用于蛋白质分泌和木质纤维素降解的突变细胞的制作方法

用于蛋白质分泌和木质纤维素降解的突变细胞的制作方法
【专利摘要】本发明提供用于分泌蛋白质和用于降解木质纤维素类生物质的突变细胞。还提供利用这些细胞的方法。具体地，公开了真菌和酵母细胞中，β-葡萄糖苷酶和代谢阻遏基因creA/cre-1的组合型基因缺失在蛋白分泌中的利用。
【专利说明】用于蛋白质分泌和木质纤维素降解的突变细胞
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年3月15日提交的美国临时申请61/453，086的权益，其全部内容通过参考引入此处。
[0003]ASCII文本的序列表的提交
[0004]ASCII文本提交的内容通过参考其全部内容引入此处:序列表的计算机可读形式(CRF)(文档名称:677792001640SEQLIST.txt，记录日期:2012 年 3 月 14 日，大小:22KB)
【技术领域】
[0005]本发明涉及用于产生蛋白质，比如纤维素酶，和用于降解木质纤维素类生物质的突变细胞。具体地，提供用于产生蛋白质，比如纤维素酶，的突变细胞和方法。
【背景技术】
[0006]木质纤维素类生物质是用于生物燃料生产的、丰富的和可再生的原料。然而，将不溶性的木质纤维素类生物质初始转化为可透过细胞的和便于发酵的糖在生物燃料生产过程中存在重大的技术挑战和主要瓶颈。因此，需要改善方法，解锁木质纤维素类生物质作为多用途能源的全部潜力，来克服该瓶颈。
[0007]生物质的自然降解是通过真菌微生物分泌的木质纤维素降解酶实现的。例如，在新近烧焦的植物中，经常发现野生的丝状真菌和实验室模型生物粗糙脉孢菌(N.crassa),其分泌纤维素酶，并由此引发植物细胞壁的解聚作用。基于它们在木质纤维素降解中的天然角色，丝状真菌及其木质纤维素降解酶作为生物技术生产过程中的生物质降解的催化剂具有很大的潜力。
[0008]但是，鉴于在丝状真菌中纤维素酶的分泌是通过不溶性植物细胞壁成分，如纤维素，半纤维素，和木聚糖有效诱导的，可溶性诱导剂是不太有效的。例如，纤维二糖，作为纤维素酶的主要的可溶性最终产品，能够在若干种丝状真菌，包括红褐肉座菌(Hypocreajecorina)(里氏木霉(Trichoderma reesei ) ;T.reesei )和曲霉(黑曲霉，构巢曲霉，米曲霉)中诱导纤维素酶，但其诱导水平远低于纤维素本身。然而，不溶性诱导剂存在的一个问题是，纤维素酶能粘住不溶性诱导剂，导致分泌的酶活性的产量减少。
[0009]不溶性生物质的处理是异质加工并且进入生物质表面受真菌细胞的限制。因此，在丰富的真菌培养中，由于缺乏与产生诱导作用的植物表面的接触，大量的细胞将是自由浮动的，并且不分泌高水平的活化纤维素酶。为了在这种细胞悬浮液中优化蛋白质，包括纤维素酶，的生产并因此促进生物质的降解，需要这样的细胞系统:在用可溶性小分子，比如纤维糊精，诱导后，分泌高水平的活性蛋白。

【发明内容】

[0010]在此提供用于增加蛋白的分泌和用于木质纤维素类生物质的降解的突变细胞。也提供使用在此描述的突变细胞增加蛋白质的分泌和降解木质纤维素类生物质的方法。此外，本发明至少一部分是基于意外发现在丝状真菌，如粗糙脉孢菌中，突变型β-葡萄糖苷酶基因和/或分解代谢物阻遏基因cre-Ι，导致被纤维素类生物质，比如纤维二糖诱导时，增加蛋白质的分泌。不希望受限于理论，应该认为β -葡萄糖苷酶基因的活性和cre-Ι参与蛋白质的转录调控(图1)。
[0011]因此，本发明的一个方面提供一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，通过:(a)提供突变细胞，该突变细胞在两种或更多种β -葡萄糖苷酶基因中含有失活性突变；以及(b)将该突变细胞与纤维素类生物质接触，该纤维素类生物质诱导该突变细胞分泌蛋白质。在某些实施例中，该突变细胞在细胞的cre-Ι基因中进一步含有失活性突变。本发明的另一方面提供一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，通过:(a)提供突变细胞，该突变细胞在细胞的cre-Ι基因中含有失活性突变；以及(b)将该突变细胞与纤维素类生物质接触，该纤维素类生物质诱导该突变细胞分泌蛋白质。在某些实施例中，该突变细胞在两种或更多种葡萄糖苷酶基因中进一步含有失活性突变。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括纤维二糖。
[0012]因此，本发明的一个方面提供一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，通过:(a)提供突变细胞，该突变细胞在两种或更多种β -葡萄糖苷酶基因中含有失活性突变；以及(b)将该突变细胞与糖类接触，该糖类诱导该突变细胞分泌蛋白质。在某些实施例中，该突变细胞进一步在细胞的cre-Ι基因中含有失活性突变。本发明的另一方面提供一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，通过:(a)提供突变细胞，该突变细胞在细胞的cre-Ι基因中含有失活性突变；以及(b)将该突变细胞与糖类接触，该糖类诱导该突变细胞分泌蛋白质。在某些实施例中，该突变细胞在两种或更多种葡萄糖苷酶基因中进一步含有失活性突变。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精 ，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类为纤维二糖。
[0013]在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，分泌蛋白为纤维素诱导蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白选自:纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白为纤维素酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白由选自以下的基因编码:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该突变细胞在至少一种β -甘露糖苷酶基因中进一步含有失活性突变。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该突变细胞在至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中进一步含有失活性突变。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该失活性突变为缺失。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为重组细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为真菌或酵母细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为真菌或酵母细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞选自粗糙脉孢菌(Neurospora crassa, N.crassa)细胞、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)细胞、里氏木霉(Trichoderma reesei )细胞、黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)细胞、嗜热侧抱霉(Sporotrichum thermophile)(嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila))细胞、玉米赤霉(Gibberella zeae)细胞、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)细胞、灰葡萄抱霉(Botryotinia fuckeliana)细胞、黑曲霉(Aspergillus niger)细胞、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)细胞、裂裙菌(Schizophyllum commune)细胞、褐腐菌(Postia placenta)细胞、米曲霉(Aspergillusoryzae)细胞和解纤维顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种葡萄糖苷酶基因为三种或更多种葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种葡萄糖苷酶基因为四种或更多种葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种葡萄糖苷酶基因为五种或更多种葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种葡萄糖苷酶基因为六种或更多种葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种葡萄糖苷酶基因为七种或更多种葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该三种或更多种葡萄糖苷酶基因、四种或更多种葡萄糖苷酶基因、五种或更多种葡萄糖苷酶基因、六种或更多种葡萄糖苷酶基因，或七种或更多种葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和NCU08755。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，至少一种葡萄糖苷酶基因编码胞内葡萄糖苷酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种葡萄糖苷酶基因编码胞外葡萄糖苷酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种甘露糖苷酶基因为NCU00890。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因为NCU06650。
[0014]本发明的另一个方面提供一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，通过:(a)提供重组细胞，与相应非重组细胞中至少两种葡萄糖苷酶基因的表达相比，该重组细胞显示了该至少两种葡萄糖苷酶基因的表达下降；以及(b)将该重组细胞与纤维素类生物质接触，该纤维素类生物质诱导该重组细胞分泌蛋白质。在某些实施例中，与相应非重组细胞中cre-Ι基因的表达相比，该重组细胞进一步显示了 cre-Ι基因的表达下降。本发明的另一方面提供一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，通过:(a)提供重组细胞，与相应非重组细胞中cre-Ι基 因的表达相比，该重组细胞显示了 cre-Ι基因的表达下降；以及(b)将该重组细胞与纤维素类生物质接触，该纤维素类生物质诱导该重组细胞分泌蛋白质。在某些实施例中，与相应非重组细胞中至少两种葡萄糖苷酶基因的表达相比，该重组细胞进一步显示了该至少两种葡萄糖苷酶基因的表达下降。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括纤维二糖。
[0015]本发明的另一个方面提供一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，通过:(a)提供重组细胞，与相应非重组细胞中至少两种葡萄糖苷酶基因的表达相比，该重组细胞显示了该至少两种葡萄糖苷酶基因的表达下降；以及(b)将该重组细胞与糖类接触，该糖类诱导该重组细胞分泌蛋白 质。在某些实施例中，与相应非重组细胞中cre-Ι基因的表达相比，该重组细胞进一步显示了 cre-Ι基因的表达下降。本发明的另一方面提供一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，通过:(a)提供重组细胞，与相应非重组细胞中cre-Ι基因的表达相比，该重组细胞显示了 cre-Ι基因的表达下降；以及(b)将该重组细胞与糖类接触，该糖类诱导该重组细胞分泌蛋白质。在某些实施例中，与相应非重组细胞中至少两种葡萄糖苷酶基因的表达相比，该重组细胞进一步显示了该至少两种葡萄糖苷酶基因的表达下降。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类为纤维二糖。
[0016]在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，分泌蛋白为纤维素诱导蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白选自:纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白为纤维素酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白由选自以下的基因编码:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，creA/cre-Ι的功能通过使显性失活突变(dominantnegative mutant)或蛋白抑制剂过表达降低。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，与相应非重组细胞中至少一种甘露糖苷酶基因的表达相比，该重组细胞进一步显示了该至少一种β_甘露糖苷酶基因的表达下降。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，与相应非重组细胞中磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达相比，该重组细胞进一步显示了该磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达下降。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉默降低基因表达。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种葡萄糖苷酶基因为三种或更多种葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种葡萄糖苷酶基因为四种或更多种葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种葡萄糖苷酶基因为五种或更多种葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种葡萄糖苷酶基因为六种或更多种葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种葡萄糖苷酶基因为七种或更多种葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该三种或更多种葡萄糖苷酶基因、四种或更多种葡萄糖苷酶基因、五种或更多种葡萄糖苷酶基因、六种或更多种葡萄糖苷酶基因，或七种或更多种葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和NCU08755。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，至少一种葡萄糖苷酶基因编码胞内葡萄糖苷酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种葡萄糖苷酶基因编码胞外葡萄糖苷酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种甘露糖苷酶基因为NCU00890。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因为NCU06650。在可以与之前的实施例结合的某 些实施例中，该细胞为稳定细胞系或瞬时转染的细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为真菌或酵母细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为子囊菌和担子菌物种的丝状真菌。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞选自粗糙脉孢菌(Neurospora crassa, N.crassa)细胞、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)细胞、里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞、黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)细胞、嗜热侧抱霉(Sporotrichum thermophile)(嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila))细胞、玉米赤霉(Gibberella zeae)细胞、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)细胞、灰葡萄抱霉(Botryotinia fuckeliana)细胞、黑曲霉(Aspergillus niger)细胞、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)细胞、裂裙菌(Schizophyllum commune)细胞、褐腐菌(Postia placenta)细胞、米曲霉(Aspergillusoryzae)细胞和解纤维顶抱霉(Acremonium cellulolyticus)细胞。
[0017]本发明的另一个方面提供在两种或更多种葡萄糖苷酶基因中含有失活性突变的突变细胞，其中比起在两种或更多种β -葡萄糖苷酶基因中缺乏所述突变的相应细胞，纤维素类生物质诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在一些实施例中，该突变细胞在细胞cre-Ι基因中进一步含有失活性突变，其中比起在cre-Ι基因中缺乏所述突变的相应细胞，纤维素类生物质诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该突变细胞在至少一种甘露糖苷酶基因中进一步含有失活性突变，其中比起在至少一种β -甘露糖苷酶基因中缺乏所述突变的相应细胞，纤维素类生物质诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该突变细胞在至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中进一步含有失活性突变，其中比起在至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中缺乏所述突变的相应细胞，纤维素类生物质诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括纤维二糖。
[0018]本发明的另一个方面提供在两种或更多种葡萄糖苷酶基因中含有失活性突变的突变细胞，其中比起在两种或更多种β -葡萄糖苷酶基因中缺乏所述突变的相应细胞，糖类诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在一些实施例中，该突变细胞在细胞cre-Ι基因中进一步含有失活性突变，其中比起在cre-Ι基因中缺乏所述突变的相应细胞，糖类诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。 在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该突变细胞在至少一种β_甘露糖苷酶基因中进一步含有失活性突变，其中比起在至少一种β_甘露糖苷酶基因中缺乏所述突变的相应细胞，糖类诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该突变细胞在至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中进一步含有失活性突变，其中比起在至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中缺乏所述突变的相应细胞，糖类诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类为纤维二糖。
[0019]在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，分泌蛋白为纤维素诱导蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白选自:纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶 、多糖裂解酶，和含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白为纤维素酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白由选自以下的基因编码:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该失活性突变为缺失。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为重组细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为真菌或酵母细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为子囊菌和担子菌物种的丝状真菌。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞选自粗糙脉孢菌(Neurospora crassa, N.crassa)细胞、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)细胞、里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞、黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)细胞、嗜热侧抱霉(Sporotrichum thermophile)(嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila))细胞、玉米赤霉(Gibberella zeae)细胞、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)细胞、灰葡萄孢霉(Botryotinia fuckeliana)细胞、黑曲霉(Aspergillus niger)细胞、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)细胞、裂裙菌(Schizophyllum commune)细胞、褐腐菌(Postia placenta)细胞、米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞和解纤维顶抱霉(Acremoniumcellulolyticus)细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为三种或更多种葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种葡萄糖苷酶基因为四种或更多种葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种葡萄糖苷酶基因为五种或更多种葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种葡萄糖苷酶基因为六种或更多种葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种葡萄糖苷酶基因为七种或更多种葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该三种或更多种β_葡萄糖苷酶基因、四种或更多种葡萄糖苷酶基因、五种或更多种葡萄糖苷酶基因、六种或更多种葡萄糖苷酶基因，或七种或更多种β-葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和NCU08755。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，至少一种葡萄糖苷酶基因编码胞内葡萄糖苷酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种葡萄糖苷酶基因编码胞外葡萄糖苷酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种β-甘露糖苷酶基因为NCU00890。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因为NCU06650。
[0020]本发明的另一个方面提供重组细胞，与相应非重组细胞中至少两种葡萄糖苷酶基因的表达相比，该重组细胞显示了该至少两种葡萄糖苷酶基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉默降低该表达，并且其中比起至少两种β -葡萄糖苷酶基因表达不下降的相应非重组细胞，纤维素类生物质诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在某些实施例中，与相应非重组细胞中cre-Ι基因的表达相比，该细胞进一步显示了cre-Ι基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉默降低该表达，并且其中比起cre-Ι基因表达不下降的相应非重组细胞，纤维素类生物质诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在某些实施例中，creA/cre-Ι的功能通过显性失活突变或蛋白抑制剂的过表达而降低，其中比起显性失活突变没有过表达的相应细胞，纤维素类生物质诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，与相应非重组细胞中至少一种甘露糖苷酶基因的表达相比，该细胞显示了该至少一种甘露糖苷酶基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉默降低该表达，并且其中比起至少一种β -甘露糖苷酶基因表达不下降的相应非重组细胞，纤维素类生物质诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，与相应非重组细胞中至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达相比，该细胞进一步显示了至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉默降低该表达，并且其中比起该至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达不下降的非重组细胞，纤维素类生物质诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括纤维二糖。[0021]本发明的另一个方面提供重组细胞，与相应非重组细胞中至少两种葡萄糖苷酶基因的表达相比，该重组细胞显示了该至少两种葡萄糖苷酶基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉默降低该表达，并且其中比起至少两种β -葡萄糖苷酶基因表达不下降的相应非重组细胞，糖类诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在某些实施例中，与相应非重组细胞中cre-Ι基因的表达相比，该细胞显示了 cre-Ι基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉默降低该表达，并且其中比起cre-Ι基因表达不下降的相应非重组细胞，糖类诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在某些实施例中，creA/cre-Ι的功能通过使显性失活突变或蛋白抑制剂过表达降低，其中比起显性失活突变没有过表达的相应细胞，糖类诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，与相应非重组细胞中至少一种甘露糖苷酶基因的表达相比，该细胞显示了该至少一种β_甘露糖苷酶基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉默降低该表达，并且其中比起至少一种β -甘露糖苷酶基因表达不下降的相应非重组细胞，糖类诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，与相应非重组细胞中至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达相比，该细胞进一步显示了至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉默降低该表达，并且其中比起该至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达不下降的非重组细胞，糖类诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类为纤维二糖。
[0022]在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，分泌蛋白为纤维素诱导蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白选自:纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白为纤维素酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白由选自以下的基因编码:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β -葡萄糖苷酶基因为三种或更多种葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为四种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为五种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为六种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为七种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该三种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、四种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、五种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、六种或更多种β-葡萄糖苷酶基因，或七种或更多种β-葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和NCU08755。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，至少一种葡萄糖苷酶基因编码胞内葡萄糖苷酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，至少一种葡萄糖苷酶基因编码胞外β_葡萄糖苷酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种β_甘露糖苷酶基因为NCU00890。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因为NCU06650。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为稳定细胞系或瞬时转染的细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为真菌或酵母细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为子囊菌和担子菌物种的丝状真菌。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞选自粗糙脉孢菌(Neurospora crassa, N.crassa)细胞、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)细胞、里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞、黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)细胞、嗜热侧抱霉(Sporotrichum thermophile)(嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila))细胞、玉米赤霉(Gibberella zeae)细胞、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)细胞、灰葡萄孢霉(Botryotinia fuckeliana)细胞、黑曲霉(Aspergillus niger)细胞、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)细胞、裂裙菌(Schizophyllum commune)细胞、褐腐菌(Postia placenta)细胞、米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞和解纤维顶抱霉(Acremoniumcellulolyticus)细胞。
[0023]本发明的另一 方面涉及一种降解生物质的方法，通过:(a)提供木质纤维素类生物质；(b)提供之前的任何实施例中的细胞，或在cre-Ι基因中含有失活性突变的细胞；(c)通过用纤维素类生物质接触该细胞诱导该细胞分泌蛋白；以及(d)用木质纤维素类生物质接触诱导的细胞，其中分泌的蛋白降解木质纤维素类生物质。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括纤维二糖。本发明的另一方面涉及一种降解生物质的方法，通过:(a)提供木质纤维素类生物质；(b)提供之前的任何实施例中的细胞，或在cre-Ι基因中含有失活性突变的细胞；(C)通过用糖类接触该细胞诱导该细胞分泌蛋白；以及(d)用木质纤维素类生物质接触诱导的细胞，其中分泌的蛋白降解木质纤维素类生物质。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类为纤维二糖。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，分泌蛋白为纤维素诱导蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白选自:纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白为纤维素酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白由选自以下的基因编码:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCUO7190, NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。
【专利附图】

【附图说明】
[0024]图1展示了粗糙脉胞菌的β-葡萄糖苷酶缺失菌株中纤维素酶的转录调节模型。需要转录去抑制和特异性诱导来实现纤维素酶基因表达的转录激活的最大化。箭头表明纤维素代谢物的可能途径。蓝线表示被认为是A3i3G和Λ3β GAcre缺失菌株中最弱化的途径；红线表示被认为是Λ 3 β G和Λ 3 β G Λ cre缺失菌株中最具活性的途径。
[0025]图2展示了粗糙脉孢菌中纤维素酶的基因表达时间进程。图2A展示了纤维二糖水解酶I (cbh-1，NCU07340)的时间进程。图2B展示了内切葡聚糖酶2 (gh5_l，NCU00762)的时间进程。当用2%蔗糖诱导时，所有基因的表达水平标准化至I。菌株在含有2%蔗糖的基本培养基中生长16小时，接着在含有2% Avkel 'S、的基本培养基中生长4小时。在所有样品以肌动蛋白(NCU04173)基因表达水平作为内源性对照。每个反应以一式三份进行并且误差条表不95%置彳目区间。
[0026]图3展示了在WT、Λ 3 β G和Λ 3 β G Λ ere中用0.2%纤维二糖或l%Aviee?诱导4小时后，选择的纤维素酶的基因表达。当用1%鹿糖诱导时，cbh-1、gh6_2,和gh5_l的基因表达水平标准化至I。在所有样品中以肌动蛋白作为内源性对照。每种菌株以一式三份生长并且误差条表不I标准偏差。
[0027]图4表不转移至含有2%鹿糖的基本培养基4小时后，Δ cre_l中纤维素酶纤维二糖水解酶I (cbh-1，NCU07340)和内切葡聚糖酶2 (gh5_l，NCU00762)的基因表达水平。对于用2%蔗糖诱导的野生型，两种 基因的表达水平标准化至I。肌动蛋白(NCU04173)基因表达水平作为内源性对照。每个反应以一式三份进行并且误差条表示95%置信区间。
[0028]图5展示了饥饿状态下，野生型(WT)、Δ cre-U Δ 4952 Δ 8755 Δ 130，和Δ 4952 Δ 8755 Δ 130 Acre-1中纤维素酶纤维二糖水解酶I (cbh_l, NCU07340)和内切葡聚糖酶2(gh5-l，NCU00762)的基因表达水平。当用2%蔗糖诱导时，所有基因的表达水平标准化至I。菌株在含有2%蔗糖的基本培养基中生长16小时，接着在没有添加碳源的基本培养基中生长4小时。在所有的样品中，肌动蛋白(NCU04173)基因表达水平作为内源性对照。每个反应以一式三份进行并且误差条表示95%置信区间。
[0029]图6表示用IOmM或ImM纤维二糖诱导4小时后，纤维素酶纤维二糖水解酶I(cbh-1，NCU07340)和内切葡聚糖酶2(gh5-l，NCU00762)的基因表达水平。图6A展示了野生型的结果。图6B展示了 Λ4952Λ8755Λ130缺失突变体的结果。图6C展示了Λ 4952 Λ 8755 Λ 130 Acre-1缺失突变体的结果。当用2%蔗糖诱导时，所有基因的表达水平标准化至I。菌株在含有2%蔗糖的基本培养基中生长16小时，接着在含有ImM纤维二糖、IOmM纤维二糖，或2%蔗糖的基本培养基中生长4小时。在所有的样品中，肌动蛋白(NCU04173)基因表达水平作为内 源性对照。每个反应以一式三份进行并且误差条表示95%置信区间。[0030]图7概述了用纤维二糖或Avio;_诱导后，WT、Λ3β6，和Λ 3 β G Λ ere菌株中的蛋白质的产量和酶活性。图7A展示了利用以纤维二糖诱导的Λ3β G的生物反应器中纤维素酶的产量。图7Β展示了利用以纤维二糖诱导的A3i3GAcre的生物反应器中纤维素酶的产量。图7C展示了利用以纤维二糖诱导的WT的生物反应器中纤维素酶的产量。图7D展示了利用在Avkdfe上生长5天的WT的生物反应器中纤维素酶的产量。在用0.2%纤维二糖诱导36小时前，纤维二糖诱导的菌株在含有1%蔗糖的基本培养基中预生长24小时。测量蔗糖、葡萄糖、果糖(按葡萄糖当量，三角形)、纤维二糖(圆)、蛋白质产量(正方形)，和生物质累积量(菱形)的浓度。图7E展示了来自7A、7B，和7D的24小时诱导的上清液对Avkd?酌活性。比较用纤维二糖诱导24小时的A3i3G(正方形)和Λ3β GAcre (三角形)的培养物上清液与在AviceW上生长5天的WT (菱形)的培养物上清液的纤维素酶活性。误差条为I标准偏差。图7F展示了来自7Α和7Β中生物反应器培养物上清液的Azo-CMC (内切葡聚糖酶)活性的时间进程。Azo-CMC活性表示为在2%Avkel?上生长5天的WT培养物上清液的活性的百分比。
[0031]图8 比较来自野生型(WT)、Acre-U Δ 4952 Δ 8755 Δ 130,和Δ 4952 Δ 8755 Δ 130 Δ cre-Ι的培养物滤液的MuLac活性(纤维二糖水解酶I)。图8A展示了以在AvkeWD上生长4天后的野生型在Avicel?上的活性的百分比表示的MuLac活性。图8B展示了以μ g纯化的重组Cbh-1当量表示的MuLac活性。菌株在2%鹿糖生长16小时，接着在2%蔗糖、2%纤维二糖，或2%Avied?中生长4天，并且取时间点2天和4天。用4_甲基伞形酮基-β -D-纤维二糖糖苷(4-MethylumbelIiferyl-β -D_cellobioside,MuLac)试验测量培养物上清液中外切葡聚糖酶活性。
[0032]图9 比较来自野生型(WT)、Acre-U Δ 4952 Δ 8755 Δ 130,和Δ 4952 Δ 8755 Δ 130 Acre-1的培养物滤液中的Αζο-CM-纤维素活性(内切_1，4_β-葡聚糖酶)。菌株在1%蔗糖生长24小时，接着在2%蔗糖、l%Avicel?,或2%纤维二糖中生长4天。以4天后野生型在Avice?上的活性的百分比表示内切-1，4- β -葡聚糖酶活性。注意，没有展示蔗糖培养物的数据，因为不能检测到4种菌株中的任何一种的Azo-CM-纤维素活性。
[0033]图10比较粗糙脉胞菌野生型(WT)和Acre-1菌株的表型。图1OA展示了来自在Avicd I’上生长7天的WT和Λ cre-1菌株的培养物滤液中的分泌蛋白的SDS-PAGE分析。标记代表葡萄糖苷酶(NCU04952)、纤维二糖水解酶l(cbh-l，NCU07340)和2(cbh-2，NCU09680)，以及内切葡聚糖酶2(gh5-l，NCU00762)的蛋白带。图1OB比较由来自WT和Acre-1菌株的7天培养物上清液的微晶纤维素酶(Avicelase)试验确定的内切葡聚糖酶在Azo-CMC、蛋白质浓度，以及葡萄糖和纤维二糖浓度上的活性。
[0034]图11 展示了 来自野生型(WT)、Acre-U Δ 4952 Δ 8755 Δ 130,和Δ 4952 Δ 8755 Δ 130 Δ cre-Ι缺失突变体的培养物滤液中的分泌蛋白的SDS-PAGE分析。菌株在1%蔗糖中生长24小时，接着在2%蔗糖、2%纤维二糖、1%蔗糖和1%纤维二糖，或1%鹿糖和丨%Avicci?中生长4天，在24小时时间点取出样品。在标准的10%Tris-HCl (CriterionlO%Tris-HCl)聚丙烯酰胺凝胶上跑15 μ I过滤后的培养物上清液并用Thermo ScientificGelCode蓝色染色试剂染色。注意:在鹿糖上的Δ cre_l和Δ 4952 Δ 8755 Δ 130 Δ cre-Ι的跑至72kDa的蛋白质已经用质谱分析法鉴定为NCU01517(葡糖淀粉酶I)。
[0035]图12展示了来自野生型粗糙脉胞菌和Λ 4952 Δ 8755 Δ130(β -G tKO)的培养物滤液中的分泌蛋白的SDS-PAGE分析。菌株在1%蔗糖中生长24小时，接着在2%蔗糖、2%纤维二糖，或2%Avice?中生长5天。标记代表纤维二糖水解酶I (cbh_l, NCU07340)、纤维二糖水解酶2(cbh-2，NCU09680)，和内切葡聚糖酶2(gh5-2，NCU00762)的蛋白带。此外，在野生型中标记葡萄糖苷酶(NCU04952)并且在三重缺失Λ 4952 Λ 8755 Λ 130中描述了不存在葡萄糖苷酶。
[0036]图13 展示了密切相关真菌中 NCU00130(SEQ ID NO:1)、NCU04952 (SEQ ID NO: 2),和NCU08755 (SEQID NO:3)直系同源物的ClustalW比对。提供粗糙脉胞菌基因的整条序列，并且直系同源物仅展示不同的氨基酸。”表示相同的残基，而表示插入或缺失。
[0037]图14展示了葡萄糖苷酶NCU00130直系同源物的进化关系。用邻接法(SaitouN.和Nei Μ., 1987)推断进化史。展示了树枝长度总和=1.56132503的最优树。该树按比例绘制，并且树枝长度的单位与用于推断系统树的进化距离的单位相同。用泊松校正法(Poisson correction method) (Zuckerkandl E.和Pauling L.，1965)计算进化距离，并且该进化距离以每个位点中氨基酸替换数为单位。分析涉及11条氨基酸序列。排除含有间隙和缺失数据的所有位置。最终的数据集中总共有447个位置。在MEGA5 (Tamura K., DudleyJ., Nei Μ.,和Kumar S.，2007)中进行进化分析。
[0038]图15展示了 β -葡萄糖苷酶NCU04952直系同源物的进化关系。展示了树枝长度总和=2.84018960的最优树。分析涉及11条氨基酸序列。最终的数据集中总共有690个位置。
[0039]图16展示了 β -葡萄糖苷酶NCU08755直系同源物的进化关系。展示了树枝长度总和=2.37353896的最优树。分析涉及11条氨基酸序列。最终的数据集中总共有709个位置。
[0040]图17展示了用纤维糊精诱导后，WT和Λ3β6中的纤维素酶诱导。图17Α展示了用AvicelfU纤维二糖、纤维三糖,或纤维四糖诱导4小时后，WT中cbh_l、gh5_l,和gh6_2的表达。图17B展示了用Avkd?、纤维二糖、纤维三糖，或纤维四糖诱导4小时后，A3i3G中cbh-l、gh5_l,和gh6_2的表达。当用1%鹿糖诱导时,cbh-l、gh5_l,和gh6_2的基因表达水平标准化至I。在所有的样品中，肌动蛋白(NCU04173)基因表达水平作为内源性对照。误差条表不I标准偏差。
[0041]图18展示了用纤维二糖或Avicd?诱导后，WT和β -葡萄糖苷酶缺失菌株中纤维素酶的表达水平。图18Α展示了来自WT、A30G，和Λ3β GAcre菌株的培养物滤液中分泌蛋白的SDS-PAGE分析。标记代表CBH-1、GH6-2，和GH5-1的蛋白带。此外，在三重敲除中标记不存在胞外β -葡萄糖苷酶(NCU04952)。葡糖淀粉酶I (NCU01517)的存在与cre_l基因的缺失相关。培养物在1%蔗糖中生长24小时，接着添加2%蔗糖或0.2%纤维二糖。在24小时(WT、Δ3β6^ΠΔ3β6Δ ere)或72小时(Δ 3 β G)后，收集上清液。WT的Α—咅养物在2%Aviee:lia上生长5天，Λ 3 β G在1%蔗糖中生长24小时，接着在l%Avied?中生长48小时，而A3i3GAcre在1%蔗糖中生长24小时，接着在-%AVfcC?中生长24小时。图18B展示了来自18A的上清液对AVKdS_的活性。在50°C用l%Avte?诱导24小时后，测量葡萄糖(深灰色)和纤维二糖(浅灰色)。误差条表示I标准偏差。
[0042]图19展示了用槐糖、乳糖或D_(+)_半乳糖诱导后，WT和A3i3G中的纤维素酶诱导。图19A展示了用ImM槐糖、ImM乳糖，或ImM D_(+)_半乳糖诱导4小时后，WT和Λ3β6中cbh-1的表达。图19B展示了用ImM槐糖、ImM乳糖，或ImM D-(+)-半乳糖诱导4小时后，WT和A3i3G中gh6-2的表达。当用1%蔗糖诱导时，cbh_l和gh6_2的基因表达水平标准化至I。在所有的样品中，肌动蛋白(NCU04173)基因表达水平作为内源性对照。误差条表不I标准偏差。
[0043]图20展示了 WT和Λ 3 β G菌株的RNA测序。图20Α展示了与用纤维二糖诱导相t匕，在WT粗糙脉胞菌中用Avicd?有差别地诱导的318种基因的分层聚类分析。浅色表示更高的相关表达，而深色表示更低的相关表达。图20B展示了与用纤维二糖诱导的A3i3G相t匕，用纤维二糖或Avteel翁诱导的WT以FPKM (每百万片段映射的每千个碱基的外显子的片段)表示的纤维素酶表达。所有的菌株在2%蔗糖上生长16小时，接着转移至无碳源(仅有Vogels盐溶液)、0.2%纤维二糖或l%Av'kd&中培养4小时。
[0044]图21展示了用纤维二糖或Avicel?诱导后，WT、Λ 3 β G，和Λ 3 β G Λ ere菌株的酶活性。图21A展示了 24小时诱导的上清液对Avkd?的活性。比较来自用纤维二糖诱导24小时的Λ3β6(正方形)和Λ3β GAcre (菱形)的培养物上清液与来自在Avicd#上生长5天的WT (三角形)培养物上清液的纤维素酶活性。图21B展示了在Avkxl?水解试验(来自于21A)中，36小时后，纤维二糖(浅灰色)和葡萄糖(深灰色)的分解。误差条表示I标准偏差。
[0045]图22总结了在野生型(Aviee?)、Λ 3 β G (纤维二糖)，和Λ 3 β G Λ ere (纤维二糖)粗糙脉胞菌菌株中通过质谱分析鉴定的蛋白质。
[0046]图23比较来自粗糙脉胞菌菌株Λ3β6、Δ3β GAcre, Δ3β6Δ890,Δ 3 β GA 6650, Δ 3 β G Δ 6650 Δ 890, Δ 3 β G Δ ere Δ 6650, Δ 3 β G Δ ere Δ 890,和Δ3β GAcreA 6650 Δ 890的培养物滤液中MuLac活性(纤维素酶活性)。带有Λ 890的菌株缺失β-甘露糖苷酶基因NCU00890。带有Λ 6650的菌株缺失磷脂酶基因或磷脂酶类基因NCU06650。菌株在2%蔗糖中生长36小时，接着在0.2%纤维二糖中生长24小时。用4-甲基伞形酮基_β-D-纤维二糖糖苷(MuLac)试验测量培养物上清液中外切葡聚糖酶活性。在菌株之间，以相对荧光显示结果。
具体实施例
[0047]鍵
[0048]本发明涉及突变细胞和重组细胞 ，该突变细胞和重组细胞显示了蛋白，比如纤维素酶，的分泌增加，以响应纤维素类生物质或糖类的诱导；并且涉及利用这种细胞以增加蛋白分泌的方法。该分泌蛋白可以用于降解木质纤维素类生物质。在此公布的本发明的突变细胞在至少一种基因，比如葡萄糖苷酶基因、cre-Ι基因、β-甘露糖苷酶基因，或者磷脂酶或磷脂酶类基因，中含有失活性突变。如在此公布，与相应非重组细胞中至少一种基因的表达相比，本发明的重组细胞显示至少一种基因，比如β -葡萄糖苷酶基因、cre-Ι基因、β -甘露糖苷酶基因，或者磷脂酶或磷脂酶类基因，的表达下降。
[0049]蛋白分泌诱导物
[0050]从含有多糖及多糖成分的生物，如植物，藻类，真菌，细菌，和细菌生物膜，大量获得纤维素类生物质。纤维素是纤维素类生物质中的主要多糖。纤维素是脱水纤维二糖(anhydrocel1biose)(线性β _(1_4)-D-葡聚糖)的均聚物,并包括以β _糖苷键连接在一起的葡萄糖单位。虽然一般是多形的，但植物组织中的纤维素主要为平行葡聚糖链的不溶性的结晶基质。纤维素类生物质可以为未加工的生物质、预处理的生物质，或加工的生物质。纤维素类生物质也可以包括一种或更多种糖类。
[0051]本发明的合适的纤维素类生物质可以包括，但不限于，糖类、多糖、低聚糖、纯化的纤维素，和纤维素衍生物。纯化的纤维素包括全纤维素,如Solka Flok，和微晶纤维素，比如AYicdD和纤维素衍生物包括，但不限于，纤维糊精、β -甲基伞形酮基-低聚糖(β -methylumbelliferyl-oligosaccharides)、对硝基苯酌.低聚糖(p-nitrophenol-oligosaccharides)、长链的纤维素衍生物、羧甲基纤维素(CMC)，和羟乙基纤维素(HEC)。
[0052]在此使用的“纤维糊精”指的是不同长度的β (I — 4)葡萄糖聚合物，包括，但不限于，纤维二糖(2个葡萄糖单体)、纤维三糖(3个葡萄糖单体)、纤维四糖(4个葡萄糖单体)、纤维五糖(5个葡萄糖单体)，和纤维六糖(6个葡萄糖单体)。有利的是，短链纤维糊精，如纤维二糖，是可溶的。此外，本发明的分泌蛋白不附着短链纤维糊精，如纤维二糖。
[0053]在某些方面，本发明的纤维素类生物质可以为未加工的生物质材料，该生物质材料可以通过本发明的细胞降解。降解的生物质可以包括，但不限于，多糖，如纤维素和微晶纤维素；或低聚糖，如纤维糊精和纤维二糖。在其它方面，本发明的纤维素类生物质可以包括纯化的多糖，如纤维素和微晶纤维素；或低聚糖，如纤维糊精和纤维二糖。在另外的其它方面，本发明的生物质可以包 括多糖的混合物，如纤维素和微晶纤维素；和低聚糖，如纤维糊精和纤维二糖。
[0054]在某些方面，本发明的纤维素类生物质直接加入到本发明的突变细胞或重组细胞中以诱导蛋白分泌。
[0055]在其它方面，通过一种或更多种纤维素衍生物，比如纤维糊精或纤维二糖从本发明的突变细胞或重组细胞诱导蛋白分泌，其中该纤维素衍生物通过细胞降解纤维素类生物质在原位产生。在某些方面，纤维素类生物质的数量足以产生诱导细胞分泌的纤维素衍生物，但该纤维素衍生物不附着，或相反，隔离从细胞分泌的一类或更多类蛋白。
[0056]此外，糖类可以用于诱导本发明的突变细胞或重组细胞分泌蛋白。合适的糖类包括，但不限于，多糖、低聚糖、槐糖、纤维素、微晶纤维素、纤维糊精、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖，和纤维六糖。
[0057]分泌蛋白
[0058]在某些方面，本发明的突变细胞和重组细胞显示了至少一类、至少两类、至少三类、至少四类、至少五类，或更多类蛋白分泌增加，以响应纤维素类生物质或糖类的诱导。
[0059]在此使用的，增加分泌指的是提高本发明的蛋白的分泌水平。分泌涉及从细胞内到细胞外的蛋白运动。分泌水平提高可以 是感兴趣的蛋白的表达或产量增加的结果。可选地，分泌水平提高可以是感兴趣的蛋白来自细胞的转运增加的结果。本发明的方法还可以通过改变参与蛋白产生和分泌，导致该蛋白的总分泌水平提高的途径提高蛋白的分泌水平。
[0060]本发明的可以分泌的蛋白质的类型，包括，但不限于，内源蛋白和外源蛋白。本发明的内源蛋白为本发明的细胞的内源的，或由本发明的细胞自然产生的蛋白。本发明的外源蛋白是不在本发明的细胞中自然表达的蛋白。外源蛋白可以通过本领域已知的任何方法在细胞中的重组表达。通常，编码外源蛋白质的重组核酸可操作地连接到调控序列，如启动子。可以使用本领域已知的任何合适的调控序列。合适的启动子包括，但不限于，组成型启动子或诱导型启动子。此外，外源蛋白可以含有直接从细胞分泌的分泌型肽。可以使用本领域已知的适用于本发明的方法的任何分泌型肽。
[0061]在某些方面，分泌蛋白为纤维素诱导蛋白。在此使用的“纤维素诱导蛋白”指的是在野生型细胞(例如，非突变或非重组细胞)中通过纤维素诱导表达和分泌的蛋白。例如，2011 年，C.M.Phillips 等人(Phillips, CM et al., ProteomeRes.201IS印2; 10(9):4177-85.Epub2011Augl)描述的纤维素诱导蛋白。
[0062]本发明的纤维素诱导的分泌蛋白包括，但不限于:纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纤维素结合结构域的蛋白质。
[0063]在此使用的，“纤维素酶”或“纤维素酶多肽”指的是具有催化纤维素、地衣多糖，和谷物β -D-葡聚糖水解的酶活性的多肽。例如，纤维素酶可以水解纤维素中的1，4-β -D-糖苷键。本发明的纤维素酶包括，但不限于，内切纤维素酶，内切葡聚糖酶、内切_1，4-β-葡聚糖酶、内切-1，4_i3-D-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶((CMCase)、β_1，4_葡聚糖酶、β -1, 4-内切葡聚糖水解酶(β -1, 4-endoglucan hydrolase),和纤维糊精酶；外切纤维素酶如外切葡聚糖酶，纤维二糖酶、纤维二糖水解酶、氧化的纤维素酶比如纤维二糖脱氢酶；和纤维素磷酸化酶。 [0064]在此使用的，“GH61酶”指的是糖苷水解酶家族61的酶。本发明的GH61酶能够提高纤维素酶的活性。GH61酶的例子包括，但不限于，多糖单加氧酶。在某些方面，本发明的GH61酶由GH61-1基因、GH61-2基因、GH61-5基因、NCU07898基因、NCU08760基因、其同源物，及其直系同源物编码。
[0065]纤维二糖脱氢酶是具有氧化还原酶活性的酶，并包括具有ECl.1.99.18活性的酶。在某些方面，本发明的纤维二糖脱氢酶由NCU00206、cdh-l基因、其同源物，及其直系同源物编码。
[0066]内酯酶为可以水解酰化的高丝氨酸内酯的高丝氨酸内酯环的酯键的酶。在某些方面，本发明的内酯酶由NCU07143、lac-2基因、其同源物，及其直系同源物编码。
[0067]碳水化合物酯酶为具有EC3.1.1和EC3.1.2活性的酶。碳水化合物酯酶的例子包括，但不限于，乙酰木聚糖酶，肉桂酰酯酶(cinnamoyl esterase),阿魏酸酯酶,羧酸酯酶，和S-甲酰谷胱甘肽水解酶(S-formylglutathione hydrolase)。在某些方面,本发明的碳水化合物酯酶由NCU09491、NCU09664、其同源物，及其直系同源物编码。
[0068]多糖裂解酶为具有EC4.2.2活性的酶。在某些方面，本发明的多糖裂解酶由NCU05598、其同源物，及其直系同源物编码。
[0069]在此使用的的“含有纤维素结合结构域的蛋白”指的是含有纤维素结合结构域的蛋白纤维素结合结构域是在有纤维素活性的酶，如糖苷水解酶中发现的蛋白质结构域。一般地，纤维素结合结构域具有碳水化合物结合活性。在某些方面，本发明的含有纤维素结合结构域的蛋白由NCU09764、其同源物，及其直系同源物编码。
[0070]在某些方面，本发明的分泌的纤维素诱导蛋白是由NCU05137、其同源物，及其直系同源物编码的蛋白。
[0071]突夺细朐
[0072]本发明的一个方面涉及突变细胞，该突变细胞显示了蛋白质分泌增加以响应纤维素类生物质或糖类；并涉及用这种细胞增加来自该细胞的蛋白的分泌和涉及降解木质纤维素类生物质的方法。在此使用的，本发明的突变细胞在至少一个基因中包含失活性突变。合适的失活性突变的例子包括，但不限于，引起抑制该基因编码的蛋白功能的缺失、点突变、功能丧失型突变、截断、重复、扩增、易位，和/或倒位。在感兴趣的基因中产生一个或更多个失活性突变的方法在本领域中是众所周知的，包括，但不限于，PCR诱变、插入诱变、化学诱变，和辐射。[0073]在本发明的一个方面，该突变细胞为真菌或酵母细胞。在本发明的另一发明，该突变细胞可以为子囊菌担子菌真菌细胞，粗糙脉孢菌(Neurospora crassa, N.crassa)细胞、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)细胞、里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞、黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)细胞、嗜热侧抱霉(Sporotrichum thermophile)(嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila))细胞、玉米赤霉(Gibberella zeae)细胞、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)细胞、灰葡萄抱霉(Botryotinia fuckeliana)细胞、黑曲霉(Aspergillus niger)细胞、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)细胞、裂裙菌(Schizophyllum commune)细胞、褐腐菌(Postia placenta)细胞、米曲霉(Aspergillusoryzae)细胞,或解纤维顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)细胞。优选地，该突变细胞为突变的粗糙脉孢菌细胞。在本发明的另一个方面，该突变细胞为重组细胞的。优选地，突变，重组细胞为粗糙脉孢菌突变、重组细胞。
[0074]β-葡萄糖苷酶突变细胞
[0075]β -葡萄糖苷酶基因编码β -葡萄糖苷酶。在此使用的“ β -葡萄糖苷酶”指的是催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基水解并释放葡萄糖的β-D-糖苷葡糖水解酶。β-葡萄糖苷酶是高度保守的酶。
[0076]在一个方面，本发明的突变细胞在至少两种葡萄糖苷酶基因中包含失活性突变，这导致由该至少两个基因编码的葡萄糖苷酶的功能丧失。该至少两种葡萄糖苷酶基因的失活性突变包括，但不限于，缺失突变、点突变、无义突变、截断，和插入。失活性突变可以完全消除葡萄糖苷酶的活性或抑制葡萄糖苷酶至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或更多的活性。失活性突变可以影响突变基因的表达水平或影响由该突变基因编码的蛋白质或RNA的功能活性。失活性突变也可以是顺式或反式作用。失活性突变可以通过随机突变，包括辐射或暴露于化学诱变剂，而引入，或者失活性突变能以有针对性的方式，包括含有失活性突变的菌株同源重组和杂交，而引入。
[0077]含有失活性突变的本发明的葡萄糖苷酶可以为胞内葡萄糖苷酶或胞外(即，分泌型)β-葡萄糖苷酶。合适的含有失活性突变的葡萄糖苷酶的例子包括，但不限于，粗糙脉孢菌基因NCU00130、NCU04952、NCU08755、其同源物，及其直系同源物编码的那些葡萄糖苷酶。NCU00130直系同源物、NCU04952直系同源物，和NCU08755直系同源物的例子包括，但不限于，图13-16列举的那些。
[0078]在本发明的一个具体方面，相比缺乏失活的β -葡萄糖苷酶突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导突变细胞转录水平高10、50、100、500、1，000,5, 000,10, 000、50，000，或100，000倍的至少一类蛋白。
[0079]在本发明的一个具体方面，相比缺乏失活的葡萄糖苷酶突变的细胞，纤维素类生物质或糖类在两天诱导后可以诱导突变细胞分泌水平高1.2,1.4,1.6,1.8、2、4、6、8、10、50、100、500、1，000,5, 000，或 10，000 倍的至少一类蛋白。
[0080]在本发明的另一具体方面，相比缺乏失活的β_葡萄糖苷酶突变的细胞，纤维素类生物质或糖类在两天诱导后可以诱导突变细胞分泌水平高1.2,1.4,1.6,1.8、2、3、4、5、6、7、8、9，或10倍的总蛋白。
[0081]在本发明的另一具体方面，相比缺乏失活的葡萄糖苷酶突变的细胞，用至少InM、至少 5nM、至少 IOnM, 15nM、至少 20nM、至少 25nM、30nM、至少 35nM、至少 40nM、45nM、至少 50nM、至少 55nM、60nM、至少 65nM、至少 70nM、至少 75nM、80nM、至少 85nM、90nM、至少 95nM、至少 ΙΟΟηΜ、至少 125nM、150nM、至少 175nM、200nM、至少 225nM、至少 250nM、至少275nM、300nM、至少 325nM、350nM、至少 375nM、至少 400nM、至少 425nM、至少 450nM、至少475nM、500nM、至少 525nM、至少 550nM、至少 575nM、600nM、至少 625nM、650nM、至少 675nM、至少 700nM、至少 725nM、至少 750nM、至少 775nM、800nM、至少 825nM、至少 850nM、至少 875nM、900nM、至少 925nM、950nM、至少 975nM、至少 1“1\1、至少24]\1、至少34]\1、至少44]\1、至少54厘、至少641、至少741、至少841、至少9411、至少10 μ M、至少15μΜ、至少20μΜ、至少25 μ Μ、至少30 μ Μ、至少35 μ Μ、至少40 μ Μ、至少45 μ Μ、至少50 μ Μ、至少55 μ Μ、至少60 μ Μ、至少65 μ Μ、至少70 μ Μ、至少75 μ Μ、至少80 μ Μ、至少85 μ Μ、至少90 μ Μ、至少95 μ Μ、至少 100 μ Μ、至少 125 μ Μ、至少 150 μ Μ、至少 175 μ Μ、至少 200 μ Μ、至少 225 μ Μ、至少 250 μ Μ、至少 275 μ Μ、至少 300 μ Μ、至少 325 μ Μ、至少 350 μ Μ、至少 375 μ Μ、至少 400 μ Μ、至少425 μ Μ、至少450 μ Μ、至少475 μ Μ、至少500 μ Μ、至少525 μ Μ、至少550 μ Μ、至少575 μ Μ、至少 600 μ Μ、至少 625 μ Μ、至少 650 μ Μ、至少 675 μ Μ、至少 700 μ Μ、至少 725 μ Μ、至少 750 μ Μ、至少 775 μ Μ、至少 800 μ Μ、至少 825 μ Μ、至少 850 μ Μ、至少 875 μ Μ、至少 900 μ Μ、至少925 μ Μ、至少950 μ Μ、至少975 μ Μ、至少ImM、至少2mM、至少3mM、至少4mM、至少5mM、至少6mM、至少7mM、至少8mM、至少9mM、至少10mM、至少I ImM、至少12mM、至少13mM、至少14mM、至少15mM、至少16mM、至少17mM、至少18mM、至少19mM、至少20mM,或更多纤维素类生物质或糖类诱导后，突变细胞可以转录水平高10、50、100、500、1，000,5, 000,10, 000,50, 000，或100，000倍的至少一类蛋白。
[0082]在本发明的另一具体方面，相比缺乏失活的葡萄糖苷酶突变的细胞，用至少InM、至少 5nM、至少 ΙΟηΜ、15nM、至少 20nM、至少 25nM、30nM、至少 35nM、至少 40nM、45nM、至少 50nM、至少 55nM、60nM、至少 65nM、至少 70nM、至少 75nM、80nM、至少 85nM、90nM、至少 95nM、至少 ΙΟΟηΜ、至少 125nM、150nM、至少 175nM、200nM、至少 225nM、至少 250nM、至少275nM、300nM、至少 325nM、350nM、至少 375nM、至少 400nM、至少 425nM、至少 450nM、至少475nM、500nM、至少 525nM、至少 550nM、至少 575nM、600nM、至少 625nM、650nM、至少 675nM、至少 700nM、至少 725nM、至少 750nM、至少 775nM、800nM、至少 825nM、至少 850nM、至少 875nM、900nM、至少 925nM、950nM、至少 975nM、至少 1“1\1、至少24]\1、至少34]\1、至少44]\1、至少54厘、至少641、至少741、至少841、至少9411、至少10 μ Μ、至少15μΜ、至少20μΜ、至少25 μ Μ、至少30 μ Μ、至少35 μ Μ、至少40 μ Μ、至少45 μ Μ、至少50 μ Μ、至少55 μ Μ、至少60 μ Μ、至少65 μ Μ、至少70 μ Μ、至少75 μ Μ、至少80 μ Μ、至少85 μ Μ、至少90 μ Μ、至少95 μ Μ、至少 100 μ Μ、至少 125 μ Μ、至少 150 μ Μ、至少 175 μ Μ、至少 200 μ Μ、至少 225 μ Μ、至少 250 μ Μ、至少 275 μ Μ、至少 300 μ Μ、至少 325 μ Μ、至少 350 μ Μ、至少 375 μ Μ、至少 400 μ Μ、至少425 μ Μ、至少450 μ Μ、至少475 μ Μ、至少500 μ Μ、至少525 μ Μ、至少550 μ Μ、至少575 μ Μ、至少 600 μ Μ、至少 625 μ Μ、至少 650 μ Μ、至少 675 μ Μ、至少 700 μ Μ、至少 725 μ Μ、至少 750 μ Μ、至少 775 μ Μ、至少 800 μ Μ、至少 825 μ Μ、至少 850 μ Μ、至少 875 μ Μ、至少 900 μ Μ、至少925 μ Μ、至少950 μ Μ、至少975 μ Μ、至少ImM、至少2mM、至少3mM、至少4mM、至少5mM、至少6mM、至少7mM、至少8mM、至少9mM、至少10mM、至少llmM、至少12mM、至少13mM、至少14mM、至少15mM、至少16mM、至少17mM、至少18mM、至少19mM、至少20mM,或更多纤维素类生物质或糖类诱导后，突变细胞可以分泌水平高2、4、8、16、32、64、128，或256倍的至少一类蛋白。
[0083]在本发明的另一具体方面，该至少两种葡萄糖苷酶为至少三种葡萄糖苷酶、至少四种葡萄糖苷酶、至少五种葡萄糖苷酶、至少六种葡萄糖苷酶、至少七种葡萄糖苷酶，或更多种葡萄糖苷酶。
[0084]在本发明的一个优选实施例中，在粗糙脉孢菌细胞中缺失葡萄糖苷酶基因NCU00130.NCU04952,以及 NCU08755。
[0085]在本发明的另一方面，包括降低至少两种β -葡萄糖苷酶活性的失活性突变的突变细胞在cre-Ι基因中进一步包括失活性突变，其中比起在cre-Ι基因中缺乏突变的细胞，纤维素类生物质或糖类诱导该细胞分泌更高水平的至少一种蛋白。失活性突变可以影响突变基因的表达水平或影响由该突变基因编码的蛋白质或RNA的功能活性。失活性突变可以是顺式或反式作用。失活性突变可以通过随机突变，包括辐射或暴露于化学诱变剂，而引入，或者失活性突变能以有针对性的方式，包括含有单一或多重失活性突变的菌株同源重组和杂交，而引入。
[0086]在本发明的一个具体方面，相比缺乏失活的creA/cre-Ι突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导该突变细胞转录水平高2、4、6、8、10、50、100、500、1，000、5，000、10，000,50, 000，或100，000倍的至少一类蛋白。
[0087]在本发明的一个具体方面，相比缺乏葡萄糖苷酶突变或cre-Ι突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导该突变细胞分泌水平高1.2,1.4,1.6,1.8、2、4、6、8、10、50、100,500,1, 000,5, 000，或 10，000 倍的至少一类蛋白。
[0088]在本发明的另一具体方面，相比缺乏葡萄糖苷酶突变或cre-Ι突变的细胞，纤维素类生物质或糖类在两天诱导后可以诱导该突变细胞分泌水平高1.2、1.4、1.6、1.8、2、3、4、5、6、7、8、9，或10倍的总蛋白。
[0089]在本发明的另一具体方面，相比缺乏葡萄糖苷酶突变或cre-Ι突变的细胞，用至少InM、至少5nM、至少10nM、15nM、至少20nM、至少25nM、30nM、至少35nM、至少40nM、45nM、至少 50nM、至少 55nM、60nM、至少 65nM、至少 70nM、至少 75nM、80nM、至少 85nM、90nM、至少 95nM、至少 ΙΟΟηΜ、至少 125ηΜ、150ηΜ、至少 175ηΜ、200ηΜ、至少 225ηΜ、至少 250ηΜ、至少 275ηΜ、300ηΜ、至少 325ηΜ、350ηΜ、至少 375ηΜ、至少 400ηΜ、至少 425ηΜ、至少 450ηΜ、至少475nM、500nM、至少 525nM、至少 550nM、至少 575nM、600nM、至少 625nM、650nM、至少 675nM、至少 700nM、至少 725nM、至少 750nM、至少 775nM、800nM、至少 825nM、至少 850nM、至少 875nM、900nM、至少 925nM、950nM、至少 975nM、至少 14]\1、至少24]\1、至少34]\1、至少44]\1、至少5口1、至少641、至少741、至少841、至少941、至少10 μ Μ、至少15μΜ、至少20μΜ、至少25 μ Μ、至少30 μ Μ、至少35 μ Μ、至少40 μ Μ、至少45 μ Μ、至少50 μ Μ、至少55 μ Μ、至少60 μ Μ、至少65μΜ、至少70μΜ、至少75μΜ、至少80 μ Μ、至少85 μ Μ、至少90 μ Μ、至少95 μ Μ、至少 100 μ Μ、至少 125 μ Μ、至少 150 μ Μ、至少 175 μ Μ、至少 200 μ Μ、至少 225 μ Μ、至少 250 μ Μ、至少 275 μ Μ、至少 300 μ Μ、至少 325 μ Μ、至少 350 μ Μ、至少 375 μ Μ、至少 400 μ Μ、至少425 μ Μ、至少450 μ Μ、至少475 μ Μ、至少500 μ Μ、至少525 μ Μ、至少550 μ Μ、至少575 μ Μ、至少 600 μ Μ、至少 625 μ Μ、至少 650 μ Μ、至少 675 μ Μ、至少 700 μ Μ、至少 725 μ Μ、至少 750 μ Μ、至少 775 μ Μ、至少 800 μ Μ、至少 825 μ Μ、至少 850 μ Μ、至少 875 μ Μ、至少 900 μ Μ、至少925 μ Μ、至少950 μ Μ、至少975 μ Μ、至少ImM、至少2mM、至少3mM、至少4mM、至少5mM、至少6mM、至少7mM、至少8mM、至少9mM、至少10mM、至少llmM、至少12mM、至少13mM、至少14mM、至少15mM、至少16mM、至少17mM、至少18mM、至少19mM、至少20mM，更多纤维素类生物质或糖类诱导后，突变细胞可以转录水平高10、50、100、500、1，000、5，000、10，000、50，000，或100，000倍的至少一类蛋白。
[0090]在本发明的另一具体方面，相比缺乏β_葡萄糖苷酶突变或cre-Ι突变的细胞，用至少InM、至少5nM、至少10nM、15nM、至少20nM、至少25nM、30nM、至少35nM、至少40nM、45nM、至少 50nM、至少 55nM、60nM、至少 65nM、至少 70nM、至少 75nM、80nM、至少 85nM、90nM、至少 95nM、至少 ΙΟΟηΜ、至少 125ηΜ、150ηΜ、至少 175ηΜ、200ηΜ、至少 225ηΜ、至少 250ηΜ、至少 275ηΜ、300ηΜ、至少 325ηΜ、350ηΜ、至少 375ηΜ、至少 400ηΜ、至少 425ηΜ、至少 450ηΜ、至少475ηΜ、500ηΜ、至少 525ηΜ、至少 550ηΜ、至少 575ηΜ、600ηΜ、至少 625ηΜ、650ηΜ、至少 675ηΜ、至少 700ηΜ、至少 725ηΜ、至少 750ηΜ、至少 775ηΜ、800ηΜ、至少 825ηΜ、至少 850ηΜ、至少 875ηΜ、900ηΜ、至少 925ηΜ、950ηΜ、至少 975ηΜ、至少 1“]\1、至少24]\1、至少34]\1、至少44]\1、至少5口1、至少641、至少741、至少841、至少941、至少10 μ Μ、至少15 μ Μ、至少20 μ Μ、至少25 μ Μ、至少30 μ Μ、至少35 μ Μ、至少40 μ Μ、至少45 μ Μ、至少50 μ Μ、至少55 μ Μ、至少60 μ Μ、至少65 μ Μ、至少70μΜ、至少75μΜ、至少80μΜ、至少85 μ Μ、至少90 μ Μ、至少95 μ Μ、至少 100 μ Μ、至少 125 μ Μ、至少 150 μ Μ、至少 175 μ Μ、至少 200 μ Μ、至少 225 μ Μ、至少 250 μ Μ、至少 275 μ Μ、至少 300 μ Μ、至少 325 μ Μ、至少 350 μ Μ、至少 375 μ Μ、至少 400 μ Μ、至少425 μ Μ、至少450 μ Μ、至少475 μ Μ、至少500 μ Μ、至少525 μ Μ、至少550 μ Μ、至少575 μ Μ、至少 600 μ Μ、至少 625 μ Μ、至少 650 μ Μ、至少 675 μ Μ、至少 700 μ Μ、至少 725 μ Μ、至少 750 μ Μ、至少 775 μ Μ、至少 800 μ Μ、至少 825 μ Μ、至少 850 μ Μ、至少 875 μ Μ、至少 900 μ Μ、至少925 μ Μ、至少950 μ Μ、至少975 μ Μ、至少ImM、至少2mM、至少3mM、至少4mM、至少5mM、至少6mM、至少7mM、至少8mM、至少9mM、至少10mM、至少llmM、至少12mM、至少13mM、至少14mM、至少15mM、至少16mM、至少17mM、至少18mM、至少19mM、至少20mM，或更多纤维素类生物质或糖类诱导后，突变细胞可以分泌水平高1.2、1.4、1.6、1.8、2、4、8、16、32、64、128，或256倍的至少一类蛋白。
[0091]在本发明的另一具体 方面，该至少两种β-葡萄糖苷酶为至少三种β-葡萄糖苷酶。[0092]在本发明的一个优选实施例中，在粗糙脉孢菌细胞中缺失β-葡萄糖苷酶基因NCU00130.NCU04952,以及 NCU08755，和 cre-Ι 基因。
[0093]CreA/cre~l 突变细胞
[0094]在一个方面，本发明的突变细胞在creA/cre-Ι基因中包含失活性突变，这导致由该基因编码的CreA/CRE-Ι功能丧失。creA/cre-Ι基因的失活性突变包括，但不限于，缺失突变、点突变、无义突变、截断，和插入。失活性突变可以完全消除CreA/CRE-Ι活性或抑制CreA/CRE-Ι至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或更多的活性。失活性突变可以影响突变基因的表达水平或影响由该突变基因编码的蛋白质或RNA的功能活性。失活性突变也可以是顺式或反式作用。失活性突变可以通过随机突变，包括辐射或暴露于化学诱变剂，而引入，或者失活性突变能以有针对性的方式，包括含有失活性突变的菌株同源重组和杂交，而引入。在此“cre-Ι基因”和“creA/cre-Ι基因”能交替使用。
[0095]在本发明的一个具体方面，相比缺乏失活的cre-Ι突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导该突变细胞转录水平高2、4、6、8、10、50、100、500、1，000,5, 000,10, 000、50，000，或100，000倍的至少一类蛋白。
[0096]在本发明的一个具体方面，相比缺乏cre-Ι突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导包括cre-Ι失活性突变的突变细胞分泌水平高1.2,1.4,1.6,1.8、2、4、6、8、10、
50、100、500、1，000,5, 000，或 10，000 倍的至少一类蛋白。
[0097]在本发明的另一 具体方面，与缺乏cre-Ι突变的细胞相比，突变细胞显示了参与C化合物/碳水化合物代谢、胞外代谢、具有结合的功能或辅助因子要求的蛋白质、C化合物/碳水化合物的运输、运输设施，和蛋白质合成的基因的表达基础水平升高。
[0098]在本发明的一个优选实施例中，粗糙脉孢菌细胞中缺失cre-Ι基因。
[0099]在本发明的另一方面，在cre-Ι基因中包括失活性突变的突变细胞进一步包括消除由至少两种β-葡萄糖苷酶基因编码的β-葡萄糖苷酶活性的失活性突变。该至少两种β -葡萄糖苷酶基因的失活性突变包括缺失、点突变、无义突变、截断，和插入。失活性突变可以完全消除β -葡萄糖苷酶活性或抑制至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或更多的活性。失活性突变可以影响突变基因的表达水平或影响由该突变基因编码的蛋白质或RNA的功能活性。失活性突变也可以是顺式或反式作用。失活性突变可以通过随机突变，包括辐射或暴露于化学诱变剂，而引入，或者失活性突变能以有针对性的方式，包括含有失活性突变的菌株同源重组和杂交，而引入。β-葡萄糖苷酶可以是胞内或胞外(即，分泌的)β-葡萄糖苷酶。
[0100]在本发明的一个具体方面，相比缺乏失活的β-葡萄糖苷酶突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导突变细胞转录水平高2、4、6、8、10、50、100、500、1，000、5，000、10，000,50, 000，或100，000倍的至少一类蛋白。
[0101]在本发明的一个具体方面，相比缺乏至少两种β-葡萄糖苷酶突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导突变细胞分泌水平高1.2,1.4,1.6,1.8、2、4、6、8、10、50、100、500、1，000,5, 000，或10，000倍的至少一类蛋白。
[0102]在本发明的另一具体方面，该至少两种β-葡萄糖苷酶为至少三种β-葡萄糖苷酶。
[0103]在本发明的一个优选实施例中，该突变细胞为包括β-葡萄糖苷酶基因NCU00130.NCU04952,以及NCU08755缺失和cre_l缺失的粗糙脉孢菌细胞。
[0104]甘露糖苷酶突变细胞
[0105]在本发明的另一方面，含有降低至少两种β -葡萄糖苷酶活性的失活性突变的本发明的突变细胞、在cre-Ι基因中含有失活性突变的本发明的突变细胞，和/或含有降低至少两种β -葡萄糖苷酶活性的失活性突变和在cre-Ι基因中含有失活性突变的突变细胞进一步包括降低至少一种β-甘露糖苷酶基因活性的失活性突变。
[0106]本发明的β_甘露糖苷酶基因编码β_甘露糖苷酶。在此使用的“β_甘露糖苷酶”、“甘露聚糖内切_1，6-β-甘露糖苷酶”、“内切-1，4-β-甘露聚糖酶”、“内切- β -1，4-甘露聚糖酶(endo-β -1，4-mannase)”、“ β -甘露聚糖酶B”、“ β -1, 4-甘露聚糖4-甘露聚糖水解酶”、“内切-β -甘露聚糖酶”、“ β -D-甘露聚糖酶”，和”1，4- β -D-甘露聚糖甘露聚糖水解酶”可以交替使用并且指的是能随机水解甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖(EC3.2.1.78)中的1，4-β-D-甘露糖苷键的酶。在某些发明，该至少一种β-甘露糖苷酶基因为NCU00890、里氏木霉蛋白ID62166、里氏木霉蛋白ID57857、其同源物，及其直系同源物。
[0107]在一个方面，本发明的突变细胞在至少一种β-甘露糖苷酶基因中包含失活性突变，这导致由该基因编码的β_甘露糖苷酶的功能丧失。该至少一种β_甘露糖苷酶基因的失活性突变包括，但不限于，缺失突变、点突变、无义突变、截断，和插入。失活性突变可以完全消除β -甘露糖苷酶的活性或抑制β -甘露糖苷酶至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或更多的活性。失活性突变可以影响突变基因的表达水平或影响由该突变基因编码的蛋白质或RNA的功能活性。失活 性突变也可以是顺式或反式作用。失活性突变可以通过随机突变，包括辐射或暴露于化学诱变剂，而引入，或者失活性突变能以有针对性的方式，包括含有失活性突变的菌株同源重组和杂交，而引入。
[0108]在本发明的一个具体方面，相比缺乏至少一种β-甘露糖苷酶基因失活性突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导进一步含有至少一种β-甘露糖苷酶基因失活性突变的突变细胞转录水平高 2、4、6、8、10、50、100、500、1，000,5, 000,10, 000,50, 000，或100，000倍的至少一类蛋白。
[0109]在本发明的一个具体方面，相比缺乏至少一种β_甘露糖苷酶失活性突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导进一步含有至少一种β_甘露糖苷酶失活性突变的突变细胞分泌水平高 1.2,1.4,1.6,1.8、2、4、6、8、10、50、100、500、1，000、5，000，或10，000 倍
的至少一类蛋白。
[0110]在本发明一个优选实施例中，在粗糙脉孢菌细胞中缺失至少一种β -甘露糖苷酶基因。
[0111]磷脂酶突变细胞
[0112]本发明的另一方面，含有降低至少两种β-葡萄糖苷酶活性的失活性突变的本发明的突变细胞、含有creA/cre- Ι基因中的失活性突变的本发明的突变细胞、含有降低至少两种β -葡萄糖苷酶活性的失活性突变和含有creA/cre-Ι基因中失活性突变的突变细胞，和/或含有降低至少两种β -葡萄糖苷酶活性的失活性突变，creA/cre-Ι基因中的失活性突变，和降低至少一种β-甘露糖苷酶活性的失活性突变的本发明的突变细胞进一步包括降低至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因活性的失活性突变。
[0113]在此使用的“磷脂酶类基因”是与磷脂酶基因具有序列同源性的基因，或编码与磷脂酶具有氨基酸序列同源性的蛋白的基因。例如，本发明的磷脂酶类基因可以为NCU06650。虽然NCU06650没有展示编码具有磷脂酶活性的蛋白，但编码的氨基酸序列的最接近的同源物为磷脂酶。
[0114]本发明的磷脂酶基因编码磷脂酶。在此使用的磷脂酶包括，但不限于，将磷脂水解成，例如，脂肪酸和其他亲脂性分子，的酶。编码磷脂酶的基因可以包括，但不限于，编码磷脂酶Al、磷脂酶Α2、磷脂酶B、磷脂酶C、磷脂酶D，或磷酸二酯酶的基因。
[0115]因此，在某些方面，该至少一种磷脂酶具有或磷脂酶类基因为NCU06650、里氏木霉蛋白ID67579、其同源物，及其直系同源物。
[0116]在一个方面，本发明的突变细胞在至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中包含失活性突变，该失活性突变导致由该基因编码的蛋白的功能丧失。该至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的失活性突变包括，但不限于，缺失突变、点突变、无义突变、截断，和插入。失活性突变可以完全消除磷脂酶的活性或抑制磷脂酶至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或更多的活性。失活性突变可以影响突变基因的表达水平或影响由该突变基因编码的蛋白质或RNA的功能活性。失活性突变也可以是顺式或反式作用。失活性突变可以通过随机突变，包括辐射或暴露于化学诱变剂，而引入，或者失活性突变能以有针对性的方式，包括含有失活性突变的菌株同源重组和杂交，而引入。
[0117]在本发明的一个具体方面，相比缺乏至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因失活性突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导进一步含有至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因失活性突变的突变细胞转录水平高2、4、6、8、10、50、100、500、1，000,5, 000,10, 000、50，000，或100，000倍的至少一类蛋白。
[0118]在本发明一个具体方面，相比缺乏至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因失活性突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导进一步含有至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因失活性突变的突变细胞分泌水平高1.2,1.4,1.6,1.8、2、4、6、8、10、50、100、500、1，000、5，000，或10，000倍的至少一类蛋白。
[0119]在本发明一个优选实施例中，在粗糙脉孢菌细胞中缺失至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因。
[0120]重组细胞
[0121]本发明的另一方面涉及重组细胞，该重组细胞显示了在细胞中至少两种β-葡萄糖苷酶具有或cre-Ι基因的表达下降，也显示了至少一类，至少两类，至少三类，至少四类，至少五类，或更多类蛋白的分泌增加以响应纤维素类生物质或糖类；以及涉及用这种细胞增加来自细胞的蛋白的分泌，和降解木质纤维素类生物质的方法。本发明的重组细胞可以是稳定细胞系或瞬时转染的细胞。
[0122]显示感兴趣的基因(例如，β -葡萄糖苷酶基因、cre-Ι基因、β -甘露糖苷酶基因，或者磷脂酶基因或磷脂酶类基因)的表达下降本发明的重组细胞可以含有降低感兴趣基因的表达的突变。本领域周知产生和塑造突变的方法，比如突变筛选。可选地,本发明的重组细胞可以为含有靶向并降低感兴趣基因的表达的重组构建体，比如抑制性寡核苷酸的转基因细胞。抑制性寡核苷酸的非限制性来自包括811?嫩、1^1?嫩、反义0嫩。此外，可以通过基因沉默技术，比如抑制或减数分裂沉默降低感兴趣基因的表达。基因沉默技术可以靶向感兴趣基因、感兴趣基因的RNA、感兴趣基因的调控蛋白。
[0123]本发明的重组细胞分泌的蛋白质的类型包括，但不限于，纤维素诱导蛋白。纤维素诱导蛋白的非限制性例子包括，但不限于，纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纤维素结合结构域的蛋白质。在某些方面，本发明的分泌蛋白由以下的基因编码:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和NCU05137。在某些方面，本发明的重组细胞增加至少一类、至少两类、至少三类、至少四类、至少五类，或更多类蛋白分泌。
[0124]在某些发明，与相应非重组细胞中至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达相比，本发明的重组细胞显示了该至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降。在其它实施例中，与相应非重组细胞中cre-Ι基因的表达相比，本发明的重组细胞显示了 cre-Ι基因的表达下降。
[0125]在此使用的“相应非重组细胞”指的是这样的细胞:与重组细胞的物种相同并在与重组细胞相同的条件下培养，但缺乏导致在重组细胞中降低基因表达的对重组细胞的修饰。本发明的基因的“表达下降”指的是与相应非修饰细胞中基因的表达水平相比，在修饰的细胞中该基因的表达水平降低。
[0126]在某些方面，该至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达可能会降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。在其它方面，该CRE-1基因的表达可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。
[0127]在本发明的具体方面，显示至少两种葡萄糖苷酶基因的蛋白下降的重组细胞进一步显示基因creA/cre-Ι的表达下降。降低creA/cre-Ι表达的方法可以为基因沉默技术，包括siRNA、miRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默。基因沉默技术可以靶向creA/cre-Ι或creA/cre-Ι调控蛋白，或RNA。CreA/cre-Ι表达可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。
[0128]在本发明的另一具体方面，显示至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降的重组细胞可以是通过显性失活突变或蛋白抑制剂的过表达使CreA/CRE-Ι转录因子的功能活性降低的细胞。CreA/CRE-Ι的功能可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。
[0129]在本发明另一具体方面，显示至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降的重组细胞，和/或显示至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达水平下降和基因creA/cre-Ι的表达水平下降的重组细胞可以进一步显示本发明的至少一种β-甘露糖苷酶基因的表达下降。降低β -甘露糖苷酶的方法包括，但不限于，基因沉默技术，包括siRNA、miRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默。基因沉默技术可以靶向至少一种β-甘露糖苷酶基因或β-甘露糖苷酶基因调控蛋白或RNA。β-甘露糖苷酶基因表达可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。在某些发明。在重组粗糙脉孢菌细胞中β-甘露糖苷酶基因NCU00890的表达降低。
[0130]在本发明另一具体方面，显示至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降的重组细胞、显示至少两种β -葡萄糖苷酶基因的表达水平下降和基因creA/cre-Ι的表达水平下降的重组细胞，和/或显示至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达水平下降、基因creA/cre-1的表达水平下降，和至少一种β-甘露糖苷酶基因的表达下降的重组细胞可以进一步展示本发明的至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达下降。降低磷脂酶表达的方法包括，但不限于，基因沉默技术，包括siRNA、miRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默。基因沉默技术可以靶向至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因或基因调控蛋白或RNA。磷脂酶基因或磷脂酶类基因表达可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。在某些发明。在重组粗糙脉孢菌细胞中β-甘露糖苷酶基因NCU00890的表达降低。在某些方面，在重组粗糙脉孢菌细胞中降低基因NCU06650的表达。
[0131]在本发明优选实施例中，在重组粗糙脉孢菌细胞中降低β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952，和NCU08755的表达。在本发明另一优选实施例中，在重组粗糙脉孢菌细胞中降低β -葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952，和NCU08755的表达，以及cre_l基因的表达。在本发明另一优选实施例中，在重组粗糙脉孢菌细胞中降低β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952，和NCU08755的表达，cre-Ι基因的表达，以及β _甘露糖苷酶基因NCU00890的表达。在本发明进 一步优选实施例中，在重组粗糙脉孢菌细胞中降低β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952，和NCU08755的表达，cre-Ι基因的表达、β -甘露糖苷酶基因NCU00890的表达，以及基因NCU06650的表达。
[0132]在本发明的一个方面，该重组细胞显示了基因cre-Ι基因的表达下降。降低cre-1表达的方法包括，但不限于基因沉默技术，包括siRNA、miRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默。基因沉默技术可以靶向cre-Ι或cre-Ι调控蛋白，或RNA。在重新细胞中，Cre-1表达可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%、至少 99%，或 100%。
[0133]在本发明的另一方面，在重组细胞中通过显性失活突变或蛋白抑制剂的过表达降低CreA/CRE-Ι转录因子的功能活性。CreA/CRE_l的功能可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或
100% ο
[0134]变体、序列一致性，和序列相似性[0135]本领域周知用于比较的序列比对方法。例如，确定任何两条序列之间的序列一致性百分比可以用数学算法实现。这种数学算法的非限制性来自为Myers和Miller (1988)CAB10S4:1117 算法、Smith 等人(1981) Adv.Appl.Math.2:482 的局部同源算法、Needleman和 Wunsch (1970) J.Mol.Biol.48:443453 的同源比对算法、Pearson 和 Lipman (1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.85:24442448 的搜索相似性算法、在 Karlin 和 Altschul (1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:58735877 中修改的 Karlin 和 Altschul (1990) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA872264 算法。[0136]这些数学算法的计算机执行可以用于序列比较以确定序列一致性。这些执行包括，但不限于，PC/Gene程序中的CLUSTAL(可从加州山景城的Intelligenetics获得)、ALIGN 程序(第 2 版)，和 Wisconsin Genetics 软件包中的 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA,和TFASTA,第8版(可从美国威斯康星州麦迪逊市575Science Drive的GeneticsComputer Group (GCG)获得)可以用缺省参数以这些程序进行比对。Higgins等人(1988)Gene73:237244(1988)、Higgins 等人(1989)CAB10S5:151153、Corpet 等人(1988)NucleicAcids Res.16:1088190、Huang 等人(1992) CAB10S8:15565，和 Pearson 等人(1994) MetLMol.Biol.24:307331中详细描述了 CLUSTAL程序。ALIGN程序是基于上述Myers和Miller (1988)的算法。当比较氨基酸序列时，可以将PAM120权重残基表、间隙长度罚分12，和间隙罚分 4 与 ALIGN 程序一起使用。Altschul 等人(1990) J.Mol.Biol.215:403 的BLAST程序是基于上述Karlin和Altschul (1990)的算法。BLAST核苷酸搜索能以BLASTN程序，得分=100，字长=12执行，以获得与编码本发明的蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索能以BLASTX程序，得分=50，字长=3执行，以获得与本发明的蛋白或多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的间隙比对，可以利用Altschul等人(1997) Nucleic Acids Res.25:3389 中描述的 Gapped BLAST (在 BLAST2.0 中)。可选地，PS1-BLAST (在BLAST2.0中)可以用于执行迭代搜索，迭代搜索检测分子间的距离关系。参见上述 Altschul 等人(1997)的文献。当利用 BLAST、Gapped BLAST，或 PS1-BLAST 时，可以利用各个程序(例如，用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白的BLASTX)的缺省参数。参见http://www.ncb1.nlm.nih.gov。I:匕对也可以通过审视手动执--。
[0137]在此使用的序列一致性或在两条核酸或多肽序列的背景下的一致性指的是当在指定的比较窗口比对最大相符度时，两条序列的残基相同。当序列一致性的百分比与蛋白相关时，不一致的并且通常是因保守的氨基酸替换而不同的残基位置不改变该分子的功能特性，其中氨基酸被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基替换，这是公认的。当保守替换中的序列有区别时，可将序列一致性百分比向上调节以修正替换的保守性。在这些保守替换中有区别的序列被认为是具有序列相似性或相似性。本领域技术人员周知进行调节的方法。通常，这涉及将保守替换作为部分而不是完全错配打分，从而提高序列一致性百分比。因此，例如，一致的氨基酸给I分，而非保守替换给O分，保守替换给O和I之间的分数。例如，在程序PC/GENE中执行保守替换的打分(加州山景城的Intelligenetics)
[0138]用比如在Sambrook, J.等人 2000 年 Molecular Cloning:A LaboratoryManual (第三版)中所述的标准分子生物技术可以合成、分离，或操作核酸。技术可以包括克隆、cDNA文库表达，和mRNA或基因组DNA扩增。本发明的核酸或其序列可以并入包括表达盒或载体的克隆载体中。克隆载体可以是病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、柯斯质粒(cosmid)、福斯质粒(fosmid)、细菌噬菌体，或人工染色体。该病毒载体可包括腺病毒载体，逆转录病毒载体，或腺相关病毒载体。克隆载体可包括细菌人工染色体(BAC)、质粒、细菌噬菌体Pl衍生载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)，或哺乳动物人工染色体(MAC)。
[0139]核酸能可操作地连接到启动子。启动子可以是病毒、细菌、哺乳动物或植物启动子。启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子，或环境调控和发育调控启动子。
[0140]增加蛋白分泌的方法
[0141]本发明的其它方面涉及通过提供能分泌至少一类、至少两类、展示三类、至少四类、至少五类，或更多类蛋白以响应纤维素类生物质或糖类的本发明的细胞增加来自细胞的蛋白的分泌的方法，及通过使该细胞与纤维素类生物质或糖类接触诱导该细胞分泌至少两类、展示三类、至少四类、至少五类，或更多类蛋白。可与本发明的方法一起使用的纤维素类生物质可以包括，但不限于，多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。在某些优选实施例中，该纤维素类生物质包括纤维二糖。
[0142]可与本发明的方法一起使用的糖类包括，但不限于多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖、纤维六糖，和槐糖。在某些优选实施例中，该糖类为纤维二糖。本发明的重组细胞分泌的蛋白的类型包括，但不限于:纤维素诱导蛋白。纤维素诱导蛋白的非限制性例子包括，但不限于:纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纤维素结合结构域的蛋白质。在某些方面，本发明的分泌蛋白由以下的基因编码:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCUO7190, NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764,或 NCU05137。
[0143]因此，本发明的某些方面提供增加来自细胞的蛋白的分泌的方法，通过:提供突变细胞，其中该突变细胞在两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因中含有失活性突变，或在该细胞中的cre-Ι基因中含有失活性突变；以及使该突变细胞与纤维素类生物质或糖类接触，其中该纤维素类生物质或糖类诱导该突变细胞分泌蛋白。在某些方面，该纤维素类生物质或糖类诱导该细胞分泌至少两类、展示三类、至少四类、至少五类，或更多类蛋白。
[0144]在一些方面，增加来自细胞的蛋白分泌的方法包括在存在β-葡萄糖苷酶抑制剂的情况下，诱导该蛋白分泌。优选地，该β_葡萄糖苷酶抑制剂为野尻霉素。
[0145]本发明的其它方面提供增加来自细胞的蛋白的分泌的方法，通过:提供重组细胞，其中与相应非重组细胞中的至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达相比，该重组细胞显示该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降，或与相应非重组细胞中的cre-Ι基因的表达相比，显示cre-Ι基因的表达下降；以及使该重组细胞与纤维素类生物质或糖类接触，其中该纤维素类生物质或糖类诱导该重组细胞分泌蛋白。在某些方面，该纤维素类生物质或糖类诱导该细胞分泌至少两类、展示三类、至少四类、至少五类，或更多类蛋白。
[0146]降解木质纤维素类生物质的方法 [0147]本发明另外的方面涉及通过提供木质纤维素类生物质、提供本发明的任何突变或重组细胞、通过使该细胞与纤维素类生物质或糖类接触诱导该细胞分泌至少一类、至少两类、展示三类、至少四类、至少五类，或更多类蛋白，和使诱导的细胞与木质纤维素类生物质接触，降解生物质的方法，其中分泌的至少一类、至少两类、展示三类、至少四类、至少五类，或更多类蛋白降解木质纤维素类生物质。
[0148]木质纤维素类生物质一般指的是含纤维素和紧密结合至木质素的其它碳水化合物的聚合物的植物生物质。合适的木质纤维素类生物质的例子包括，但不限于，植物材料，城市固体废弃物，城市废纸，木屑，锯木厂和造纸厂的废物，和农业残余物。适宜的植物材料的例子包括，但不限于，芒草、能源草、象草、柳枝稷、大米草(cord grass)、黑麦草、草芦(reed canary grass)、芦華、麦稻(wheat straw)、大麦杆(barley straw)、油菜稻杆、燕麦秸杆、玉米秸、大豆秸、燕麦壳、燕麦(oat spelt)、高粱、稻壳、甘蔗渣、玉米纤维、大麦、燕麦、亚麻、亚麻、小麦、亚麻籽、柑橘渣、棉籽、落花生、油菜籽、向日葵、豌豆、羽扇豆属植物(lupines)、棕榈仁、椰子、魔芋、刺槐豆胶、瓜尔豆胶(gum guar)、黄豆、干酒糟可溶物(Distillers Dried Grains with Solubles、DDGS)、i^ (Blue Stem)、玉米芯、松树、针叶树软木(conifer softwood)、桉树、桦木、柳树、山杨(aspen)、白杨(poplar wood)、杂交白杨(hybr i d pop I ar )、能源甘鹿、短周期木本作物、作物残洛、庭园废物,及其组合。
[0149]可与本发明的方法一起使用的纤维素类生物质包括，但不限于:多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。在某些优选实施例中，该纤维素类生物质包括纤维二糖。
[0150]可以与本发明的方法一起使用的糖类包括，但不限于多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖、纤维六糖，和槐糖。在某些优选实施例中，该糖类为纤维二糖。本发明的重组细胞分泌的蛋白质的类型包括，但不限于纤维素诱导蛋白。纤维素诱导蛋白的非限制性例子包括，但不限于:纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纤维素结合结构域的蛋白质。在某些方面 ，本发明的分泌蛋白由以下的基因编码:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764,或 NCU05137。
[0151]在本发明的一些方面，降解木质纤维素类生物质的方法包括在存在β-葡萄糖苷酶抑制剂的情况下，用如上所述的本发明的突变细胞与木质纤维素类生物质接触的步骤。优选地，该β_葡萄糖苷酶抑制剂为野尻霉素。
[0152]Sffl
[0153]在此描述的方法可以结合降解木质纤维素类生物质的其它方法一起实行。
[0154]例如，木质纤维素类生物质可以进行预处理，该预处理包括氨纤维膨胀(AFEX)、蒸汽爆破、用碱性水溶液、酸性溶液、有机溶剂、离子液体(IL)、电解水、磷酸处理，及其组合。将木质素从植物材料移除的预处理可以增加从半纤维素中释放的糖的总量。
[0155]实施例
[0156]以下的实施例仅仅用于说明，并且不以任何方式限制本发明的任何方面。
[0157]实施例1
[0158]以下实施例涉及在粗糙脉胞菌三个β -葡萄糖苷酶基因缺失菌株和三个β -葡萄糖苷酶和cre-Ι基因缺失菌株中纤维素酶的转录和纤维素分解酶的产量的特征。
[0159]材料和方法[0160]菌株
[0161]从真菌遗传库存中心(Fungal Genetics Stock Center, FGSC)获得的菌株包括粗糙脉胞菌野生型(WT) (FGSC2489)、cre-Ι基因缺失体(△ cre-1) (FGSC10372)，以及胞内β-葡萄糖苷酶NCU00130(FGSC11822和FGSCl 1823)和胞外β-葡萄糖苷酶:NCU08755 (FGSC18387 和 FGSC18388)和 NCU04952 (FGSC13731 和 FGSC13732)的缺失菌株。
[0162]用 FGSC(http:1Iwm.fgsc.net/neurosporaprotocols/How%20to%20make%20a%20cross-2, pdf)描述的方法进行序列杂交产生四重缺失体。用基因特异性引物和潮霉素(hph)盒的普通引物确定所有缺失菌株的基因型。用于hph的正向引物为:
[0163]hph Middle FWD:5，_CGA CAG ACG TCG CGG TGA GTT CAG-3’[SEQ ID NO:4]
[0164]反向引物为:
[0165]NCUOO130: 5，-TAG TGT ACA AAC CCC AAG C_3， [SEQ ID NO:5]
[0166]NCU004953: 5，-AAC ACA CAC ACA CAC ACT GG-3’ [SEQ ID NO:6]
[0167]NCU08755: 5’ -ACA GTG GAG GTG AGA AAG G_3’ [SEQ ID NO:7]
[0168]NCU08807: 5，-GTA CTT ACG CAG TAG CGT GG-3’ [SEQ ID NO:8]
[0169]转录生长研究
[0170]在含有50ml Vogel’ s盐和2%(wt/vol)蔗糖的250ml爱伦美氏烧瓶中，当0D595等于0.05时接种菌株，并使菌株在持续光照，200rpm的情况下，生长16小时。接着，使生物质在4000rpm下旋转10分钟并用Vogel’s中洗漆两次以移除任何多余的鹿糖。然后，将该生物质加入含2%(wt/vol)鹿糖 、纤维二糖(Sigma),或Avicei# PHlOl (Avicel?)的50ml新培养物中。在持续光照，200rpm的情况下，诱导培养物4小时。接着通过Whatman玻璃微纤维过滤器(GF/F)过滤在布氏漏斗(Buchner funnel)上收集培养物生物质并用50ml Vogel’s洗涤。生物质在液态氮中速冻并储存在_80°C。
[0171]RNA 分离
[0172]根据生产商指示，用氧化错/ 二氧化娃小珠(0.2g,直径0.5mm ;Biospec)和Min1-Beadbeater-96 (Biospec)以及 ImL TRIzol 试剂(Invitrogen)分离来自冷冻样品的总 RNA。通过用不含 DNA 的 TURBO (TURBO DNA-free, Ambion)和 RNeasy 试剂盒(Qiagen)消化进一步纯化总RNA。通过Nanodrop和琼脂糖凝胶电泳检查RNA完整性。
[0173]实时定量RT-PCR
[0174]用EXPRESS One-Step SYBR GreenER 试剂盒(Invitrogen)和 StepOnePlus 实时PCR系统(Applied Biosystems)进行定量RT-PCR。反应以10 μ I总反应体积，一式三份地进行，其中10 μ I总反应体积包括各300ηΜ的正向引物和反向引物以及75ng模板RNA。通过StepOne软件(Applied Biosystems)用相对定量/比较CT ( Δ Δ CT)进行数据分析。按鹿糖上表达的内源性对照肌动蛋白(endogenous control actin)作为参考样品使数据标准化。误差条代表95%置信区间。使用Tian等人2009年描述的RT-PCR引物。
[0175]肌动蛋白:5’-TGA TCT TAC CGA CTA CCT-3’ [SEQ ID NO:9]
[0176]5’ -CAG AGC TTC TCC TTG ATG-3’ [SEQ ID NO:10]
[0177]CBHI (NCU07340) 5’ -ATC TGG GAA GCG AAC AAA G_3’ [SEQ ID NO: 11] [0178]5’ -TAG CGG TCG TCG GAA TAG-3’ [SEQ ID NO:12]
[0179]CBHII (NCU09680) 5’ -CCC ATC ACC ACT ACT ACC-3’ [SEQ ID NO: 13]
【权利要求】
1.一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，所述方法包括: (a)提供突变细胞，其中所述突变细胞包括两种或更多种葡萄糖苷酶基因中的失活性突变；以及 (b)将所述突变细胞与纤维素类生物质接触，其中所述纤维素类生物质诱导所述突变细胞分泌所述蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述突变细胞进一步包括位于该细胞的cre-Ι基因中的失活性突变。
3.一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，所述方法包括: Ca)提供突变细胞，其中所述突变细胞包括位于该细胞的cre-Ι基因中的失活性突变；以及 (b)将所述突变细胞与纤维素类生物质接触，其中所述纤维素类生物质诱导所述突变细胞分泌所述蛋白质。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述突变细胞进一步包括位于两种或更多种葡萄糖苷酶基因中的失活性突变。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或多种。
6.根据权利要求1-4 中任意一项所述的方法，其特征在于，所述纤维素类生物质包括纤维二糖。
7.一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，所述方法包括: (a)提供突变细胞，其中所述突变细胞包括两种或更多种葡萄糖苷酶基因中的失活性突变；以及 (b)将所述突变细胞与糖类接触，其中所述糖类诱导所述突变细胞分泌所述蛋白质。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述突变细胞进一步包括位于所述细胞的cre-Ι基因中的失活性突变。
9.一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，所述方法包括: (a)提供突变细胞，其中所述突变细胞包括位于该细胞的cre-Ι基因中的失活性突变；以及(b)将所述突变细胞与糖类接触，其中所述糖类诱导所述突变细胞分泌所述蛋白质。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述突变细胞进一步包括位于两种或更多种葡萄糖苷酶基因中的失活性突变。
11.根据权利要求7-10中任意一项所述的方法，其特征在于，所述糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。
12.根据权利要求7-10中任意一项所述的方法，其特征在于，所述糖类为纤维二糖。
13.根据权利要求1-12中任意一项所述的方法，其特征在于，所述分泌蛋白为纤维素诱导蛋白。
14.根据权利要求1-13中任意一项所述的方法，其特征在于，所述分泌蛋白选自:纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。
15.根据权利要求1-13中 任意一项所述的方法，其特征在于，所述分泌蛋白为纤维素酶。
16.根据权利要求1-13中任意一项所述的方法，其特征在于，所述分泌蛋白由选自以下的基因编码:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。
17.根据权利要求1-16中任意一项所述的方法，其特征在于，所述突变细胞进一步包括位于该细胞的至少一种β-甘露糖苷酶基因中的失活性突变。
18.根据权利要求1-17中任意一项所述的方法，其特征在于，所述突变细胞进一步包括位于该细胞的至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中的失活性突变。
19.根据权利要求1-18中任意一项所述的方法，其特征在于，所述失活性突变为缺失。
20.根据权利要求1-19中任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为重组细胞。
21.根据权利要求1-20中任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为真菌或酵母细胞。
22.根据权利要求1-21中任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为子囊菌和担子菌物种的丝状真菌。
23.根据权利要求1-22中任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞选自粗糙脉孢菌(N.crassa)细胞、构巢曲霉细胞、里氏木霉细胞、黄孢原毛平革菌细胞、嗜热侧孢霉(嗜热毁丝霉)细胞、玉米赤霉细胞、核盘菌细胞、灰葡萄孢霉细胞、黑曲霉细胞、产黄青霉细胞、裂褶菌细胞、褐腐菌细胞、米曲霉细胞和解纤维顶孢霉细胞。
24.根据权 利要求1-23中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为三种或更多种葡萄糖苷酶基因。
25.根据权利要求1-23中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为四种或更多种葡萄糖苷酶基因。
26.根据权利要求1-23中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为五种或更多种葡萄糖苷酶基因。
27.根据权利要求1-23中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为六种或更多种葡萄糖苷酶基因。
28.根据权利要求1-23中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为七种或更多种葡萄糖苷酶基因。
29.根据权利要求24-28中任意一项所述的方法，其特征在于，所述三种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、四种或更多种葡萄糖苷酶基因、五种或更多种葡萄糖苷酶基因、六种或更多种葡萄糖苷酶基因，或七种或更多种葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和 NCU08755。
30.根据权利要求1-29中任意一项所述的方法，其特征在于，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞内葡萄糖苷酶。
31.根据权利要求1-29中任意一项所述的方法，其特征在于，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞外葡萄糖苷酶。
32.根据权利要求1-31中任意一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种β-甘露糖苷酶基因为NCU00890。
33.根据权利要求1-32中任意一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因为NCU06650。
34.一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，所述方法包括: (a)提供重组细胞，其中与相应非重组细胞中至少两种葡萄糖苷酶基因的表达相t匕，所述重组细胞中所述至少两种葡萄糖苷酶基因的表达显示出下降；以及 (b)将所述重组细胞与纤维素类生物质接触，所述纤维素类生物质诱导所述重组细胞分泌所述蛋白质。
35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，与相应非重组细胞中的cre-Ι基因的表达相比，所述重组细胞进一步显示出cre-Ι基因的表达下降。
36.一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，所述方法包括: (a)提供重组细胞，其中与相应非重组细胞中cre-Ι基因的表达相比，所述重组细胞显示出cre-Ι基因的表达下降；以及 (b)将所述重组细胞与纤维素类生物质接触，其中所述纤维素类生物质诱导所述重组细胞分泌所述蛋白质。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，与相应非重组细胞中至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达相比，所述重组细胞进一步显示出所述至少两种葡萄糖苷酶基因的表达下降。
38.根据权利要求34-371中任意一项所述的方法，其特征在于，所述纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤 维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。
39.根据权利要求34-37中任意一项所述的方法，其特征在于，所述纤维素类生物质包括纤维二糖。
40.一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，所述方法包括: (a)提供重组细胞，其中与相应非重组细胞中的至少两种葡萄糖苷酶基因的表达相比，所述重组细胞显示出所述至少两种葡萄糖苷酶基因的表达下降；以及 (b)将所述重组细胞与糖类接触，其中所述糖类诱导所述重组细胞分泌所述蛋白质。
41.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，与相应非重组细胞中的cre-Ι基因的表达相比，所述重组细胞进一步显示出cre-Ι基因的表达下降。
42.一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，所述方法包括: Ca)提供重组细胞，其中与相应非重组细胞中cre-Ι基因的表达相比，所述重组细胞显示出cre-Ι基因的表达下降；以及 (b)将所述重组细胞与糖类接触，其中所述糖类诱导突变细胞分泌所述蛋白质。
43.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，与相应非重组细胞中至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达相比，所述重组细胞进一步显示出所述至少两种葡萄糖苷酶基因的表达下降。
44.根据权利要求40-43中任意一项所述的方法，其特征在于，所述糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。
45.根据权利要求40-43中任意一项所述的方法，其特征在于，所述糖类为纤维二糖。
46.根据权利要求34-45中任意一项所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白质为纤维素诱导蛋白。
47.根据权利要求34-46中任意一项所述的方法，其特征在于，所述分泌蛋白选自:纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。
48.根据权利要求34-46中任意一项所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白质为纤维素酶。
49.根据权利要求34-46中任意一项所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白质由选自以下的基因编码:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。
50.根据权利要求34-49中任意一项所述的方法,其特征在于,creA/cre-Ι的功能通过使显性失活突变或蛋白抑制剂过表达而降低。
51.根据权利要求34-50中任意一项所述的方法，其特征在于，与相应非重组细胞中至少一种甘露糖苷酶基因的表达相比，所述重组细胞进一步显示出所述至少一种甘露糖苷酶基因的表达下降。
52.根据权利要求34-51中任意一项所述的方法，其特征在于，与相应非重组细胞中磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达相比，所述重组细胞进一步显示出所述磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达下降。
53.根据权利要求34-52中任意一项所述的方法，其特征在于，通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉 默降低基因表达。
54.根据权利要求34-53中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为三种或更多种葡萄糖苷酶基因。
55.根据权利要求34-53中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为四种或更多种葡萄糖苷酶基因。
56.根据权利要求34-53中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为五种或更多种葡萄糖苷酶基因。
57.根据权利要求34-53中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为六种或更多种葡萄糖苷酶基因。
58.根据权利要求34-53中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为七种或更多种葡萄糖苷酶基因。
59.根据权利要求54-58中任意一项所述的方法，其特征在于，所述三种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、四种或更多种葡萄糖苷酶基因、五种或更多种葡萄糖苷酶基因、六种或更多种葡萄糖苷酶基因，或七种或更多种葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和 NCU08755。
60.根据权利要求34-59中任意一项所述的方法，其特征在于，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞内葡萄糖苷酶。
61.根据权利要求34-59中任意一项所述的方法，其特征在于，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞外葡萄糖苷酶。
62.根据权利要求34-61中任意一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种β-甘露糖苷酶基因为NCU00890。
63.根据权利要求34-62中任意一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因为NCU06650。
64.根据权利要求34-63中任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为稳定细胞系或瞬时转染的细胞。
65.根据权利要求34-64中任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为真菌或酵母细胞。
66.根据权利要求34-65中任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为子囊菌和担子菌物种的丝状真菌。
67.根据权利要求34-66中任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞选自粗糙脉孢菌(N.crassa)细胞、构巢曲霉细胞、里氏木霉细胞、黄孢原毛平革菌细胞、嗜热侧孢霉(嗜热毁丝霉)细胞、玉米赤霉细胞、核盘菌细胞、灰葡萄孢霉细胞、黑曲霉细胞、产黄青霉细胞、裂褶菌细胞、褐腐菌细胞、米曲霉细胞和解纤维顶孢霉细胞。
68.一种突变细胞，所述突变细胞包括位于两种或更多种葡萄糖苷酶基因中的失活性突变，其中，与在所述两种或更多种葡萄糖苷酶基因中缺乏所述突变的相应细胞相比，纤维素类生物质能够诱导所述突变细胞分泌更高水平的蛋白质。
69.根据权利要求68所述的突变细胞，其特征在于，在所述突变细胞的cre-Ι基因中进一步包括失活性突变，其中与在cre-Ι基因中缺乏所述突变的相应细胞相比，纤维素类生物质能够诱导所述突变细胞分泌更高水平的蛋白质。
70.根据权利要求68或权 利要求69所述的突变细胞，其特征在于，在所述突变细胞的至少一种β_甘露糖苷酶基因中进一步包括失活性突变，其中与在至少一种β_甘露糖苷酶基因中缺乏所述突变的相应细胞相比，纤维素类生物质能够诱导所述突变细胞分泌更高水平的蛋白质。
71.根据权利要求68-70中任意一项所述的突变细胞，其特征在于，在所述突变细胞的至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中进一步包括失活性突变，其中与在所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中缺乏所述突变的相应细胞相比，纤维素类生物质能够诱导所述细胞分泌更高水平的蛋白质。
72.根据权利要求68-71中任意一项所述的突变细胞，其特征在于，所述纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。
73.根据权利要求68-71中任意一项所述的突变细胞，其特征在于，所述纤维素类生物质包括纤维二糖。
74.一种突变细胞，在该突变细胞的两种或更多种葡萄糖苷酶基因中包括失活性突变，其中与在所述两种或更多种葡萄糖苷酶基因中缺乏所述突变的相应细胞相比，糖类能够诱导所述突变细胞分泌更高水平的蛋白质。
75.根据权利要求74所述的突变细胞，其特征在于，在所述突变细胞的cre-Ι基因中进一步含有失活性突变，其中与在所述cre-Ι基因中缺乏所述突变的相应细胞相比，糖类能够诱导所述突变细胞分泌更高水平 的蛋白质。
76.根据权利要求74或权利要求75所述的突变细胞，其特征在于，在所述突变细胞的至少一种β_甘露糖苷酶基因中进一步包括失活性突变，其中与在所述至少一种β_甘露糖苷酶基因中缺乏所述突变的相应细胞相比，糖类能够诱导所述突变细胞分泌更高水平的蛋白质。
77.根据权利要求74-76中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，在所述突变细胞的至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中进一步包括失活性突变，其中与在所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中缺乏所述突变的相应细胞相比，糖类能够诱导所述突变细胞分泌更高水平的蛋白质。
78.根据权利要求74-77中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。
79.根据权利要求74-77中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述糖类为纤维二糖。
80.根据权利要求68-79中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，分泌的蛋白质为纤维素诱导蛋白。
81.根据权利要求68-80中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，分泌的蛋白质选自:纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。
82.根据权利要求 68-80中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，分泌的蛋白质为纤维素酶。
83.根据权利要求68-80中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，分泌的蛋白质由选自以下的基因编码:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。
84.根据权利要求68-83中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述失活性突变为缺失。
85.根据权利要求68-84中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述细胞为重组细胞。
86.根据权利要求68-85中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述细胞为真菌或酵母细胞。
87.根据权利要求68-86中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述细胞为子囊菌和担子菌物种的丝状真菌。
88.根据权利要求68-87中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述细胞选自粗糙脉孢菌(N.crassa)细胞、构巢曲霉细胞、里氏木霉细胞、黄孢原毛平革菌细胞、嗜热侧孢霉(嗜热毁丝霉)细胞、玉米赤霉细胞、核盘菌细胞、灰葡萄孢霉细胞、黑曲霉细胞、产黄青霉细胞、裂褶菌细胞、褐腐菌细胞、米曲霉细胞和解纤维顶孢霉细胞。
89.根据权利要求68-88中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为三种或更多种葡萄糖苷酶基因。
90.根据权利要求68-88中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为四种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
91.根据权利要求68-88中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为五种或更多种葡萄糖苷酶基因。
92.根据权利要求68-88中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为六种或更多种葡萄糖苷酶基因。
93.根据权利要求68-88中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为七种或更多种葡萄糖苷酶基因。
94.根据权利要求89-93中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述三种或更多种葡萄糖苷酶基因、四种或更多种葡萄糖苷酶基因、五种或更多种葡萄糖苷酶基因、六种或更多种葡萄糖苷酶基因，或七种或更多种葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和 NCU08755。
95.根据权利要求68-94中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞内葡萄糖苷酶。
96.根据权利要求68-94中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞外葡萄糖苷酶。
97.根据权利要求68-96中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述至少一种β -甘露糖苷酶基因为NCU00890。
98.根据权利要求68-97中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因为NCU06650。
99.一种重组细胞，与相 应非重组细胞中至少两种葡萄糖苷酶基因的表达相比，所述重组细胞显示出所述至少两种葡萄糖苷酶基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默来降低所述表达，并且与所述至少两种β -葡萄糖苷酶基因表达不下降的相应非重组细胞相比，纤维素类生物质能够诱导所述重组细胞分泌更高水平的蛋白质。
100.根据权利要求99中所述的重组细胞，其特征在于，与相应非重组细胞中cre-Ι基因的表达相比，所述重组细胞进一步显示出cre-Ι基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默来降低所述表达，并且与所述cre-Ι基因表达不下降的相应非重组细胞相比，纤维素类生物质能够诱导所述重组细胞分泌更高水平的蛋白质。
101.根据权利要求100中所述的重组细胞，其特征在于，creA/cre-Ι的功能通过显性失活突变或蛋白抑制剂的过表达而降低，其中与显性失活突变没有过表达的相应细胞相t匕，纤维素类生物质能够诱导所述重组细胞分泌更高水平的蛋白质。
102.根据权利要求99-101中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，与相应非重组细胞中至少一种甘露糖苷酶基因的表达相比，所述重组细胞显示出所述至少一种甘露糖苷酶基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默来降低所述表达，并且与所述至少一种甘露糖苷酶基因表达不下降的相应非重组细胞相比，纤维素类生物质能够诱导所述重组细胞分泌更高水平的蛋白质。
103.根据权利要求99-102中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，与相应非重组细胞中至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达相比，所述重组细胞进一步显示出所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的 表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默来降低所述表达，并且与所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因表达不下降的非重组细胞相比，纤维素类生物质能够诱导所述重组细胞分泌更高水平的蛋白质。
104.根据权利要求99-103中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。
105.根据权利要求99-103中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述纤维素类生物质包括纤维二糖。
106.一种重组细胞，与相应非重组细胞中至少两种葡萄糖苷酶基因的表达相比，所述重组细胞显示出所述至少两种β -葡萄糖苷酶基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默来降低所述表达，并且与所述至少两种β -葡萄糖苷酶基因表达不下降的相应非重组细胞相比，糖类能够诱导所述重组细胞分泌更高水平的蛋白质。
107.根据权利要求106所述的重组细胞，其特征在于，与相应非重组细胞中cre-Ι基因的表达相比，所述重组细胞显示出cre-Ι基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默来降低所述表达，并且与所述cre-Ι基因表达不下降的相应非重组细胞相t匕，糖类能够诱导所述重组细胞分泌更高水平的蛋白质。
108.根据权利要求107所述的重组细胞，其特征在于，creA/cre-Ι的功能通过显性失活突变或蛋白抑制剂的过表达而降低，其中与显性失活突变没有过表达的相应细胞相比，糖类能够诱导所述重组细胞分泌更高水平的蛋白质。
109.根据权利要求106-108中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，与相应非重组细胞中至少一种甘露糖苷酶基因的表达相比，所述重组细胞显示出所述至少一种β -甘露糖苷酶基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默来降低所述表达，并且与所述至少一种甘露糖苷酶基因表达不下降的相应非重组细胞相比，糖类能够诱导所述重组 细胞分泌更高水平的蛋白质。
110.根据权利要求106-109中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，与相应非重组细胞中至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达相比，所述重组细胞进一步显示出所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默来降低所述表达，并且与所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因表达不下降的非重组细胞相比，糖类能够诱导所述重组细胞分泌更高水平的蛋白质。
111.根据权利要求106-110中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。
112.根据权利要求106-110中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述糖类为纤维二糖。
113.根据权利要求99-112中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，分泌的蛋白质为纤维素诱导蛋白。
114.根据权利要求99-113中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，分泌的蛋白质选自:纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。
115.根据权利要求99-113中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，分泌的蛋白质为纤维素酶。
116.根据权利要求99-113中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，分泌的蛋白质由选自以下的基因编码:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。
117.根据权利要求99-116中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述两种或更多种葡萄糖苷酶基因为三种或更多种葡萄糖苷酶基因。
118.根据权利要求99-116中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述两种或更多种葡萄糖苷酶基因为四种或更多种葡萄糖苷酶基因。
119.根据权利要求99-116中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述两种或更多种葡萄糖苷酶基因为五种或更多种葡萄糖苷酶基因。
120.根据权利要求99-116中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述两种或更多种葡萄糖苷酶基因为六种或更多种葡萄糖苷酶基因。
121.根据权利要求99-116中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述两种或更多种葡萄糖苷酶基因为七种或更多种葡萄糖苷酶基因。
122.根据权利要求117-121中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述三种或更多种葡萄糖苷酶基因、四种或更多种葡萄糖苷酶基因、五种或更多种葡萄糖苷酶基因、六种或更多种葡萄糖苷酶基因，或七种或更多种葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和 NCU08755。
123.根据权利要求99-122中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞内葡萄 糖苷酶。
124.根据权利要求99-122中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞外葡萄糖苷酶。
125.根据权利要求99-124中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述至少一种β -甘露糖苷酶基因为NCU00890。
126.根据权利要求99-125中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因为NCU06650。
127.根据权利要求99-126中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述细胞为稳定细胞系或瞬时转染的细胞。
128.根据权利要求99-127中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述细胞为真菌或酵母细胞。
129.根据权利要求99-128中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述细胞为子囊菌和担子菌物种的丝状真菌。
130.根据权利要求99-129中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述细胞选自粗糙脉孢菌(N.crassa)细胞、构巢曲霉细胞、里氏木霉细胞、黄孢原毛平革菌细胞、嗜热侧孢霉(嗜热毁丝霉)细胞、玉米赤霉细胞、核盘菌细胞、灰葡萄孢霉细胞、黑曲霉细胞、产黄青霉细胞、裂褶菌细胞、褐腐菌细胞、米曲霉细胞和解纤维顶孢霉细胞。
131.一种降解生物质的方法，所述方法包括: (a)提供木质纤维素类生物质；(b)提供权利要求68-130中任何一项所述的细胞，或提供在cre-Ι基因中含有失活性突变的细胞； (c)通过用纤维素类生物质接触所述细胞，诱导所述细胞分泌蛋白质；以及 (d)用木质纤维素类生物质接触经过诱导的细胞，其中，分泌的蛋白质降解所述木质纤维素类生物质。
132.根据权利要求131所述的方法，其特征在于，所述纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。
133.根据权利要求131所述的方法，其特征在于，所述纤维素类生物质包括纤维二糖。
134.一种降解生物质的方法，所述方法包括: (a)提供木质纤维素类生物质； (b)提供权利要求68-130中任何一项所述的细胞，或提供在cre-Ι基因中含有失活性突变的细胞； (c)用糖类接触所述细胞诱导所述细胞分泌蛋白质；以及 (d)用木质纤维素类生物质接触经过诱导的细胞，其中，分泌的蛋白质降解所述木质纤维素类生物质。
135.根据权利要求134所述的方法，其特征在于，所述糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维 糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。
136.根据权利要求134所述的方法，其特征在于，所述糖类为纤维二糖。
137.根据权利要求131-136中任何一项所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白质为纤维素诱导蛋白。
138.根据权利要求131-137中任何一项所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白质选自:纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。
139.根据权利要求131-137中任何一项所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白质为纤维素酶。
140.根据权利要求131-137中任何一项所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白质由选自以下的基因编码:NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和 NCU05137。
【文档编号】C12P21/00GK103890168SQ201280023229
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年3月15日 优先权日:2011年3月15日
【发明者】伊丽莎白·A.·兹纳米罗斯基, 詹姆斯·H.·多德纳-凯特, N.·路易斯·格拉斯 申请人:加利福尼亚大学董事会