。一般是阴性对照的平均值X —个常数，这个常数一般是要据95%可信限获得(通常是2. IX阴性平均值)。本发明的试剂盒溶液或试剂的配方与制备(I) pH9. 6包被缓冲液(CB)的配方
_缝_歷_备注
Na2CO31.59 克NaHCO32.93 克
NaN3 0.2 克 _HaO_至 IOOOml_(2)洗液的配方 _m_m_
权利要求
1.ー种鸭出血性卵巣炎灭活疫苗效カ检验方法，其特征在于，使用鸭出血性卵巣炎灭活疫苗免疫鸭，免疫2次，首免后2周进行ニ免，采集ニ免后3飞周的鸭血清进行ELISA抗体检测，非免疫组ELISA抗体阳性率为0%，免疫组ELISA抗体阳性率为不低于80%判为疫苗效カ检验合格。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在干，效カ检验用鸭的日龄为42 560日龄。
3.如权利要求I所 述的方法，其特征在于，所述2次免疫的剂量为0.5ml/只 2ml/只。
4.如权利要求1-3任一所述鸭出血性卵巣炎灭活疫苗效カ检验方法，其特征在于所用的ELISA抗体检测是以纯化的黄病毒科病毒为包被抗原的ELISA检测试剂盒。
5.如权利要求1-3任一所述鸭出血性卵巣炎灭活疫苗效カ检验方法，其特征在于所述的鸭为肉用鸭、蛋用鸭或SPF鸭。
6.ー种鸭出血性卵巣炎灭活疫苗效カ检验方法，其特征在于，使用鸭出血性卵巣炎灭活疫苗免疫42 560日龄鸭，首免后2周进行ニ免，两次免疫的剂量均为0. 5ml/只 2ml/只；采集ニ免后3飞周的鸭血清，使用ELISA抗体检测试剂盒检测免疫鸭血清，进行效カ评价，非免疫对照组鸭ELISA抗体阳性率为0%，免疫组鸭ELISA抗体阳性率彡80%,判定疫苗效カ检验合格。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所用的ELISA抗体检测试剂盒是以纯化的黄病毒科病毒为包被抗原的ELISA检测试剂盒。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述的鸭为肉用鸭、蛋用鸭或SPF鸭。
全文摘要
本发明提供了鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的血清学效力检验方法，该方法使用鸭出血性卵巢炎灭活疫苗免疫鸭，免疫2次，首免后2周进行二免，采集二免后3~5周的鸭血清进行ELISA抗体检测，非免疫组ELISA抗体阳性率为0%，免疫组ELISA抗体阳性率为不低于80%判为疫苗效力检验合格。本发明提供的鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的血清学效力检验方法操作方便，结果准确、可广泛应用于鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的效力评价。
文档编号G01N33/15GK102735807SQ20121020229
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者何平有, 刘月焕, 刘浩, 徐倩倩, 朱秀同, 杨保收, 林健, 梁武, 段会娟, 毛雅园, 潘洁, 赵际成, 郁宏伟, 韩春华 申请人:北京市农林科学院畜牧兽医研究所, 瑞普(保定)生物药业有限公司