取蛋白后参照单抗操作标准制备单克隆抗体。一次制备的抗体可供多次使用，无需每次检测重新制备。
[0017]制备抗体后建立检测新城疫病毒的双夹心ELISA方法。将特异性NDV HN抗体包被固相载体一ELISA板(市售普通ELISA板即可)，室温作用30min后4°C条件下过夜，洗涤除去未结合的抗体和杂质。然后加入待检的NDV疫苗灭活中间品，37°C孵育lh，使标本中的抗原与固相载体上的抗体充分反应，形成固相抗原抗体复合物，洗涤除去其他未结合物质。加入酶标的NDV HN抗体，37°C孵育lh，使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物，洗漆除去未结合酶标抗体。最后加入显色底物DAB进行显色,通过分光光度计测定0D450的值，结合阴阳性对照，最终确定待检样品的灭活程度。如检测结果为阳性，则表明灭活中间品未灭活完全，结果为阴性时，则灭活中间品灭活完全。整个检测过程可在24小时内完成。
[0018]实施例2猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)灭活疫苗灭活程度的检测
氨基酸突变法研究证实，PRRSV NSPl蛋白185-232位氨基酸为具有空间构象表位，且具有中和病毒的活性。以NSPl蛋白或包含其185-232区域的部分为目的蛋白，昆虫细胞一杆状病毒表达系统为表达载体进行蛋白的表达，获得天然构象的蛋白。将蛋白纯化后免疫小鼠三次，每次间隔2周，最后一次免疫I周后采取全血，分离收集血清制备多克隆抗体。或者在获取蛋白后参照单抗操作标准制备单克隆抗体。一次制备的抗体可供多次使用，无需每次检测重新制备。
[0019]参照建立新城疫病毒的双夹心ELISA方法，建立针对PRRSV NSPl蛋白的双夹心ELISA检测方法。首先，将特异性PRRSV NSPl抗体包被固相载体一ELISA板(市售普通ELISA板即可)，室温作用30min后4°C条件下过夜，PBST洗涤除去未结合的抗体和杂质。其次，力口入待检的PRRSV细胞苗灭活中间品，37°C孵育lh，使标本中的抗原与固相载体上的抗体充分反应，形成固相抗原抗体复合物，PBST洗涤除去其他未结合物质。然后加入酶标的PRRSVNSPl抗体，37°C孵育lh，使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物，洗涤除去未结合酶标抗体。最后加入显色底物DAB进行显色，通过分光光度计测定0D450的值，结合阴阳性对照，最终确定待检样品的灭活程度。如检测结果为阳性，则表明灭活中间品未灭活完全，结果为阴性时，则灭活中间品灭活完全。整个检测过程可在24小时内完成。
[0020]对比例I Lasota株灭活疫苗灭活程度的检测
将灭活疫苗中间产品接种9-11日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，密封后置于孵化器中孵育，如病毒液灭活完全，则鸡胚培养5日后仍正常，无病变或死亡。
[0021]Lasota株灭活疫苗检测过程中，实施例1的检测结果同对比例I相同，但对比例I与实施例1相比，操作要求高、耗时长，且对比例I提供的方法在病变轻微时易发生漏检。
[0022]对比例2猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)灭活疫苗灭活程度的检测
将病毒灭活液处理后接种状态良好的Marcl45细胞，置于细胞培养箱中，如病毒液灭活完全，则细胞培养5日后仍正常，无CPE出现。如细胞出现CPE，则说明病毒存活并进行增殖，未灭活完全。
[0023]猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)灭活疫苗检测过程中，实施例2的检测结果同对比例2相同，但对比例2与实施例2相比，操作严格、成本高、耗时长，且对比例2提供的方法肉眼观察会受到CPE弱或延迟出现的影响而做出错误的判断。
[0024]本发明同样适应于其他灭活疫苗灭活程度的检测。
[0025]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种灭活疫苗灭活程度的检测方法，其特征在于:以灭活中间产品所含空间表位的灭活作为疫苗灭活完全的标志。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:中间产品经甲醛灭活后，以灭活中间产品所含的空间表位为目的蛋白，将此目的蛋白作为夹心ELISA法的检测对象，检测结果为阳性表明灭活不完全，阴性则表明灭活完全。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于:所述空间表位的确定方法有肽扫描、氨基酸突变、X-ray、质谱、噬菌体展示。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述夹心ELISA法包括以下步骤: (1)将特异性抗体包被固相载体ELISA板，孵育后洗涤除去未结合的抗体和杂质，加入待检样品抗原，孵育一定时间，使抗原与固相载体上的抗体充分反应，形成固相抗原抗体复合物； (2)洗涤除去其他未结合物质，随后加入酶标的特异性抗体，孵育使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物，洗涤除去未结合酶标抗体； (3)最后加入显色底物进行显色，通过分光光度计测定0D450的值，结合阴阳性对照，最终确定待检样品的灭活程度。
【专利摘要】本发明涉及一种灭活疫苗灭活程度的检测方法，属于生物制品检测技术领域，该检测方法具体是通过以下步骤实现的：病原经甲醛灭活后，结合确定的病原蛋白空间表位，以灭活中间产品所含的空间表位的灭活为标志，利用夹心ELISA法进行灭活疫苗的灭活程度的检测。本发明提供的检测方法是在明确疫苗灭活与空间表位关系的基础上，创新性的变害为利，利用蛋白空间表位在灭活过程和免疫检测中的特性，集成灭活原理、空间表位特征与筛选方法、免疫学检测方法而建立的，本发明提供的检测方法耗时短且安全性、检测精度及灵敏度高。
【IPC分类】G01N33-569, G01N33-68
【公开号】CN104698166
【申请号】CN201510115801
【发明人】张琳, 张秀美, 丁雅苓, 丁志勇, 黄庆华, 徐敏丽
【申请人】山东省农业科学院畜牧兽医研究所
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月17日