用于培养来自正常人输卵管卵巢上皮和人输卵管卵巢肿瘤的细胞的组合物和方法

用于培养来自正常人输卵管卵巢上皮和人输卵管卵巢肿瘤的细胞的组合物和方法
【专利摘要】本申请中描述了细胞培养基、用于制备细胞培养基的试剂盒和方法、以及用于培养细胞例如雌性生殖道细胞和肿瘤细胞的方法。
【专利说明】用于培养来自正常人输卵管卵巢上皮和人输卵管卵巢肿瘤的细胞的组合物和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年3月24日提交的美国临时申请号61/467，363和2011年3月25日提交的美国临时申请号61/467，949的权益，所述文献的公开内容通过引用的方式完整并入本文。
【背景技术】
[0003]离体细胞系培养物已经大大促进人类疾病的研究和治疗。如今，许多疾病的机制性起源已经在培养的细胞系中表征，并且已经将细胞系用于筛选和制造治疗药。在癌症和女性生殖健康领域，已经通过培养来自女性生殖道的正常细胞和肿瘤细胞增强研究工作。然而，许多细胞类型证明难以使用可获得的培养基和现存技术培养。例如，用于培养正常卵巢细胞当前方法不能在卵巢细胞亚型(如带纤毛的与不带纤毛的细胞或卵巢表面上皮与包涵囊肿上皮)之间区分。此外，未曾离体培养已经被提示作为高等级乳头状浆液性腺癌的推定性细胞来源的输卵管上皮细胞。源自卵巢肿瘤的肿瘤细胞也证明难以在培养物中培育。尽管存在少数巢癌细胞系(Verschraegen CF等人，Clin CancerRes.2003Feb;9(2):845-52和美国专利号5，710，038)，这些细胞系就群体倍增信息、原始肿瘤组织的临床亚型、恶性来源验证或表型而言没有进行充分表征。因此，本领域中仍需要用于建立源自卵巢组织、输卵管细胞和肿瘤细胞的细胞系的细胞培养基、试剂盒和方法。
[0004]发明简述
[0005]本发明的一个方面涉及细胞培养基，或用于制备细胞培养基的试剂盒，其包含三磷酸腺苷；载体蛋白(例如，白蛋白，如牛血清白蛋白)；胆固醇、亚油酸和硫辛酸；谷胱甘肽；选自次黄嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤和胸苷(优选地，黄嘌呤和/或次黄嘌呤)的核苷酸补救途径前体碱基；磷脂酰乙醇胺；硒；转铁蛋白；三碘甲腺原氨酸；维生素A、维生素C和维生素D;Zn、Mg和Cu;增加胞内cAMP的试剂(优选地，霍乱毒素)；表皮生长因子(EGF);氢化可的松；胰岛素；和血清。这种细胞培养基也可以包含腺苷单磷酸、维生素E、维生素K3、烟酸和烟酰胺中的一种或多种。
[0006]在其中增加胞内cAMP的试剂是霍乱毒素的某些实施方案中，细胞培养基可以包含在10ng/ml和70ng/ml之间、优选地在15和30ng/ml之间，如在20ng/ml和25ng/ml之间的霍乱毒素。在某些优选的实施方案中，细胞培养基包含约20ng/mL的霍乱毒素。在其他优选实施方案中，细胞培养基包含约25ng/mL的霍乱毒素。
[0007]在某些实施方案中，细胞培养基包含在3ng/ml和50ng/ml之间的EGF，优选地约8_12ng/ml 如 10ng/ml 的 EGF。
[0008]在某些实施方案中，细胞培养基包含在0.005 μ g/mL和1.5 μ g/mL之间的氢化可的松和/或在1.0 μ g/mL和75.0 μ g/mL之间的胰岛素。 [0009]在某些实施方案中，细胞培养基包含在0.2%和4.0%ν/ν之间的血清。在某些实施方案中，细胞培养基包含在0.2%和10.0%ν/ν之间或在0.2%和5.0%ν/ν之间的血清。[0010]一些本发明的实施方案涉及一种细胞培养基，其适应于培养肿瘤细胞(如卵巢肿瘤细胞)并且包含在1.0%和10.0%ν/ν之间的血清、在1.0%和4.0%ν/ν之间的血清、优选地在1.8%v/v和2%v/v之间的血清、最优选地约1.8%v/V的血清。在一些此类实施方案中，细胞培养基包含在0.15 μ g/mL和0.3 μ g/mL之间的氢化可的松、优选地约0.15 μ g/mL的氢化可的松和/或在5.0 μ g/mL和50.0 μ g/mL之间的胰岛素、优选地约15.0 μ g/mL的胰岛素。适应于培养肿瘤细胞的示例性培养基是WIT-oc。
[0011]在适应于培养某些卵巢肿瘤细胞(如源自子宫内膜样肿瘤和粘液性肿瘤的那些)的这类实施方案中，细胞培养基还包含雌激素，例如以等同效力在30nM和300nM之间17-β-雌二醇、优选地等同效力约100ηΜ17-β-雌二醇的浓度包含雌激素(例如，17- β -雌二醇)。在其他实施方案中，如适应于培养某些卵巢肿瘤细胞如肿瘤细胞源自乳头状浆液性肿瘤、透明细胞肿瘤、癌肉瘤和无性细胞瘤的那些，细胞培养基基本上不含雌激素。示例性培养基WIT-oc可以包含括雌激素或可以基本上不含雌激素，这取决于其中待培养的细胞类型。
[0012]适应于培养肿瘤细胞如卵巢肿瘤细胞的WIT-oc和细胞培养基可以支持卵巢肿瘤细胞体外增殖至少约14、25或甚至35次群体倍增(PD)。
[0013]在适应于培养正常卵巢细胞和输卵管细胞的另外的其他实施方案中，细胞培养基包含在0.25%和0.75%ν/ν之间的血清，优选地约0.5%ν/ν的血清。在这种细胞培养基中，氢化可的松的浓度优选地在0.25 μ g/mL和0.50 μ g/mL之间，例如，约0.5 μ g/mL的氢化可的松，和/或在5.0 μ g/mL和50.0 μ g/mL之间的、优选地约20.00 μ g/mL的胰岛素。适应于培养正常卵巢细胞和输卵管细胞如上皮细胞的示例性培养基是WIT-fo。
[0014]适应于培养正常卵巢细胞和输卵管细胞的WIT-fo和细胞培养基可以支持卵巢细胞和/或输卵管细胞体外增殖 至少约14、25或甚至35次群体倍增(PD)。在一些实施方案中，卵巢细胞和/或输卵管细胞是永生化细胞。永生化细胞可以过量表达端粒酶(例如人端粒酶逆转录酶(hTERT))的催化性亚基。本发明的一个方面是一种培养物，所述培养物包含其中hTERT已经过量表达的细胞，其中hTERT的过量表达足以使得所述细胞能够进行至少14、25或35次群体倍增。在某些实施方案中，该培养物是基本上纯化的细胞培养物。
[0015]本发明的一个方面涉及基本上纯化的卵巢细胞培养物，其中所述卵巢细胞过量表达探针集合D0K5、CD47、HS6ST3、DPP6、0SBLP3 ;其中所述培养物包含至少IO3个细胞；并且所述细胞能够发生至少14、25或35次群体倍增。类似地，一个方面涉及基本上纯化的输卵管细胞培养物，其中所述卵巢细胞过量表达探针集合STC2、SFRPU SLC35F3、SHMT2、TMEM164 ;其中所述培养物包含至少IO3个细胞；并且所述细胞能够进行至少14、25或35次群体倍增。本发明的另一个方面涉及用于制备本文所述的细胞培养基的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒可以包含一个或多个第一容器，所述第一容器包含三磷酸腺苷；载体蛋白；胆固醇、亚油酸和硫辛酸；谷胱甘肽；选自次黄嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤和胸苷的核苷酸补救途径前体碱基；磷脂酰乙醇胺；硒；转铁蛋白；三碘甲腺原氨酸；维生素A、维生素C和维生素D ;Zn、Mg和Cu ;和一个或多个第二容器，所述第二容器包含增加胞内cAMP的试剂；表皮生长因子(EGF);氢化可的松；胰岛素；和血清；以及任选地雌激素，从而以适宜的比例混合第一容器和第二容器的内容物(或第一容器和第二组容器)产生细胞培养基，例如，如本文以多种方式所定义。在一些实施方案中，这种试剂盒可以支持细胞体外增殖至少14、25或甚至至少35次群体倍增(PD)。
[0016]本发明的又一个方面是细胞培养基补充物，其中所述补充物以这样的相对浓度包含增加胞内cAMP的试剂；表皮生长因子(EGF);氢化可的松；胰岛素；血清；和任选地，雌激素，从而向基础细胞培养基添加适宜比例的补充物产生本文所述的细胞培养基。例如，向细胞培养基添加补充物可以产生0-70ng/ml增加胞内cAMP的试剂，至少3ng/ml的EGF、0.015-0.5 μ g/mL的氢化可的松；至少10.00 μ g/mL的胰岛素，0.2%_4.0%ν/ν的血清补充物，以及任选地，30-300nM的雌激素，例如，如本文多样描述。
[0017]本发明的又一个方面涉及制备本文所述的细胞培养基的方法。在一些实施方式中，所述方法包括混合三磷酸腺苷；载体蛋白；胆固醇、亚油酸和硫辛酸；谷胱甘肽；选自次黄嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤和胸苷的核苷酸补救途径前体碱基；磷脂酰乙醇胺；硒；转铁蛋白；三碘甲腺原氨酸；维生素A、维生素C和维生素D ;Zn、Mg和Cu ;增加胞内cAMP的试剂；表皮生长因子(EGF);氢化可的松；胰岛素；和血清；以及任选地雌激素，从而以适宜的比例混合内容物产生了如本文多样描述的细胞培养基。在一些实施方案中，从一个或多个第一容器添加一种或多种成分(例如，前11种成分，三磷酸腺苷；载体蛋白；胆固醇、亚油酸和硫辛酸；谷胱甘肽；选自次黄嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤和胸苷；磷脂酰乙醇胺的核苷酸补救途径前体碱基；硒；转铁蛋白；三碘甲腺原氨酸；维生素A、维生素C和维生素D ;Zn、Mg和Cu),并且从一个或多个第二容器添加一种或多种额外成分,例如,后5种成分和任选地雌激素。
[0018]本发明的又一个方面是一种用于培养卵巢上皮细胞和输卵管上皮细胞的方法。这种方法包括从卵巢的或输卵管获得卵巢上皮细胞和输卵管上皮细胞；并且在本文所述的细胞培养基中培养细胞，其中所述卵巢上皮细胞和输卵管上皮细胞可以在细胞培养基中进行至少14、25或甚至35次群体倍增。所述细胞可以是卵巢上皮细胞，如源自卵巢表面的那些。所述细胞可以是输卵管上皮细胞，如源自输卵管缨饰表面的那些。
[0019]类似地，本发明的一个方面涉及一种用于培养肿瘤细胞的方法。这种方法包括获得肿瘤细胞；在如本文所述并由WIT-oc例举的适应于培养肿瘤细胞的细胞培养基中培养肿瘤细胞，其中增加胞内cAMP的试剂是霍乱毒素，并且该细胞培养基包含25ng/ml的霍乱毒素、10ng/ml的表皮生长因子(EGF)、0.15 μ g/mL的氢化可的松；15.00 μ g/mL的胰岛素；和1.8%的血清补充物(和优选地基本上不含雌激素)，并且其中所述肿瘤细胞可以在该细胞培养基中进行至少14、25或甚至35次群体倍增。在一些实施方案中，该方法还包括对于前1-5代细胞用胰蛋白酶处理培养平板，因而富集癌细胞。在其他实施方案中，肿瘤细胞是卵巢癌细胞、人乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、腺样囊性癌细胞和/或来自肺或胃肠道的神经内分泌肿瘤(类癌)细胞。例如，肿瘤细胞可以是卵巢癌细胞。这些卵巢癌细胞可以从患者的原代实体卵巢组织或腹水获得，或从动物模型中培育的肿瘤异体移植物获得。在其他实施方案中，肿瘤细胞是乳头状浆液性肿瘤细胞、透明细胞肿瘤细胞、癌肉瘤细胞或无性细胞瘤细胞。在其他实施方案中，例如，为了培养子宫内膜样肿瘤细胞或粘液性肿瘤细胞，细胞培养基还可以包含IOOnM的17-β-雌二醇或等效力量的另一种雌激素。
[0020]本发明的一个额外方面涉及鉴定候选治疗药的方法，所述方法包括培养细胞(即，源自原发性肿瘤，如作为乳头状浆液性肿瘤、透明细胞肿瘤、癌肉瘤、无性细胞瘤、子宫内膜样肿瘤或粘液性肿瘤中至少一种的卵巢肿瘤的细胞)；使细胞与药物接触；并测量细胞的生理学；其中调节所述细胞的生理学的药物是候选治疗药。在一些实施方案中，该方法还包含在使细胞与药物接触之前在试验动物中培育所述细胞。
[0021]附图简述
[0022]图1显示卵巢和输卵管的解剖学。图1A和IB图显示其中产生卵母细胞(卵细胞)的雌性生殖器官-卵巢。卵巢借助韧带与子宫连接并且靠近输卵管的伞端。图1C显示在薄上皮中覆盖的卵巢表面。在排卵期间，卵母细胞突破卵巢表面并释放至输卵管的伞端中。在接下来7天期间，卵母细胞沿输卵管上行至子宫的子宫内膜腔中。图1D显示排卵部位在正常情况下修复，但是有时以上皮内衬的小包涵囊肿留在卵巢表面下。这些图改编自 Baba Al, Catol C., Comparative Oncology.Bucharest:The Publishing House ofthe Romanian Academy; 2007和互联网上国际癌症研究所关于治疗卵巢上皮癌的网站www.cancer, gov/cancertopics/ovarianepitheIial。
[0023]图2显示在WIT-fo培养基中正常卵巢上皮细胞和输卵管上皮细胞的长期培养物的结果。图2A显示输卵管上皮(FTE)细胞在WIT-fo培养基中(?蓝色曲线)或在对照培养基中(红色曲线)的生长。作为对照培养基，使用Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)和Ham F12的1:1混合物，其补充有5%血清。在WIT-fo培养基中，FTE细胞在其增殖速率不下降的情况下连续分裂至少120天并且实现24次群体倍增(籲蓝色曲线)。相比之下，来自相同供体的匹配细胞在对照培养基(红色曲线)中在14天内生长停滞。图2B显示卵巢上皮(OSE)细胞在WIT-fo培养基中(籲蓝色曲线)或在对照培养基中(红色曲线)的生长。作为对照培养基，使用含10%胎牛血清、2mm L-谷氨酰胺和10ng/ml表皮生长因子的MCDB105/培养基199的1:1混合物。在WIT-fo培养基中，OSE细胞在其增殖速率不下降的情况下连续分裂至少40天并且实现15次群体倍增(?蓝色曲线)。相比之下，来自相同供体的匹配细胞在对照培养基(红色曲线)中生长停滞数周并且从未实现3次群体倍+?
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[0024]图3显示PAX8、CK7和F0XJ1鉴定正常人卵巢的和输卵管上皮中的特定细胞亚型。图3A-3D显示正常人卵巢组织；采用PAX8的福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)切片的免疫过氧化物酶染色。审查来自不同患者的许多样品表明，大部分卵巢包涵囊肿衬有PAX8+上皮(A和B中的棕色核染色)。相比之下，卵巢表面上皮几乎总是PAX8阴性(A、C)，伴随也可以呈PAX8阴性的偶尔包涵囊肿上皮(D)。图3E显示正常人输卵管组织；FFPE切片的双重免疫过氧化物酶染色。带纤毛的细胞为F0XJ1+(胞核棕色)并且不带纤毛的细胞为PAX8+(胞核红色)。图3F显示正常人输卵管组织；FFPE切片的双重免疫过氧化物酶染色。带纤毛的细胞为F0XJ1+ (胞核棕色)，并且不带纤毛的细胞为角蛋白7+ (胞质红色)。通过依次F0XJ1-HRP (棕色)染色，随后PAX8/CK7碱性磷酸酶(红色)染色进行双重免疫染色(E，F)(比例尺=20 μ M)。图3G显示培养的细胞系显示出与卵巢胞囊上皮(OSE)和不带纤毛的输卵管上皮(FNE) —致的免疫谱。
[0025]图4显示正常卵巢包涵囊肿(OC)和输卵管不带纤毛的上皮(FN)细胞在WIT-fo培养基中仅存在hTERT 情况时永生化。图4A显示表达hTERT-gfp的OC细胞，活细胞成像(比例尺=50 μ M)。图4Β显示表达hTERT-gfp的FN细胞，活细胞成像(比例尺=50 μ Μ)。图4C显示荧光细胞辅助分选(FACS)，其中与亲本卵巢上皮细胞(黑色曲线)相比，几乎全部培养细胞为gfp阳性(红色和蓝色曲线)。图4D显示了表达hTERT (OCE)的卵巢包涵囊肿上皮细胞，所述上皮细胞在WIT-f0培养基(?蓝色曲线)中或在对照培养基(含有10%胎牛血清、2mmL-谷氨酰胺和10ng/ml表皮生长因子的MCDB105/培养基199 (1:1混合物))( 红色曲线)中培育。在WIT-O培养基中，OCE细胞在其增殖速率不下降的情况下连续分裂至少150天并且实现70次群体倍增(蓝色线)。相比之下，来自相同供体的匹配细胞在对照培养基 红色曲线)中在数天内生长停滞。图4E显示了表达hTERT (FNE)的不带纤毛的输卵管上皮细胞，所述上皮细胞在WIT-fo培养基中或在对照培养基(Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)和Ham F12的1:1混合物，其补充有0.1%BSA、5%血清)( 红色曲线)中培育。在WIT-fo培养基中，FNE细胞在其增殖速率不下降的情况下连续分裂至少150天并且实现40次群体倍增(?蓝色曲线)。相比之下，来自相同供体的匹配细胞在对照培养基( 红色曲线)中在数天内生长停滞。
[0026]图5显示正常人卵巢(OCE)细胞和输卵管(FNE)细胞的致肿瘤转化。图5A显示从相同供体分离并且在步骤I中用单独hTERT而永生化，分别产生OCEl和FNEl细胞的OC和FN细胞。将这些细胞在步骤2中用SV40T/t (SV40ER)并在步骤3中用突变体H_RasV12转化成致瘤细胞，产生致肿瘤卵巢上皮细胞(0CLER1)和致肿瘤输卵管上皮细胞(FNLERl)。这些实验用来自第二供体的细胞重复，产生0CLER2和FNLER2细胞。图5B是蛋白质免疫印迹，其与仅表达hTERT的OCE和FNE细胞中负染色相比，显示在0CLER1/FNLER1对子(供体I)和0CLER2/FNLER2对子(供体2)中SV40LT和H-Ras蛋白的表达。图5C显示免疫荧光法图像，其表明3￥40大了48(1^，胞核绿色)和H-Ras (Ras，胞质绿色)蛋白在OCLER和FNLER细胞中相似表达。DAPI核染色；40X放大率，比例尺=50 μ M0 OCLER和FNLER细胞中的大TAg(LT，胞核绿色)和H-Ras (Ras，胞质绿色)蛋白表达。DAPI核染色；40 X放大率，比例尺=50 μ Mo
[0027]图6显示免疫受损的裸鼠中的OCLER和FNLER肿瘤组织病理学。图6Α和6Β显示来自卵巢OCLER (a)和输卵管FNLER (b)肿瘤异体移植物的代表性肿瘤切片的苏木精和伊红(H&E)染色。两种肿瘤均优势地为高等级并且不良分化，然而，存在提示乳头状浆液性腺癌的局灶性罕见微乳头状结构。图6C和6D显示来自OCLER(A)和FNLER(B)异体移植物的代表性FFPE肿瘤切片的PAX8免疫过氧化物酶染色证实这些肿瘤的OC和FN来源。组织学切片从福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的肿瘤组织制备，其中将所述肿瘤组织在腹内和皮下注射细胞后5至9周外植(比例尺=20 μ Μ)。
[0028]图7显示FNLER肿瘤比OCLER肿瘤转移性更强。图7Α和7Β显示福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的异体移植肿瘤的苏木精和伊红染色，其显示FNLER(a)和OCLER(b)侵入小鼠胰。(比例尺=250 μ M)。图7C显示在荧光解剖显微镜上起初作为GFP阳性肿瘤结节观察到的FNLER肿瘤从腹内或皮下注射部位转移至小鼠肺(比例尺=250 μ Μ)。图7D和7Ε显示通过Η&Ε在FFPE小鼠肺中鉴定的转移性FNLER细胞(d)以及SV40LT阳性(e)和P53阳性(f)的染色细胞。(比例尺=50 μ M)。图7G显示肺转移频率，与OCLER肿瘤相比，该频率对于FNLER肿瘤是显著较高的(Ρ〈0.05,双尾Mann-Whitney检验)。在总肿瘤负荷>0.5g的小鼠当中，在体内孵育肿瘤5-9周后比较OCLER和FNLER之间从腹内和皮下注射部位转移至肺的频率。在FNLER和OCLER之间不存在肿瘤负荷或孵育时间的显著差异。
[0029]图8表示OCE和FNE细胞的基因表达特征标识鉴定了人卵巢腺癌组织中的卵巢样和输卵管样基因表达模式。在两个独立的卵巢癌数据集中验证10个最显著的卵巢/输卵管细胞源基因。图8A显示Wu数据集中每个基因和临床变量之间的关联(8个基因因阵列平台差异而存在于Wu数据集中)。系数>0或〈O分别表示具有更高等级、分期或浆液性亚型的每个基因的上调或下调。来自线性对数回归(等级和分期作为有序变量)的P-值相对于假发现率进行修正。图8B中的密度曲线显示Wu肿瘤样品中OV/FT样评分的或多或少的双峰分布，这支持划分成OV样肿瘤簇和FT样肿瘤簇。图SC显示Wu数据中具有临床特征的OV样亚组和FT样亚组的关联(来自对数回归的P-值(等级、分期作为有序变量)和Fisher精确检验(组织学亚型)。图8D中的密度曲线显示Tothill数据中0V/FT样评分的轻微左偏移，这表明OV样肿瘤的小亚群(箭头)。图SE显示Tothill数据中具有临床特征的OV样亚组和FT样亚组的关联(p-值如(C)中计算)。图8F显示,Kap I an-Meier曲线展示了 Tothill数据中OV样亚组和FT样亚组之间存活的显著差异(Cox比例风险P-值相对于肿瘤等级、分期和组织学亚型进行调节)。
[0030]图9显示，转化细胞样特征标识(TCS)和永生化细胞样特征标识(ICS)鉴定具有不同结局的人卵巢腺癌。图9A显示,KapIan-Meier生存曲线显示带有TSC+表达特征标识(红线)的人卵巢癌比带有ICS+特征标识(蓝线)的人卵巢癌具有显著更好的总生存期(p=0.046)。如预期，Limma模型(包括FDR多种检验校正)鉴定到以p〈0.05显著性水平差异性表达的许多探针(n=17，641)。相对于细胞系中的正常比较结果，我们从肿瘤选择1，000个最高度显著的探针，并且直接应用这种基因特征标识以便使用一致性k均值聚类法来鉴定“肿瘤样”样品和“正常样”样品的(k=2)聚类，在相同的两个独立数据集(Tothill)中对卵巢肿瘤分类。在Tothill数据集内136个浆液性高等级(G3)、晚期(FIG0SIII/IV)肿瘤当中，鉴定到分别包括51份和85份样品的具有高聚类稳定性的两个聚类(聚类一致性=0.89和0.94)。图9B显示通过k均值聚类法，将Tothill数据集中的51份样品鉴定为表达“转化的细胞特征标识” (TSC)，并且将85份样品鉴定为具有永生化细胞特征标识(ICS)。从我们划归为TCS的51个病例中，仅3个病例由Tothill划归为不良预后(Cl)，并且46/85ISC肿瘤由Tothill划归为不良预后(Cl)。
[0031]图10显示卵巢肿瘤在新开发的WIT-OC培养基对常规细胞培养基中的培养。在图1OA中，将原发性卵巢乳头状浆液性癌组织(OC1-Ula)铺种至WIT-oc (?蓝色曲线)或含10%血清的MCDB-105/M199( Λ绿色曲线)或含10%血清的RPMI1640 ( 红色曲线)中。将细胞每周计数并传代至新瓶中。在?周后，MCDB-105/M199和RPM1-1640培养基中的几乎全部细胞被杀死(绿线和红线)。相比之下，在WIT-oc中的细胞以恒定速率生长并且当实验停止时，实现至少30次群体倍增。一个克隆在约第90日出现在RPM1-1640中(红线)并且被确立为永久细胞系。在图1OB中，在WIT-oc和RPMI中培育的OC1-Ula肿瘤细胞的基因组DNA与原始肿瘤借助比较基因组杂交(CGH)阵列分析进行比较。全基因组CGH迹线揭示出与未培养的肿瘤样品(中部迹线)相比，在RPMI中培育的肿瘤细胞中获得(扩增，红色箭头)和失去(缺失，绿色箭头)的几个峰。相比之下，在WIT-oc中培育的肿瘤细胞的CGH样式与未培养的肿瘤(分别地是底部和中部CGH迹线)显著更相似。在图1OC中，将卵巢透明细胞癌细胞(0C1-5CX)在WIT-oc培养基(?蓝色曲线)中培育至少60次群体倍增。在对照培养基(含10%血清的DME:F12)中，细胞生长停滞并且在30-40日内死亡 红色曲线)。
[0032]图11显示输卵管卵巢肿瘤细胞系(OCI)不能在ATCC/ECACC推荐的标准卵巢肿瘤细胞培养基中培养。图1IA显示在WIT-OC培养基对补充有15%血清的McCoy’ s5A、MCDB105/M199或RPM1-1640培养基中铺种的相等数目的OCI系(706、29和4)。细胞在培养5天后计数。OCI细胞系在这些标准培养基中迅速致死并且不可能进行培养。图1lB显示在WIT-oc培养基对补充有15%血清的McCoy’ s5A、MCDB105/M199或RPM1-1640培养基中铺种的相等数目的ATCC/ECACC卵巢癌细胞系(SK0V-3、0V-90和A2780)。细胞在培养5天后计数。全部ATCC/ECACC卵巢癌细胞系均在WIT-oc培养基以及它们的推荐培养基中增殖。A2780细胞在WIT-oc中比推荐的标准培养基中增殖得更好。
[0033]图12显示了概括原始肿瘤的OCI异体移植物的组织病理学。福尔马林固定石蜡包埋的原发性肿瘤和异体移植肿瘤组织切片用苏木精和伊红染色。图12A显示ECACC卵巢癌细胞系SK0V3的肿瘤异体移植物切片。图12B显示ATCC卵巢癌细胞系0V90的肿瘤异体移植物切片。不存在源自ATCC系的异体移植肿瘤(A-B)的特定构造。不存在人腺癌的常见特征如腺体、乳突、间质芯、黏蛋白或激素受体表达、促结缔组织增生性基质。这些肿瘤几乎完全由肿瘤细胞片组成并且具有与组织培养中的细胞相似的外观。图12C显示源自人乳头状浆液性腺癌(PSC)的0C1-P9a系的肿瘤异体移植物切片。注意间质芯和乳头状构造的清晰存在。图12D显示源自人子宫内膜样腺癌的OC1-Elp系的肿瘤异体移植物切片。注意腺体的清晰存在。插图:免疫组织化学证实在这些异体移植肿瘤中与子宫内膜样表型一致的雌激素受体和黏蛋白表达。图12E显示0C1-P9a源自其中的人PSC肿瘤组织的原始肿瘤切片。注意间质芯和乳头状构造。图12F显示OC1-Elp系源自其中的人子宫内膜样腺癌组织的原始肿瘤切片。
[0034]图13显示采用SNP阵列分析的OCI系对原始肿瘤组织的比较。来自12种原发性未培养肿瘤(T，黑色)和在WIT-oc培养基中源自这些肿瘤的12个连续输卵管卵巢细胞系(0CI，红色)以及9个ATCC/ECACC系(蓝色)的基因组DNA杂交至25OAffymetrix SNP阵列，并且用Genechip分析 结果。蓝色=拷贝数改变或杂合性丧失，黄色=DNA改变不可检。注意在这个非监督层次聚类分析中，每个OCI细胞系聚类相邻于其未培养的亲本原发性肿瘤样品。因此，将每个细胞系正确地鉴定为最相似于其亲本的原始肿瘤组织。与ATCC/ECACC卵巢癌细胞系相比，OCI系中的绝大部分改变涉及显著较短的染色体区段。尽管OC1-Ulp和0C1-P3a具有巨大的区段改变，但是这似乎是衍生它们的原始肿瘤的特征并且不是细胞培养人为假象的结果(分别地是TUl和TP3)。
[0035]图14显示OCI系的基因表达谱概括了培养下的人卵巢腺癌的临床亚组。用Affymetrix U133Plus芯片测量OCI系、正常卵巢-输卵管细胞和ATCC/ECACC卵巢癌系的mRNA表达水平的非监督层次聚类(红色=高表达，蓝色=表达)。注意正常卵巢细胞和输卵管细胞(蓝色比例尺)、源自乳头状浆液性(红色比例尺)肿瘤和透明细胞(绿色)肿瘤的OCI系形成不同的聚类。ATCC/ECACC卵巢癌细胞系形成与其他OCI系分离的不同聚类(黑色)，例外是几种透明细胞OCI系(粉红色)。
[0036]图15显示OCI系的蛋白质组图谱概括了培养下的人卵巢腺癌的临床亚组。实施OCI系的反相蛋白质验定(RPPA)分，检查>200个蛋白质的表达。RPPA是一种高通量和定量性蛋白质组技术，它允许同时定量分析数百种蛋白质的差异性表达。通过将来自细胞的蛋白质提取物的连续稀释物以阵列方式印刷在载玻片或膜上并用单一抗体探测该阵列，实施这些测定法。将抗体对阵列上每个点的特异性结合定量和作图。OCI系的RPPA分析揭示，从不同肿瘤类型建立的细胞系形成单独的聚类，类似于mRNA表达谱。这些结果表明，培养的细胞必须在培养时保留显著水平的细胞生物学信息，所述细胞生物学信息允许它们的分子特征被识别为正常卵巢细胞和输卵管细胞(蓝色比例尺)、透明细胞肿瘤(绿色比例尺)、子宫内膜样肿瘤(粉红色比例尺)和乳头状浆液性肿瘤(红色比例尺)。一些OCI系不与其自身的组织型聚类；这可能反映迄今未认识的分子亚型或这些主要组织型的变体。由于这个数据集中仅存在一个示例粘液癌、癌肉瘤和缪勒氏管癌(黄色)，不能评估这些细胞类型根据肿瘤来源聚类的能力。这些实验重复3次，结果相似。
[0037]图16显示与ATCC/ECACC系相比，OCI系中显著差异的药物反应。图16A显示在96孔平板中的WIT-oc培养基(5000个细胞/孔)中一式三份铺种的ATCC/ECACC卵巢肿瘤系(SK0V3、0V90、T0V-1120 和 A2780)和 OCI 卵巢肿瘤系(C5x、P9al、P7a 和 FC1-Plp)。次日，将MAPK抑制剂U0126的连续稀释物添加至该平板。与药物孵育144小时后，用阿尔玛蓝测定法将活细胞数度量为590/530荧光。在MAPK抑制剂对OCI细胞系与ATCC/ECACC细胞系的影响方面存在显著差异。如预期，在OCI中减少细胞目50% (LD5tl)的U0126浓度对于大部分ATCC/ECACC细胞是大约5uM。然而，令人惊讶地大部分OCI系至少5_6时倍地抵抗MAPK抑制作用(LD5Q>30uM)。图16B显示在平板中的WIT-oc培养基(5000个细胞/孔)中一式三份铺种的OCI卵巢肿瘤系(P7a、P2a、C2p)和ATCC/ECACC卵巢肿瘤系(ES2和0V90)。次日，将紫杉醇的连 续稀释物添加至该平板。与药物孵育72小时后，用阿尔玛蓝测定法将活细胞度量为590/530荧光。图16C显示在平板中的WIT-oc培养基(5000个细胞/孔)中一式三份铺种的OCI卵巢肿瘤系(P7a、P2a、C2p)和ATCC/ECACC卵巢肿瘤系(ES2和0V90)。次日，将顺钼的连续稀释物添加至该平板。与药物孵育72小时后，用阿尔玛蓝测定法将活细胞度量为590/530荧光。在紫杉醇或顺钼对OCI细胞系与ATCC/ECACC细胞系的影响方面存在明显差异。与ATCCC/ECACC系相比，这些药物的导致肿瘤细胞数目下降50%的浓度(LD90)在OCI系中高出超过6倍。
[0038]图17是OCI和ATCC/ECACC卵巢肿瘤细胞系基因表达与人卵巢肿瘤的比较。图17A显示37种细胞和285种人组织的基因表达数据的层次聚类。选择至少4种细胞中表达水平相对于组织之间的中位数值具有至少2倍差异的基因用于层次聚类分析(3，831个基因特征)。数据以其中列代表各个基因并且行代表每种组织的矩阵格式展示。矩阵中的每个小室代表个体组织中基因特征的表达水平。小室中的红色和绿色分别反映相对高和低的表达水平，如以比例尺指示(对数2转换比例尺)。紫色比例尺=人肿瘤样品，红色比例尺为OCI肿瘤系，蓝色比例尺为ATCC卵巢肿瘤系+与ATCC系共聚类的OCI系。图17B显示小图a中人卵巢肿瘤的临床总生存期分析数据。具有类似于OCI系的基因表达谱的人肿瘤拥有比具有类似于ATCC系的基因表达谱的人肿瘤更差的结局。
[0039]图18显示已经在WIT-oc培养基中成功培育的其他肿瘤类型的几种例子。在图18A-18B中，是已经从乳腺的人浸润性导管癌的两个不同样品中建立的肿瘤细胞系的显微镜图像。在图18C-18D中，是已经从头颈肿瘤腺样囊性癌的两个不同样品中建立的肿瘤细胞系的显微镜图像。在图18E-18F中，是已经从肺的人神经内分泌肿瘤(类癌)的两个不同样品中建立的肿瘤细胞系的显微镜图像。
[0040]详细说明
[0041]1.细胞培养物[0042]A.培养基的组成
[0043]本发明涉及支持原代细胞(包括卵巢上皮细胞和输卵管上皮细胞)和肿瘤细胞(包括卵巢肿瘤细胞)体外长期生长和增殖的细胞培养基。短语“细胞培养基”、“培养基”(复数形式“多种培养基”在每种情况下)和“培养基制剂”指用于培育细胞的营养溶液并且可以互换地使用。
[0044]在本文所述的培养基中培养的细胞可以在不丧失分化潜能的情况下在这种培养基中生长至少4周(或15次群体倍增)，至多到几个月。在一个实施方案中，主题培养基支持卵巢上皮细胞和输卵管上皮细胞和/或已经用端粒酶转染的卵巢细胞和输卵管细胞在体外长期生长和增殖至少约15周或至少约35次群体倍增(ro)，而没有任何额外的可检测的遗传改变，或丧失分化潜能。在另一个实施方案中，主题培养基支持这些细胞在培养下生长和增殖至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15周或更长时间。类似地，主题培养基可以支持源自人肿瘤组织、源自恶性体液内肿瘤细胞的原代细胞系和/或在动物模型中体外培育至少约15周或至少约14、25或甚至35次群体倍增(PD)的肿瘤的原代异体移植物生长，而没有任何额外的可检测的遗传改变或者丧失其表型(形态学、结构和/或分子等表型)和/或组织病理学。在另一个实施方案中，主题培养基支持这些细胞在培养下生长和增殖至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 周或更长时间。
[0045]本发明的细胞培养基是水基的(还可以从干燥粉末和/或冷冻的组分复水)，包含在水、液体和/或水溶液中的许多成分。
[0046]术语“成分”指可以在细胞培养基中用来维持或促进细胞生长或增殖的任何化合物，无论是化学来源或生物学来源。术语“组分”、“养分”和“成分”可以互换使用并且均意指这类化合物。细胞培养 基中使用的常见成分包括氨基酸、盐、金属、糖、脂类、核酸、激素、维生素、脂肪酸、蛋白质等。促进或维持离体培养细胞的其他成分可以由本领域技术人员根据具体需要选择。
[0047]“细胞培养”或“培养”意指在人工、体外环境中细胞的维持。然而，应当理解，术语“细胞培养”是一个类属术语并且可以用来不仅包括培养单个细胞，还包括培养组织、器官、器官系统或完整器官，就此而言，术语“组织培养”、“器官培养”、“器官系统培养”或“器官培养”可以偶尔与术语“细胞培养”互换地使用。
[0048]在一些实施方案中，培养基基本上不含一种或多种指定的组分。在某些实施方案中，“基本上不含”指组分的对细胞生长和/或分化状态不产生统计显著影响的低量。在一些实施方案中，“基本上不含”指小于1%、0.1%、0.01%、0.001%或0.0001%v/v的液体或w/
V的溶质。在一些实施方案中、“基本上不含”指小于0.001,0.0001,0.00001,0.000001或
0.0000001mg/L的浓度。在一些实施方案中，“基本上不含”指小于10nM、InM、100pM、IOpM或IpM的浓度。
[0049]在本发明的一个方面、主题细胞培养基包含:(I) 一种或多种抗氧化剂；(2) —种或多种核苷酸补救途径合成前体；(3) —种或多种脂质合成前体；(4) 一种或多种蛋白质合成前体；(5) —种或多种糖合成和能量代谢前体；(6) —种或多种缓冲液(非必需)；(7) —种或多种阳离子(一价和/或二价)、离子、微量金属和酶辅因子；(8) —种或多种载体蛋白(如牛血清白蛋白)；(9) 一种或多种去垢剂(如Tween80) ； (10) 一种或多种诱导胞内3’_5’环状腺苷单磷酸(cAMP)水平增加的试剂；(11) 一种或多种激素和生长因子和/或(12)血清。在其他实施方案中，一种或多种上文所列的组分可以省略，条件是所产生的培养基支持细胞s如正常卵巢细胞和输卵管细胞和/或肿瘤细胞如卵巢肿瘤细胞体外生长和/或增殖至少约4周或至少约15、25或甚至35次群体倍增(PD)。
[0050]因此，本发明的培养基包含一种或多种抗氧化剂；核苷酸合成和补救途径前体；脂质合成前体；胞内cAMP水平激动剂；激素和生长因子；和血清。该培养基可以额外地包含其他组分如氨基酸补充物、细胞生长/增殖必需的维生素、微量矿物质、无机盐、能量源(例如用于糖酵解)和其他组分如PH指示剂等。换而言之、本发明的成分可以包括氨基酸、维生素、无机盐、腺嘌呤、D-葡萄糖、N-[2-羟乙基]哌嗪-N’ -[2-乙磺酸](HEPES)、氢化可的松、胰岛素、硫辛酸、酚红、磷脂酰乙醇胺、腐胺、丙酮酸钠、三碘甲腺原氨酸(T3)胸苷和转铁蛋白。这些成分的每一种可以商业地获得，例如从Sigma(SaintLouis, MO)获得。
[0051]尽管不希望受任何具体理论约束，但是抗氧化剂通常有助于猝灭据信总体上有损于细胞生长的自由基。本发明的抗氧化剂可以包括而不限于以下一种或多种:胡萝卜素、维生素Ε、维生素C(抗坏血酸)、维生素Κ3、谷胱甘肽(还原型)、烟酸(或烟酰胺)或DTT (二硫苏糖醇)。抗氧化剂可以任选地补充有微量金属，包括Zn、Se、Cr、Cu、Mg或Mn。
[0052]在此，不希望受理论约束，微量矿物质可能对于某些酶的构造必需的。例如，谷胱甘肽过氧化物酶使用硒并且谷胱甘肽超氧化物酶使用铜作为辅因子。推测在其中存在大自由基载量的疾病中，可能在特定的微环境存在这些微量元素的不足。微量矿物质的存在可以有益于酶性抗氧化剂(它可能已经缺少辅因子)。因此，微量矿物质的存在可以允许宿主有效利用酶性抗氧化剂。由于已知锌可以上调超氧化物歧化酶并且硒可以上调谷胱甘肽过氧化物酶，在给定的微环境中增加微量矿物质将导致这种微环境中酶抗氧化剂的增加。酶性抗氧化剂的净增加和增加两亲抗氧化剂将进一步减少对组织或细胞的氧化性损伤，以及归因于自由基的其他有害作用。
[0053]因此，可能在本发明的培养基中有益的许多无机盐成分、阳离子、离子、微量金属和维生素包括钙盐(例如CaC`l2)、CuSO4' FeSO4' KC1、镁盐(例如、MgCl2)、乙酸钠、NaCl,NaHC03> Na2HPO4, Na2SO4和微量元素硒和锌的离子。任选地，额外的无机盐成分可以包括锰盐(例如，MnCl2)、硅、钥、钒、镍和锡。
[0054]这些微量元素可以按多种形式提供，优选地以盐形式如Na2SeOjP ZnSO或Na2SiO3、(NH4) 6Mo7024、NH4VO3、NiSO4、SnCl2，用于任选的盐。这些无机盐和微量元素可以商业地获得，例如从Sigma(SaintLouis, MO)获得。
[0055]可以在本发明的培养基中包含的维生素成分包括生物素、氯化胆碱、D-Ca++泛酸盐、叶酸、1-肌醇、烟酰胺、吡多醇、核黄素、硫胺素和维生素A和Β12。这些维生素可以商业地获得，例如从Sigma(SaintLouis, MO)获得。
[0056]蛋白质合成前体包括氨基酸成分。在一个实施方案中，可以在本发明的培养基中包含的氨基酸成包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺，甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。这些氨基酸可以商业地获得，例如从Sigma(SaintLouis, MO)获得。
[0057]可选地，在一些其他实施方案中，在本发明的培养基中仅包含必需氨基酸。某些细胞，如人细胞必须具有足够量的9种氨基酸以存活。这些所谓“必需氨基酸”不能从其他前体合成。然而，半胱氨酸可以部分地满足甲硫氨酸的需要(它们均含有硫)，并酪氨酸可以部分地替代苯丙氨酸。这类必需氨基酸包括:组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸(和/或半胱氨酸)、苯丙氨酸(和/或酪氨酸)、苏氨酸、色氨酸、和缬氨酸。在某些实施方案中，仅包含组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。
[0058]上述成分的一些或全部，在溶液中混合在一起时，可以形成“基础培养基”。向这种基础培养基添加其他组分，如至少一种核苷酸合成和/或补救途径前体(例如次黄嘌呤)、表皮生长因子(EGF)、至少一种增加胞内环状腺苷单磷酸(cAMP)水平的试剂和至少一种激素和至少一种蛋白质以配制本发明的完全培养基。这些后来添加的组分，如EGF和增加cAMP的试剂可以添加至新鲜配制的基础培养基，或它们可以作为母液预混，所述母液冷冻贮存，优选地在约-20°C至约-70°C，直至添加至基础培养基以配制出本发明的完全培养基。这种完全培养基可以在动物细胞培养基中的包含BPE或其他器官/腺体提取物以实现所需的细胞生长和增殖，或可以在动物细胞培养基中基本上不含BPE或其他器官/腺体提取物。也可以将这种预混物制备为1-1000 X制剂，最优选地制备为I X、100X、500 X或1000X制剂，所述制剂随后适当地稀释入培养基中以提供本发明的完全培养基中的IX最终制剂。
[0059]本发明的培养基也可以包含一种或多种激素，如:孕酮、睾酮、氢化可的松或雌激素，和/或一种或多种生长因子如:胰岛素和EGF (表皮生长因子)。[0060]例如，本发明的培养基可以包含EGF，其可以是天然或重组的，并且可以是人或啮齿类的。商业可获得的EGF (例如，从GIBCO/LTI，Gaithersburg，MD获得)根据本领域常规的方法学从天然来源分离或通过重组DNA技术产生的(美国专利号4，743，679)。为配制本发明的培养基，在优选的实施方案中，将EGF添加至培养基(如表3中所示的培养基)以达到约0.00001-10mg/L，优选地约0.0005-lmg/L的终浓度。
[0061]本发明的培养基也可以包括可在核苷酸的补救途径合成中使用的核苷酸类似物前体，如次黄嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤和胸苷。
[0062]本发明的培养基也可以包括脂质合成前体，如:胆固醇、亚油酸、硫辛酸或O-磷酰
基乙醇胺。
[0063]本发明的培养基也包含一种或多种cAMP激动剂或增加胞内cAMP水平的试剂。多种此类试剂可以用于配制本发明的培养基。包括诱导胞内cAMP水平直接增加的试剂(例如，二丁酰cAMP)、通过相互作用于细胞G-蛋白而造成胞内cAMP水平增加的试剂(例如，霍乱毒素和毛喉素)、通过作为β -肾上腺素能受体的激动剂发挥作用而造成胞内cAMP水平增加的试剂(例如，异丙肾上腺素)和通过抑制cAMP磷酸二酯酶的活性而造成胞内cAMP水平增加的试剂(例如，异丙基甲基黄嘌呤(IBMX)和茶碱)。最优选用于配制本发明培养基的是霍乱毒素。这些增加cAMP的试剂是商业可获得的，例如从Sigma (St.Louis, M0.)获得，并且以接近于 Green(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA15:801_811 (1978))中所述的浓度使用。例如，将霍乱毒素以约0-0.01mg/L、优选地约0-0.001mg/L和最优选地约0-0.0001mg/L的浓度添加至上文描述的基础培养基。可以添加二丁酰cAMP、IBMX、异丙肾上腺素等以实现与霍乱毒素相同的cAMP水平。
[0064]也合乎需要的是通过多种试剂如霍乱毒素、毛喉素、G蛋白偶联受体激动剂、PKC激动剂增加胞内cAMP水平。此外，细胞可以具有应答于激动剂异丙肾上腺素(Iso)、前列腺素E(2) (PGE(2))、某些前列腺素类受体激动剂(贝前列腺素、布他前列腺素)和腺苷受体激动剂而增加的cAMP。此外，6型AC的过量表达或抑制环状核苷酸磷酸二酯酶的试剂增加细胞cAMP水平。
[0065]主题培养基也可以包含一种或多种糖合成和能量代谢前体，如D-葡萄糖、丙酮酸纳等。
[0066]主题培养基也可以包含一种或多种载体蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)。载体蛋白可以是一种蛋白质，所述蛋白质转运特定物质穿过该蛋白质包埋于其中的细胞膜并进入细胞。可能要求不同的载体蛋白以转运不同的物质，因为将每种载体蛋白设计成识别仅一种物质，或成组的相似物质。某些载体蛋白可以与一种或多种培养基组分(如生长因子等)结合并且赋予它们在培养基中的额外稳定性，或促进某些生物学过程(例如酰基载体蛋白、固醇载体蛋白、激素载体蛋白等)。
[0067]主题培养基也可以包含一种或多种表面活性剂，如非离子表面活性剂TweeneO或TweenSO0再次，不希望受任何具体理论约束，这类去垢剂组分可以有助于润湿、增溶、乳化或分散某些培养基组分。例如，它们可以防止蛋白质如BSA的聚集、增加某些组分的溶解并且可以甚至增强某些酶的功能。
[0068]虽然不认为是必需的，但主题培养基可以额外地包含一种或多种缓冲体系，如HEPES和碳酸氢钠缓冲体系，从而在长期培养下维持平衡的pH。培养基的经常、恒定或连续变化也可以有助于恢复快速生长的细胞中的介质pH。
[0069]为了解释， 下表3显示本发明的三种培养基制剂的示例性组成，所述培养基制剂支持(I)源自乳头状浆液性肿瘤、透明细胞肿瘤、癌肉瘤或无性细胞瘤的卵巢肿瘤细胞系，
(2)源自子宫内膜样肿瘤或粘液性肿瘤的卵巢肿瘤细胞系，和(3)正常卵巢或输卵管细胞的长期生长和增殖。这些培养基支持这些细胞类型的体外生长和增殖至少约4周或至少约15次群体倍增(PD)，同时表型(形态学、结构和/或分子等表型)和/或组织病理学与衍生这些细胞的原始肿瘤不可区分。
[0070]成纤维细胞和其他间质细胞的百分比在几次传代和群体倍增剧烈下降，到不能检测到可察觉量的成纤维细胞和间质细胞分化标记(例如波形纤维蛋白)的程度。例如，上皮分化标记可以包括角蛋白8、角蛋白10、角蛋白14、角蛋白18、角蛋白19、E-f丐黏着蛋白、p63、SMA (平滑肌肌动蛋白)和β-联蛋白。
[0071]离体组织培养使细胞暴露于诱导ρ53和ρ16基因的氧化性损伤、代谢应激和DNA损伤，所述Ρ53和ρ16基因转而诱导细胞停滞、衰老和/或凋亡，限制培养细胞的寿命。在另一个实施方案中，本发明的培养基支持原代细胞的长期无应激生长和增殖。在主题培养基中的这类无应激生长的一种指标由低/不可检测的CDK抑制剂ρ16和肿瘤抑制基因ρ53表达水平指示。一般在应激的细胞中而不在组织培养培养基中健康生长的细胞中诱导这两种蛋白质以高水平表达。在这个实施方案中，细胞可以在37°C、5%C02和变动的O2浓度，例如，1%、2%、3%、或环境空气下培育。
[0072]在另一个实施方案中，本发明的培养基基本上不含选自以下的至少一种成员:肝素、成纤维细胞生长因子(FGF)和牛垂体提取物(ΒΡΕ)。在某些实施方案中，上文所列的组分均不存在于主题培养基中。
[0073]然而，主题培养基可以在某些实施方案中包含一种或多种这类组分和忍受其存在到这种程度，从而这类组分基本上不影响培养基在支持原代细胞生长和增殖方面性能。
[0074]本发明提供表3的培养基的实施方案，其中具有下限为O的浓度范围的任一种或多种组分不存在，和其中存在这类组分的实施方案。应当理解如表3中列出的本发明培养基是仅起到说明目的。虽然对于某些预期目的、尤其培养本文中与每种制剂相关的细胞类型，培养基本身是足够的，但是这些表中列出的全部组分并非均可以对其预期目的是必需或甚至是最佳的。部分地根据所讨论问题中对特定原代细胞的需要，技术人员可以通过以下方式容易地确定任何列出的组分是否为必需和/或最佳:例如消除一种组分或一次改变一种组分的浓度并且与原始培养基比较特定类型的培养细胞在这种修改的培养基中的生长/增殖。当需要时，一种或多种组分也可以由具有相似特性的其他化学品替换。不含一种或多种非必需/非必要组分的这类修改的培养处于本发明的范围内。类似地、技术人员也可以通过以下方式确定任何给定组分相对于特定细胞类型的最佳水平，例如，基于所列每种组分的所列浓度或从该浓度开始，测试这种特定组分的浓度范围(例如、10%、25%、50%、75%、100%、2-、5-、10-、20-、50-、100-、200-、500-、1000 倍更高的浓度，或 10%、25%、50%、75%、100%、2-、5-、10-、20-、50-、100-、200-、500-、1000倍更低的浓度)。一些组分具有所列出的浓度范围。也可以从所列浓度开始，类似地确定任何特定细胞类型的适宜或最佳浓度。在进行这类测试时，初始的宽浓度测试可以基于初始试验的结果稍后收窄。例如，对于初始测试，可以改变目的组分的浓度至10' 10_2、10—1、10倍、100倍和1000倍于表3中列出浓度。如果10_2测试仍支持所需的生长，而10_3不能，则可以第二轮试验中进一步探索10_2和10_3之间的10倍浓度差异，以确定最佳范围。因此，针对特定细胞类型如此优化的培养基也处于本发明的范围内。
[0075]如本领域普通技术人员将是明显的，可以增加或减低给定成分的浓度超出公开的范围，并且可以仅使用常规实验法确定增加或减低的浓度的作用。可以使用 Ham(Ham, Methods for Preparation of Media, Supplements and Substratafor Serum-Free Anima l Culture, Alan R.Liss, Inc., New York,第 3-21 页,1984)和 Waymouth(Waymouth, C.，Methods for Preparation of Media, Supplements andSubstrata for Serum-Free Animal Culture, Alan R.Liss, Inc., New York,第 23-68页，1984)描述的方案实施用于任何特定细胞类型的现存培养基制剂的优化。一般通过经验性研究以单一组分滴定研究，或通过解释历史和当前科学文献确定培养基成分的最佳终浓度。在单一组分滴定研究中，使用动物细胞，变动单一培养基组分的浓度，同时全部其他组分和变量保持恒定，并且测量单一组分对动物细胞的生存力、生长或持续健康的影响。
[0076]应当理解如本领域已知，本文中列出的某些维生素和激素可以按不同形式存在(例如，不同的天然存在或非天然存在形式)，并且可以用作彼此的代用品。也将理解其中本申请公开一种维生素或激素的情况下，应当将本发明理解为包括这类实施方案，其中在本发明的培养基和/或方法中使用这类维生素或激素的具有相似生物活性的任何形式(或可以细胞培养基或胞内经修饰或代谢以提供生物活性形式的化合物)。
[0077]可以理解化合物如雌激素、孕酮、甲状腺激素、氢化可的松、胰岛素等可以由分别作为雌激素受体、孕酮受体、甲状腺激素受体、糖皮质激素受体、胰岛素受体的激动剂的其他化合物(天然存在的或非天然存在的、从天然来源分离或至少部分地化学合成)完全或部分替换。许多这类化合物是本领域已知的。[0078]培养基成分可以溶解于液体载体中或以干燥形式维持。如果以上文显示的优选浓度溶解于液体载体中(即，“IX制剂”)，则培养基的PH应当调节至约7.0-7.6、优选地约7.1-7.5和最优选地约7.2-7.4。培养基的克分子渗透压浓度也应当调节至约275-350m0sm、优选地约285_325m0sm和最优选地约280-310m0sm。液体载体的类型和用来将成分溶解入溶液中的方法可变，并且可以由本领域普通技术人员在进行不多于常规实验的情况下确定。一般，培养基成分可以按任何顺序添加。
[0079]细胞培养基由许多成分组成并且这些成分在一种培养基与另一种培养基之间变动。“IX制剂”意指以工作浓度含有细胞培养基中存在的一些或全部成分的任何水溶液。“IX制剂”可以指例如细胞培养基或指这种培养基的多种成分的任何亚组。一种成分在IX溶液中的浓度大致与该组分在用于体外维持或培育细胞的细胞培养物制剂中存在的浓度相同。用于体外培养细胞的细胞培养基是定义的IX制剂。当许多成分存在时，IX制剂中的每种成分具有与这些成分在细胞培养基中的浓度大致相等的浓度。例如，连同其它组分，RPM1-1640培养基含有0.2g/l L-精氨酸、0.05g/l L-天冬氨酸和0.02g/l L-天冬氨酸。这些氨基酸的“IX制剂”含有这些成分在溶液中的大致相同浓度。因此，当谈及“IX制剂”时，溶液中的每种成分意在具有与所描述的细胞培养基中存在的浓度相同或大致相同的浓度。成分在细胞培养基的IX制剂中的浓度是本领域普通技术人员熟知的。参见MethodsFor Preparation of Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal CellCulture Allen R.Liss，N.Y.(1984)，所述通过引用的方式完整并入本文。然而，与培养基相比，克分子渗透压浓度和/或PH可以在IX制剂中不同，尤其当IX制剂中含有更少成分时。
[0080]“10X制剂”意指一种溶液，其中该溶液中的每种成分比相同成分在细胞培养基中更浓缩约10倍。例如，连同其它组分，RPM1-1640培养基的10X制剂可以含有2.0g/lL-精氨酸、0.5g/l L-天冬氨酸和0.2g/l L-天冬氨酸(比较上文的IX制剂)。“10 X制剂”可以按约10倍于IX培养基中存在的浓度含有许多额外成分。如将显而易见，“25X制剂”、“50X制剂”、“10`0X制剂”、“500X制剂”和“1000X制剂”表示与IX细胞培养基相比以约25倍、50倍、100倍、500倍或1000倍浓度分别含有成分的溶液。再次，培养基制剂和浓缩溶液的克分子渗透压浓度和PHo可以变动。
[0081]优选地，包含各成分的溶液比IX培养基制剂中相同成分的浓度更浓缩。各成分可以10倍更浓缩(?ο X制剂)、25倍更浓缩(25 X制剂)、50倍更浓缩(50 X浓缩)或100倍更浓缩(100X制剂)。可以产生更高度浓缩的形式，条件是各成分保持可溶和稳定。见美国专利号5，474，931 (其完整内容通过引用方式并入本文)，该专利涉及以高浓度增溶培养基组分的方法。
[0082]如果将培养基成分制备为单独的浓缩溶液，则将适宜(足够)量的每种浓缩物与稀释剂组合以产生IX培养基制剂。一般，使用的稀释剂是水，但是可以根据本发明使用其他溶液，包括水质缓冲液、水质盐水溶液或其他水溶液。
[0083]本发明的培养基一般经灭菌以防止不想要的污染。灭菌可以例如通过以下方式实现:在混合浓缩的成分后经孔径约0.1-1.0 μ m的低蛋白质结合膜滤器(商业可获得，例如，从Millipore, Bedford, Mass.)过滤以产生无菌培养基。可选地，浓缩的成分亚组可以经过滤除菌并且作为无菌溶液贮存。这些无菌浓缩物随后可以在无菌条件下与无菌稀释剂混合以产生浓缩的IX无菌培养基制剂。高压灭菌法或其他基于升高温度的灭菌方法不是有利的，因为本发明培养基的许多组分是热不稳定的并且将因温度如大多数加热灭菌方法期间实现的那些温度而不可逆地降解。
[0084]如本领域普通技术人员将容易明白，培养基的每种组分可能与溶液中的一种或多种其他组分反应。因此，本发明包括表3中公开的如上文所述补充的制剂，以及在合并这些成分后形成的任何反应混合物。
[0085]许多组织培养培养基一般含有一种或多种抗生素，所述抗生素对于细胞生长/增殖本身而言不是必需，但是存在以便抑制不利微生物如细菌和/或真菌的生长。
[0086]抗生素是抑制其他微生物生长或摧毁其他微生物的分子量相对低的天然化学物质，由各种微生物物种如细菌(包括芽孢杆菌属(Bacillus)物种)、放线菌(包括链霉菌属(Streptomyces))和真菌产生。具有相似结构和作用模式的物质可以化学地合成,或天然化合物可以经修饰以产生半合成抗生素。这些生物合成和半合成衍生物也有效作为抗生素。主要类别的抗生素是:(I) β-内酰胺，包括青霉素、头孢菌素和单酰胺菌素；(2)氨基糖甙类，例如，庆大霉素、妥布霉素、奈替米星和阿米卡星；(3)四环素；⑷磺酰胺和甲氧苄啶；(5)氟喹诺酮，例如，环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星；(6)万古霉素；(7)大环内酯类，其包括例如红霉素、阿奇霉素和克拉霉素；和(8)其他抗生素，例如多粘菌素、氯霉素和林肯胺。 [0087]抗生素借助几种作用机制实现其抗细菌作用，所述作用机制可以总体上如下分类:(1)作用于细菌细胞壁的药物，如杆菌肽、头孢菌素、环丝氨酸、磷霉素、青霉素、利托菌素和万古霉素；(2)影响细胞膜或产生去垢剂作用的药物，如黏菌素、新生霉素和多粘菌素；(3)通过它们作用核糖体而影响细胞复制机制、信息转移和蛋白质合成的药物，例如氨基糖式类、四环素、氯霉素、克林霉素、放线菌酮(cycloheximide)、褐霉酸、林可霉素、嘌呤霉素、利福平、其他链霉素和大环内酯类抗生素如红霉素和竹桃霉素；(4)影响核酸代谢的药物，例如，氟喹诺酮、放线菌素D、乙胺丁醇、5-氟胞嘧啶、灰黄霉素、利福霉素；和(5)影响中间代谢的药物，如磺酰胺、甲氧苄啶和结核菌抑制剂异烟肼和对-氨基水杨酸。一些药物以具有多于一种主要作用机制，尤其在高浓度时。此外，细菌细胞的结构或代谢的继发变化经常在抗微生物药物的主要作用之后出现。
[0088]因此，为了方便和出于其他实际原因，主题培养基可以额外地用抑制不利细菌/真菌/病毒生长/增殖的一种或多种抗生素或其他物质补充。然而，在其他实施方案中，主题培养基可以不含任何抗生素以确保原代细胞的最佳生长。当操作在无抗生素的培养基中生长的细胞时，应当格外仔细以便避免可能的污染。
[0089]表3中列出的浓度并不是绝对和不可变动的。由于不同的细胞类型可能具有不同的生长需要，故构思在总体上，每个值的2-10倍变异(增加或下降)是可接受的浓度范围。一些组分可以忍受甚至更大的终浓度变异。可以使用这些起始浓度实现进一步优化。
[0090]在一些实施方案中，任一种或多种所添加组分的终浓度与表3中列出的浓度相差至多到10倍，藉此意指相关的浓度可以是0.1至10倍于表3中列出的浓度。在一些实施方案中，任一种或多种所添加组分的终浓度与表3中列出的浓度相差至多到3倍，藉此意指相关的浓度可以是0.3至3倍于表3中列出的浓度。在一些实施方案中，任一种或多种所添加组分的终浓度与表3中列出的浓度相差至多到2倍，藉此意指相关的浓度可以是0.5至2倍于表3中列出的浓度。在一些实施方案中，任一种或多种所添加组分的添加浓度与表3中列出的那些浓度分别相差表3中列出的值至多到10%、20%或50%。
[0091]本发明包括其中不向培养基添加任何1、2、3、4或5种组分的实施方案。在一些实施方案中，培养基补充有胰岛素、EGF、氢化可的松、霍乱毒素和血清。任选地，培养基进一步补充有雌激素。
[0092]B.正常卵巢细胞和输卵管细胞的培养
[0093]卵巢是由卵母细胞(卵细胞)、支持卵母细胞的间质细胞和覆盖卵巢表面的上皮组成的雌性生殖器官。在排卵期间，卵母细胞(卵细胞)突破卵巢表面并由输卵管的伞端捕获。这些卵母细胞沿输卵管上行进入子宫内膜腔，在此处它们植入(图1A-C)。
[0094]内部器官的上皮约束中央管腔如输乳管、肠管、支气管等。上皮细胞的功能差异在于它们将物质分泌入管腔或从管腔吸收物质；如分泌唾液、乳汁、肺粘液、胃酸、胰酶或通过胃肠道和肾上皮吸收水和养分。包围管腔的整个组织结构有时称作“导管”或“腺体”。这些细胞共有的常见功能赋予它们独特特性，所述特性使得它们成为与身体中全部其他细胞不同的独特组。
[0095]卵巢的表面被单层上皮覆盖，在下方卵母细胞位于在有时称作“卵巢皮层”的区域中。卵母细胞受构成卵巢本体的激素活性的卵巢间质细胞支持。在每个周期期间，几种卵母细胞释放至输卵管中并且缺口在卵巢表面处形成，所述缺口正常情况下由卵巢表面上皮修复。然而，在一些情况下小囊肿在排卵部位形成，所述小囊肿衬有不同于表面上皮的上皮。卵巢皮层中的这些囊肿称作“包涵囊肿”(图1D)。输卵管的管腔衬以由两个细胞类型组成的单层上皮，所述两个细胞类型在形态学上因在它们的顶端表面存在或不存在纤毛而区分。
[0096]肿瘤源自卵巢和输卵管中的细胞。具体而言，源自和/或类似内部器官的腺状和导管上皮的肿瘤统称为腺癌。术语“癌症”或“癌”由病理学家用来指具有上皮表型的肿瘤。因而，术语“卵巢癌”、“卵巢癌”和“卵巢腺癌”可以互换使用。
[0097]值得注意地，绝大部分的人类肿瘤，包括输卵管卵巢肿瘤以及肺、乳腺、结肠、前列腺、胃肠道、内分泌器官和妇科肿瘤是上皮腺癌。这些肿瘤总体上占超过90%因癌症所致的人类死亡。与上皮癌症相比，源自全部其他细胞如血液细胞、免疫细胞、肌肉细胞、骨细胞、神经细胞、内皮细胞和成纤维细胞的肿瘤是非常罕见的。
[0098]来自卵巢和输卵管上皮的输卵管卵巢腺癌占据几乎90%造成大部分卵巢癌相关死亡的恶性卵巢肿瘤。来自卵巢中间质细胞和生殖细胞的肿瘤是罕见的，占小于5%因卵巢肿瘤所致的死亡。
[0099]卵巢的腺癌是由具有不同细胞特征、形态特征和临床特征的至少6种主要组织病理学亚型组成的异质性疾病。卵巢腺癌的主要亚型包括占据超过90%卵巢腺癌的乳头状浆液性、粘液性、子宫内膜样、透明细胞、鳞状和过渡型。
[0100]哪种细胞是输卵管卵巢肿瘤的推定性前体病灶？鉴定和检测早期非浸润性前体病灶如乳腺(DCIS)中的原位导管癌、结肠中的腺瘤息肉、子宫颈中的鳞状表皮内病灶(SIL)或子宫内膜表皮内瘤形成(EIN)已经大大帮助理解这些器官中癌症发生的发病机制。鉴定推定性细胞和早期前体病灶允许开发早期检测工具并更好理解肿瘤在这些器官中的天然进展。由于大多数卵巢癌在它们的进展中很晚才变得有症状，所以已经不可能充分地研究它们的前体病灶。不幸地，在这个时间没有用于早期检测这种癌症的常规筛查工具。[0101]已经存在被提出作为人卵巢腺癌来源的三种类型的正常细胞；在组织学上已经认为卵巢癌源自卵巢皮层内部的卵巢表面上皮(OSE)或上皮包涵囊肿(OC)。然而，已经在卵巢中鉴定到少数癌前期病灶，并且难以确定变化如在正常卵巢中观察到的卵巢上皮内瘤形成是否真正代表恶变前肿瘤病灶。最近的研究具有提出输卵管上皮(FTE)，特别地伞端，作为多达一半的高等级乳头状浆液性腺癌的推定性细胞源。这得到以下数据支持:来自相同女性的输卵管前体病灶和肿瘤组织共有常见的P53突变。
[0102]因此，本发明的一个方面包括支持正常卵巢细胞和输卵管细胞(例如卵巢表面上皮(OSE)、上皮包涵囊肿(OC)和输卵管上皮(FTE))体外生长和/或增殖至少约4周或至少约15、25或甚至35次群体倍增(PD)的细胞培养基。
[0103]上皮细胞如正常卵巢和/或输卵管细胞(0SE、0C和/或FTE)可以永生化以便延伸细胞的寿命。细胞可以借助致癌性转化，例如，通过使正常细胞暴露于化学诱变剂、辐射或其他致癌物质，和/或通过表达病毒癌基因(例如，H-Ras、人乳头瘤病毒E6/7(HPVE6/7)、猴病毒40大T/小t(SV40T/t)抗原和/或腺病毒蛋白(ElA))转化正常细胞而永生化。细胞也可以过量表达端粒酶(如人端粒酶逆转录酶(hTERT))的催化性亚基永生化。在一些实施方案中，过量表达hTERT的卵巢和/或输卵管细胞在适应于正常卵巢细胞和输卵管细胞生长和/或增殖的细胞培养基中培养。本文所述的hTERT过量表达和细胞培养基的组合可能足以永生化卵巢和/或输卵管细胞。
[0104]在一些实施方案中，培养物包含其中hTERT已经过量表达的细胞，其中hTERT的过量表达足以使得所述细胞能够进行至少14、25或35次群体倍增。该培养可以包含至少
103、至少104、至少IO5或至少IO6个细胞。hTERT过量表达可以归因于，例如用病毒转染或
转化。`
[0105]可以将卵巢细胞和输卵管细胞，如永生化细胞，转化成致瘤细胞。转化的致肿瘤卵巢和/或输卵管细胞可以在适应于正常卵巢细胞和输卵管细胞生长和/或增殖的培养基(如在这部分中描述和本公开中由WIT-fo (表3)例举)中培养。
[0106]在不带纤毛的输卵管细胞或卵巢包涵囊肿细胞的致癌性转化后，使这些细胞类型与探针的表达相关。在某些实施方案中，转化的不带纤毛的输卵管细胞过量表达探针集合D0K5、CD47、HS6ST3、DPP6、0SBLP3,并且转化的卵巢包涵囊肿细胞过量表达探针集合STC2、SFRPl、SLC35F3、SHMT2、TMEM164。
[0107]本发明的一个方面涉及卵巢细胞和/或输卵管细胞的培养物，其中所述卵巢细胞过量表达探针集合D0K5、CD47、HS6ST3、DPP6、0SBLP3 ;并且其中所述输卵管细胞过量表达探针集合STC2、SFRPl、SLC35F3、SHMT2、TMEM164，其中所述培养物包含至少IO3个细胞；以及所述细胞能够发生至少14、25或35次群体倍增。在一些实施方案中，该培养物包含至少
104、105、IO6、107、IO8、IO9和 / 或 IO10 个细胞。
[0108]在前述任一者的某些实施方案中，基本上纯化的细胞培养物是培养物，其中培养物中至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或大于98%的细胞是特定的目的细胞类型。
[0109]因而，如上文所述，本发明提供可用于培养正常卵巢上皮细胞和正常输卵管细胞的细胞培养基。在一些实施方案中，可用于培养正常卵巢上皮细胞和正常输卵管细胞的细胞培养基包含三磷酸腺苷；载体蛋白；胆固醇、亚油酸和硫辛酸；谷胱甘肽；选自次黄嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤和胸苷的核苷酸补救途径前体碱基；磷脂酰乙醇胺；硒；转铁蛋白；三碘甲腺原氨酸；维生素A、维生素C、和维生素D ;Zn、Mg和Cu ;增加胞内cAMP的试剂；表皮生长因子(EGF);氢化可的松；胰岛素；和血清。培养基还可以包含至少一个腺苷单磷酸和维生素E。培养基可以包含维生素K3、烟酸或烟酰胺中的至少一种。培养基中的载体蛋白可以是白蛋白。培养基中的核苷酸补救途径前体碱基可以是黄嘌呤和/或次黄嘌呤。
[0110]增加胞内cAMP的试剂可以是霍乱毒素。在一些实施方案中，细胞培养基以范围从 1-lOOng/ml ;l_75ng/ml ;l_50ng/ml ;l_25ng/ml ;l_15ng/ml ；l-10ng/ml ； 10-100ng/ml ；10_75ng/ml ;10_50ng/ml ;10_25ng/ml ;10_15ng/ml ； 15-100ng/ml ;15_75ng/ml ;15_50ng/ml ;15_25ng/ml ；15-20ng/ml ；20-100ng/ml ；20-75ng/ml ；20-25ng/ml ；25-100ng/ml ；25-75ng/ml ;或25_50ng/ml的浓度包含霍乱毒素。优选地，细胞培养基可以包含约20ng/ml的霍乱毒素，或者，约25ng/ml的霍乱毒素。
[0111]在一些实施方案中，细胞培养基包含EGF。EGF的浓度可以是0.5-50ng/ml ;0.5_25ng/ml ；0.5_15ng/ml ；0.5-lOng/ml ；0.5-5.0ng/ml ；0.5-1.0ng/ml ；1.0_50ng/ml ；1.0_25ng/ml ；1.0_15ng/ml ；1.0-10ng/ml ；1.0_5ng/ml ；5.0_50ng/ml ；5.0_25ng/ml ；5.0_15ng/ml ；5.0-10ng/ml ； 10-50ng/ml ;10_25ng/ml ;或 10_15ng/ml。优选地，细胞培养基可以包含3ng/ml和50ng/ml之间的EGF，或最优选地，可以包含约10ng/ml的EGF。
[0112]在一些实施方案中，细胞培养基包含氢化可的松。氢化可的松的浓度可以是0.01-5.0 μ g/mL ;0.01-2.5 μ g/mL ;0.01-1.0 μ g/mL ;0.01-0.5 μ g/mL ;0.01-0.30 μ g/mL ；0.01-0.25 μ g/mL ;0.01-0.10 μ g/mL ;0.01-0.05 μ g/mL ;0.05-5.0 μ g/mL ;0.05-2.5 μ g/mL ；0.05-1.0 μ g/mL ；0.05-0.5 μ g/mL ；0.05-0.30 μ g/mL ；0.05-0.25 μ g/mL ；0.05-0.10 μ g/mL ;0. 05-0.05 μ g/mL ;0.15-5.0 μ g/mL ;0.15-2.5 μ g/mL ;0.15-1.0yg/mL ;0.15-0.5 μ g/mL ;0.15-0.30 μ g/mL ;0.15-0.25 μ g/mL ;0.15-0.10 μ g/mL ；和
0.15-0.05 μ g/mL。优选地，氢化可的松在细胞培养基中的浓度在0.015-5.0 μ g/mL之间。为了培养正常卵巢细胞和输卵管细胞，细胞培养基优选地包含在0.25 μ g/mL和0.50 μ g/mL之间的氢化可的松，和最优选地包含约0.5 μ g/mL的氢化可的松。
[0113]在一些实施方案中，细胞培养基包含胰岛素。胰岛素的浓度可以是
1.0-75.0 μ g/mL ； 1.0-50.0 μ g/mL ； 1.0-25.0 μ g/mL ； 1.0-10.0 μ g/mL ； 10.0-75.0 μ g/mL ； 10.0-50.0 μ g/mL ； 10.0-25.0 μ g/mL ；和 10.0-15.0 μ g/mL ; 15.0-75.0 μ g/mL ;15.0-50.0 μ g/mL ；15.0-25.0 μ g/mL ;和 15.0-20.0 μ g/mL? 在一些优选的实施方案中，胰岛素的范围是15.0-20.0 μ g/mL。为了培养正常卵巢细胞和输卵管细胞，细胞培养基优选地包含在5.0 μ g/mL和50.0 μ g/mL之间的胰岛素。最优选地，细胞培养基包含约20.00 μ g/mL的胰岛素。
[0114]在一些实施方案中，细胞培养基以范围从0.2%-4.0%v/v ；0.5-3.0% ；1.0%_2.0%v/
V；1.5%-2.0%v/v的浓度包含血清。在用于培养正常卵巢细胞和输卵管细胞的一些优选的实施方案中，细胞培养物包含在0.25%和0.75%v/v之间的血清。在最优选的实施方案中，细胞培养基包含约0.5%v/v的血清。在一些实施方案中，试剂盒或培养基不包含血清，并且血清(如果存在的话)可以单独地或由用途供应。
[0115]在一些实施方案中，细胞培养基支持卵巢细胞和/或输卵管细胞体外增殖至少约10次群体倍增(PD)。细胞培养基也可以支持卵巢细胞和/或输卵管细胞增殖至少约6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45或50次PD。群体倍增可以反映不同于用作成功细胞
培养的量度的“继代培养”或“传代”次数的信息。细胞的继代培养或传代单纯地指将细胞从一块培养平板移走并且将它们接种入新的培养平板中。这种表示细胞已经耐受从一块平板转移至另一块平板并且在转移期间仍活着。然而，细胞传代次数不必然地表示细胞增殖。
[0116]图2显示在细胞增殖和传代次数之间缺少相关性。在标准对照培养条件下，在4次传代期间，将“传代”输卵管上皮传代几乎60天(图2B，红色曲线)。然而，细胞生长曲线在14日后保持几乎扁平并且没有细胞数目的净增加。因此，传代次数没有提供关于细胞数目净增加的信息。
[0117]细胞数目的净增加最精确地以“群体倍增”(PD)计量。单个细胞将在10次群体倍增时后产生1024个细胞(210=2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024)。因此，每10次群体倍增大约等于3个数量级(1，000倍)的细胞数目净增加，20次群体倍增将接近于I百万倍增加，和30次群体倍增将接近于净细胞数目的10亿倍增加。因此，H)对时间图是半log2指数图。相比之下，细胞传代可能几乎等于细胞数目无净增加。
[0118]一种示例性细胞培养基在表3中WIT-fo标记的列内描述。在某些实施方案中，任何特定成分至少部分地由能够满足相同功能的替代性成分替换。在本发明的某些实施方案中，表3中列出的任何特定成分至少部分地由能够满足相同功能的替代性成分替换。可以相对于任一种或多种列出的成分进行这类替换(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种成分可以由能够满足相同功能的替代性成分替换)。在一个实施方案中，替换缓冲液组分。在另一个实施方案中，替换去垢剂或表面活性剂组分。在另一个实施方案中，替换载体蛋白组分。本说明书提供适合的代用品的非限制性例子。
[0119]本发明的另一个方面涉及用于培养正常卵巢上皮细胞和输卵管细胞的方法。在一个实施方案中，用于培养卵巢上皮细胞和输卵管上皮细胞的方法包括从输卵管的卵巢表面和/或缨饰表面获得卵巢 上皮细胞和输卵管上皮细胞并且在如上文并在表3 (列标记WIT-fo)中所述的细胞培养基中培养细胞，其中卵巢上皮细胞和输卵管上皮细胞在所述细胞培养基中经历至少14次群体倍增。
[0120]C.肿瘤细胞的培养
[0121]本发明的一个方面涉及支持原代细胞系的细胞培养基，其中所述原代细胞系源自
(I)实体人肿瘤组织、(2)恶性体液中的肿瘤细胞和(3)小鼠中培育的肿瘤的原代异体移植物的肿瘤细胞。培养的细胞基本上作为组织中的原始肿瘤细胞表型副本生长并且提供临床上相关的模型以找到和开发用于人类肿瘤早期检测、诊断、预后和治疗的试剂。
[0122]绝大部分的人类肿瘤，包括输卵管卵巢肿瘤以及肺、乳腺、结肠、前列腺、胃肠道、内分泌器官和妇科肿瘤是上皮腺癌。这些肿瘤总体上占超过90%因癌症所致的人类死亡。与上皮癌症相比，源自来自全部其他细胞如血液细胞、免疫细胞、肌肉细胞、骨细胞、神经细胞、内皮细胞和成纤维细胞的肿瘤是非常罕见的。
[0123]来自卵巢和输卵管上皮的输卵管卵巢腺癌占据几乎90%造成大部分卵巢癌相关死亡的恶性卵巢肿瘤。来自卵巢中间质细胞和生殖细胞的肿瘤是罕见的，占小于5%因卵巢肿瘤所致的死亡。
[0124]卵巢的腺癌是由具有不同细胞特征、形态特征和临床特征的至少6种主要组织病理学亚型组成的异质性疾病。卵巢腺癌的主要亚型包括占据超过90%卵巢腺癌的乳头状浆液性、粘液性、子宫内膜样、透明细胞、鳞状和过渡型。
[0125]人肿瘤是由恶性肿瘤细胞以及多种不同的正常细胞类型如上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞组成的复杂组织。另外，许多肿瘤由非浸润性(原位)和浸润性恶性组分以及与浸润性肿瘤细胞同时存在的恶变前增生组织组成。因此，当培养物始自肿瘤组织时，来自肿瘤不同组分的许多细胞类型有机会在培养平板中增殖。尽管似乎矛盾，然而对于正常间质细胞或正常上皮细胞以及来自肿瘤的非浸润性(原位)组分的细胞或恶变前增生细胞，在常规培养条件下比浸润性肿瘤细胞生长更快并非不同寻常。因此，需要验证在平板中增殖的细胞的恶性本质的额外实验以证实肿瘤细胞的成功培养。
[0126]软琼脂集落测定法可以用来验证培养的细胞实际上是恶性肿瘤细胞。正常细胞和恶变前细胞不能在软琼脂中形成贴壁非依赖性集落。因此，在这种测定法中形成集落的能力是培养的细胞的恶性本质的指标。用来验证培养的细胞的恶性本质的另一种方法是体内肿瘤形成能力。
[0127]肿瘤细胞培养的成功以“传代次数”表述，其中所述传代次数充其量是细胞增殖的无信息性度量。培养细胞的传代指当细胞变得拥挤或延缓增殖时，机械地或酶促地使细胞从培养皿或培养瓶的表面脱离并且将细胞转移至新的空培养瓶。一般，肿瘤细胞培养的成功以“传代次数”表述，其中所述传代次数可能是细胞增殖的不完整度量。图10显示传代次数并不总是与细胞数目的增加相关。肿瘤细胞经常在2-3次传代后减缓和停止增殖。尽管细胞仍活着并且可以传代额外次数，但是它们的数目可能保持相同或甚至可能下降。因此，在不进行实际细胞计数情况下，单独的传代次数并不证实细胞数目的净增加。
[0128]一种更精确和客观的细胞增殖度量是在细胞的连续培养期间实现的“群体倍增”(PD)的总次数。单个细 胞可以在十次群体倍增时后产生1024个细胞(2^=2.4.8.16'
32、64、128、256、512、1024)。因此，每十次群体倍增大约等于三个数量级(1，000倍)的细胞数目净增加，二十次群体倍增将接近于一百万倍增加，和三十次群体倍增将接近于净细胞数目的十亿倍增加。因此，PD对时间图是半log2指数图。
[0129]因此，本发明的一个方面包括支持以下细胞生长和/或增殖的细胞培养基:癌细胞，例如保藏于ATCC (美洲典型培养物保藏中心)或ECACC (欧洲培养物保藏中心)的卵巢癌腺癌细胞系，或源自原代实体人卵巢组织的细胞、源自腹水的细胞和/或源自已经小鼠中培育的人类肿瘤异体移植物的细胞。该细胞培养基支持体外生长至少约4周和/或至少约30次群体倍增(PD)。
[0130]由于绝大部分的人类肿瘤，包括输卵管卵巢肿瘤以及肺、乳腺、结肠、前列腺、胃肠道、内分泌器官和妇科肿瘤是上皮腺癌，所以本文所述的培养基也可以用来培养源自以下的肿瘤细胞:人乳腺癌、胰腺癌、腺样囊性癌、来自肺或来自胃肠道的神经内分泌肿瘤(类癌)和与上皮细胞相关的其他肿瘤。
[0131]在一些实施方案中，用于培养输卵管卵巢肿瘤和源自其中的细胞的细胞培养基包含三磷酸腺苷；载体蛋白；胆固醇、亚油酸和硫辛酸；谷胱甘肽；选自次黄嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤和胸苷的核苷酸补救途径前体碱基；磷脂酰乙醇胺；硒；转铁蛋白；三碘甲腺原氨酸；维生素A、维生素C及维生素D ;Zn、Mg和Cu ;增加胞内cAMP的试剂；表皮生长因子(EGF);氢化可的松；胰岛素；血清；和任选地，雌激素。培养基还可以包含至少一个腺苷单磷酸和维生素E。培养基可以包含维生素K3、烟酸或烟酰胺中的至少一种。培养基中的载体蛋白可以是白蛋白。培养基中的核苷酸补救途径前体碱基可以是黄嘌呤和/或次黄嘌呤。
[0132]增加胞内cAMP的试剂可以是霍乱毒素。在一些实施方案中，细胞培养基以范围从 1-lOOng/ml ;l_75ng/ml ;l_50ng/ml ;l_25ng/ml ;l_15ng/ml ；l-10ng/ml ； 10-100ng/ml ；10_75ng/ml ;10_50ng/ml ;10_25ng/ml ;10_15ng/ml ； 15-100ng/ml ;15_75ng/ml ;15_50ng/ml ;15_25ng/ml ；15-20ng/ml ；20-100ng/ml ；20-75ng/ml ；20-25ng/ml ；25-100ng/ml ；25-75ng/ml ;或25_50ng/ml的浓度包含霍乱毒素。优选地，细胞培养基可以包含约20ng/ml的霍乱毒素，或者，约25ng/ml的霍乱毒素。
[0133]在一些实施方案中，细胞培养基包含EGF。EGF的浓度可以是0.5_50ng/ml ;0.5_25ng/ml ；0.5_15ng/ml ；0.5-lOng/ml ；0.5-5.0ng/ml ；0.5-1.0ng/ml ；1.0_50ng/ml ；1.0_25ng/ml ；1.0_15ng/ml ；1.0-10ng/ml ；1.0_5ng/ml ；5.0_50ng/ml ；5.0_25ng/ml ；5.0_15ng/ml ；5.0-10ng/ml ； 10-50ng/ml ;10_25ng/ml ;或 10_15ng/ml。优选地，细胞培养基可以包含3ng/ml和50ng/ml之间的EGF，或最优选地，可以包含约10ng/ml的EGF。
[0134]在一些实施方案中，细胞培养基包含氢化可的松。氢化可的松的浓度可以是0.01-5.0 μ g/mL ;0.01-2.5 μ g/mL ;0.01-1.0 μ g/mL ;0.01-0.5 μ g/mL ;0.01-0.30 μ g/mL ；0.01-0.25 μ g/mL ;0.01-0.10 μ g/mL ;0.01-0.05 μ g/mL ;0.05-5.0 μ g/mL ;0.05-2.5 μ g/mL ；0.05-1.0 μ g/mL ；0.05-0.5 μ g/mL ；0.05-0.30 μ g/mL ；0.05-0.25 μ g/mL ；0.05-0.10 μ g/mL ;0.05-0.05 μ g/mL ;0.15-5.0 μ g/mL ;0.15-2.5 μ g/mL ;0.15-1.0yg/mL ;0.15-0.5 μ g/mL ;0.15-0.30 μ g/mL ;0.15-0.25 μ g/mL ;0.15-0.10 μ g/mL ；和0.15-0.05 μ g/mL。优选地，氢化可的松在细胞培养基中的浓度在0.015-5.0 μ g/mL之间。为了培养输卵管卵巢肿瘤细胞，细胞培养基优选地包含在0.15 μ g/mL和0.30 μ g/mL之间的氢化可的松，和最优选地包含约0.15 μ g/mL的氢化可的松。
[0135]在一些实施方案中，细胞培养基包含胰岛素。胰岛素的浓度可以是
1.0-75.0 μ g/mL ； 1.0-50.0 μ g/mL ； 1.0-25.0 μ g/mL ； 1.0-10.0 μ g/mL ； 10.0-75.0 μ g/mL ； 10.0-50.0 μ g/mL ； 10.0-25.0 μ g/mL ；和 10.0-15.0 μ g/mL ; 15.0-75.0 μ g/mL ;
15.0-50.0 μ g/mL ；15.0-25.0 μ g/mL ;和 15.0-20.0 μ g/mL? 在一些优选的实施方案中，胰岛素的范围是15.0-20.0 μ g/mL。为了培养输卵管卵巢肿瘤细胞，细胞培养基优选地包含在
5.0 μ g/mL和50.0 μ g/mL之间的胰岛素。最优选地，细胞培养基包含约15.00 μ g/mL的胰岛素。
[0136]在一些实施方案中，细胞培养基以范围从0.2%-4.0%v/v ；0.5-3.0% ；1.0%_2.0%v/
V;或1.5%-2.0%v/v的浓度包含血清。在某些实施方案中，血清浓度是0.2%-10%v/
V；0.2%-5.0%v/v ；或 1.0%-5.0%v/vo 在一些实施方案中，血清浓度是 4.0%-10.0%ν/ν ；
4.0-6.0%v/v ；5.0-7.0%v/v ；6.0-8.0%v/v ；7.0-9.0%v/v ;或 8.0-10.0%v/v。在用于培养输卵管卵巢肿瘤细胞的一些优选的实施方案中，细胞培养物包含在1.0%和1.5%v/v之间的血清。在最优选的实施方案中，细胞培养基包含约1.2%v/v的血清。
[0137]在一些实施方案中，肿瘤细胞不需要雌激素用于生长。如本文所述的不含雌激素的细胞培养基可以支持乳头状浆液性肿瘤、透明细胞肿瘤、癌肉瘤和无性细胞瘤的生长。
[0138]在其他实施方案中，某些类型的肿瘤细胞可能需要雌激素用于生长。例如，细胞培养基可以按范围从 30-300nM ；30-200nM ；30-100nM ；65-300nM ；65-200nM ；65-100nM ；100-300nM ；100-150nM ;和100_200nM的浓度包含雌激素。为了培养子宫内膜样肿瘤和/或粘液性肿瘤，细胞培养基优选地额外以约65-150nM的浓度范围包含雌激素，并且最优选地以约IOOnM的浓度包含雌激素。雌激素可以是17-β-雌二醇或其生物等同物。17-β-雌二醇的生物等同物将以这样的量存在，所述量具有与处于上文所列浓度范围的17-β-雌二醇相同的活性；例如，可以选择生物等同物的浓度以具有与100ηΜ17-β-雌二醇相同的活性。
[0139]在一些实施方案中，细胞培养基支持卵巢细胞和/或输卵管细胞体外增殖至少约30次群体倍增(PD)。细胞培养基也可以支持卵巢细胞和/或输卵管细胞增殖至少约6、8、
10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45 或 50 次 PD。
[0140]本发明的另一个方面涉及用于培养输卵管卵巢肿瘤细胞的方法。在一个实施方案中，用于培养卵巢上皮细胞和输卵管上皮细胞的方法包括从实体瘤、从腹水或从来自小鼠中培育的肿瘤的原代异体移植物的肿瘤细胞获得输卵管卵巢肿瘤细胞并且在如上文并在表3 (列标记WIT-oc)中所述的细胞培养基中培养细胞，其中卵巢上皮细胞和输卵管上皮细胞在所述细胞培养基中经历至少30次群体倍增。一些细胞系可以从恶性腹水建立，不是来自可以传代多于7次的实体瘤的连续细胞系。恶性流体样品如腹膜腹水和肺流出物不含成纤维细胞和其他间质细胞。腹水一般存在于一小部分处于极晚期疾病的患者中，并且在已经用化疗治疗过的出现复发性疾病的患者中更常见。因此，从腹水分离的肿瘤细胞不来自未治疗的患者。这些治疗后的肿瘤细胞可能已经暴露于遗传毒性药物，因此不同于原始肿瘤细胞。
[0141]在一些实施方案中，可以调节CO2和O2水平以支持某些细胞类型的培养。大多数细胞培养在补充二氧化碳(CO2)至5%的环境空气(18%02)中实施。在其他实施方案中，子宫内膜样和粘液性肿瘤可以在补充有雌激素的WIT-oc培养基中，在包含调节至5%的低氧
(O2)和(5%)CO2的生长条件下培养。
[0142]I1.用于制备细胞培养基的方法和试剂盒
[0143]本发明的其他方面涉及用于制备本文所述的细胞培养基的方法和试剂盒。试剂盒可以用来制备细胞培养基。例如，可以将组分制备为一种或多种组分的母液并且分装在多个容器之间。在一些实施方案中，用于制备细胞培养基的试剂盒包含第一容器，所述第一容器包含三磷酸腺苷；载体蛋白；胆固醇、亚油酸和硫辛酸；谷胱甘肽；选自次黄嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤和胸苷的核苷酸补救途径前体碱基；磷脂酰乙醇胺；硒；转铁蛋白；三碘甲腺原氨酸；维生素Α、维生素C及维生素D ;Ζη、Mg和Cu ;和第二容器，所述第二容器包含增加胞内cAMP的试剂；表皮生长因子(EGF);氢化可的松；胰岛素；血清，和任选地雌激素。在一些实施方案中，这种试剂盒中的细胞培养基可以支持细胞体外增殖至少20次群体倍增(PD)。
[0144]在一些实施方案中，可以将细胞培养基补充物添加至细胞培养基础培养基，以便以产生本文所述的细胞培养基。补充物可以包含增加胞内cAMP的试剂；表皮生长因子(EGF);氢化可的松；胰岛 素；血清；和任选地，雌激素。在一个优选实施方案中，向细胞培养基添加补充物产生0-70ng/ml增加胞内cAMP的试剂，至少3ng/ml的EGF、0.015-0.5 μ g/mL的氢化可的松；至少10.00 μ g/mL的胰岛素，0.2%-4.0%ν/ν的血清补充物，以及任选地，30-300nM的雌激素。[0145]在一些实施方案中，本发明的另一个方面涉及制备本文所述的细胞培养基的方法，所述方法混合三磷酸腺苷；载体蛋白；胆固醇、亚油酸和硫辛酸；谷胱甘肽；选自次黄嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤和胸苷的核苷酸补救途径前体碱基；磷脂酰乙醇胺；硒；转铁蛋白；三碘甲腺原氨酸；维生素A、维生素C及维生素D ;Zn、Mg和Cu ;增加胞内cAMP的试剂；表皮生长因子(EGF);氢化可的松；胰岛素；血清，和任选地，雌激素。如上文所示，组分可以从第一和第二容器和/或从自一种或多种组分的浓缩母液添加。在一些实施方案中，组分可以包装在处于任何组合的任何数目的容器中。在一些实施方案中，使用2、3、4或5个容器，或5和10个之间的容器。
[0146]II1.培养细胞的选择性培育、鉴定和用途
[0147]A.培养细胞的选择性培育
[0148]本发明的一个方面涉及细胞培养基从异质性群体培育选择性细胞类型的用途。对卵巢组织和/或输卵管组织(例如通过刷过这些组织的表面或通过活组织检查)的初始采集可以产生比所需更多的细胞类型。类似地，来自患者的卵巢肿瘤样品可以含有多种细胞类型，包括非癌细胞如间质细胞或成纤维细胞。因为本文所述的细胞培养基适应于正常卵巢细胞、正常输卵管细胞和/或肿瘤细胞的生长，该培养基将不选择其他细胞类型。因而，适应于正常卵巢细胞生长的细胞培养基可以用来从包含正常卵巢细胞如卵巢上皮细胞(表面上皮和/或包涵囊肿上皮)的组织培养选择的细胞类型。适应于正常输卵管细胞生长的细胞培养基可以用来从包含正常输卵管如输卵管上皮细胞(带纤毛的细胞和/或不带纤毛的细胞输卵管细胞)的组织培养选择的细胞类型。适应于肿瘤细胞(如卵巢肿瘤细胞)生长的细胞培养基可以用来培养选择的肿瘤细胞类型。因此，包含腺癌如6种主要组织病理学亚型(乳头状浆液性、粘液状，子宫内膜样、透明细胞、鳞状和过渡型)中至少一种腺癌的卵巢肿瘤组织可以在适应于卵巢肿瘤细胞生长的细胞培养基中培养，以便富集特定的细胞类型。如上文详述，富集的细胞可以作为基本上纯化的细胞培养物提供。在某些实施方案中，所述细胞具有本文中详述的细胞的任一种或多种特征(例如，增殖能力、基因表达、生长特征等)。`
[0149]B.培养细胞类型的鉴定
[0150]在选择性培养细胞类型后，可以鉴定使用一种或多种分子标志物细胞类型。在正常卵巢细胞当中，三种蛋白质(PAX8、F0XJ1和角蛋白7(CK7)的表达模式在细胞类型之间变动。卵巢表面上皮是CK7 (+)、PAX8 (-)和FoxJl (-)，而卵巢包涵囊肿上皮是CK7 (+)、PAX8 (+)和FoxJl (_)。类似地，带纤毛的输卵管细胞(CK7(-)、PAX8(_)和FoxJl(+))可以与不带纤毛的输卵管细胞(CK7 (+)、PAX8 (+)和Foxjl(-))区分。
[0151]在不带纤毛的输卵管细胞或卵巢包涵囊肿细胞的致癌性转化后，使这些细胞类型与探针的表达相关。转化的不带纤毛的输卵管细胞过量表达探针集合D0K5、⑶47、HS6ST3、DPP6、0SBLP3,并且转化的卵巢包涵囊肿细胞过量表达探针集合STC2、SFRPU SLC35F3、SHMT2、TMEM164。因此，可以将肿瘤鉴定为更为输卵管样或卵巢样的。在一些实施方案中，试剂盒可以包含与输卵管细胞相关的探针集合，和/或与卵巢细胞相关的探针集合。
[0152]本发明的一个方面涉及基本上纯化的卵巢细胞和/或输卵管细胞培养物，其中所述卵巢细胞过量表达探针集合D0K5、CD47、HS6ST3、DPP6、0SBLP3 ;并且其中所述输卵管细胞过量表达探针集合STC2、SFRPl、SLC35F3、SHMT2、TMEM164，其中所述培养物包含至少IO3个细胞；以及所述细胞能够发生至少14、25或35次群体倍增。在一些实施方案中，该培养物包含至少IO5、106、107、IO8、IO9和/或101°个细胞。
[0153]可以通过以下方式产生一系列培养的肿瘤细胞的DNA指纹:产生来自所述细胞的基因组DNA的表达谱。也可以产生每个肿瘤细胞系的mRNA表达谱和蛋白质表达图谱。在一些实施方案中，本公开提供具有图13、图14和/或图15的图谱的卵巢癌细胞。
[0154]由于对每个细胞系测试药物反应性，这些表达谱可能与药物反应相关。在一些实施方案中，表达谱可以与来自患者的肿瘤比较，并且其中对患者预后的认识已知的情况下，来自培养细胞系的表达谱可以指示预后。在一些实施方案中，基于患者肿瘤的表达谱和与已知其药物反应性的参比细胞系比较，可以预测药物对患者的肿瘤的可能作用。例如，如果患者的肿瘤具有基本上相似于参比细胞的表达谱，并且参比细胞响应于药物治疗，则可以预测该患者的肿瘤也将响应于这种药物治疗。在一些实施方案中，培养活组织检查或手术获得的肿瘤细胞并且使其在培养中暴露于一种或多种治疗药。评估所述药物对细胞的增殖或存活的影响，以获得一种或多种药物对受试者肿瘤的可能作用的预测。在一些实施方案中，至少部分地基于提示该药物将有益或有效或比另一种替代物更有效的预测或结果，选择一种治疗和/或将其施用至受试者。
[0155]C.培养细胞的示例性用途
[0156]可以例如在多种筛选方法中使用培养的细胞以便鉴定癌症治疗药的候选药物、可用于其他治疗目的(例如，用于侵袭卵巢、输卵管等的其他疾病中)或其他目的的候选药物。在一些实施方案中，使用正常细胞。在一些实施方案中，使用肿瘤细胞。在一些实施方案中，使用从患有目的疾病(例如，侵袭生殖系统的疾病)的受试者获得的细胞。一种鉴定候选治疗药的方法包括在适合的培养基中培养已经进行致癌转化的细胞(正常卵巢细胞或输卵管细胞)或源自原代 培养物的卵巢肿瘤细胞。随后可以使细胞与药物接触并且可以测量该药物对细胞生理学的影响。调节细胞的生理学的药物是候选治疗药。细胞生理学可以包含细胞的生长特性、一种或多种分子标志物的表达、形态和/或可以测量并定量的其他细胞特性。候选治疗药可以是生物分子如核酸(例如，短干扰性RNA，适配体、或反义寡核苷酸)和/或蛋白质，或可以是有机小分子。在某些实施方案中，基于例如药物抑制细胞增殖和/或抑制其存活的能力鉴定该药物。在某些实施方案中，基于例如药物抑制细胞在软琼脂中生长的能力鉴定该药物。
[0157]在额外的步骤中，可以将培养的细胞施用至或植入试验动物中，从而异体移植肿瘤在试验动物中生长。可以将候选治疗药施用至试验动物，并且可以测量异体移植肿瘤的特性。候选治疗药将调节肿瘤的生长、生理学和/或其他特性。具体而言，候选治疗药将抑制肿瘤的生长、降低肿瘤生长速率、减低肿瘤尺寸、减低肿瘤体积和/或减少转移。因此，在某些实施方案中，体内筛选多种药物在动物模型的背景下抑制肿瘤生长或进展的能力。
[0158]在一些实施方案中，培养的细胞可以用于再生医学。例如，如本文所述那样获得或培养的人细胞(一般是正常细胞)可以用于后续植入受试者(例如，人类受试者或非人类受试者)中的组织或器官的离体结构或可以被植入以增进或修复患病、受损或正在变性的组织或器官。在一些实施方案中，细胞从受试者获得、离体培养并且随后植入相同的受试者(自体)中。在一些实施方案中，使用来自相关或不相关供体的细胞。
[0159]在一些实施方案中，如本文所述那样获得或培养的细胞可以经历基因修饰。通常，细胞可以经工程化以表达任一种或多种目的基因或具有增加的任一种或多种目的基因表达和/或具有减少的任一种或多种目的基因表达或不存任一种或多种目的基因的表达或具有特定目的突变或变更。例如，在一些实施方案中，细胞(例如，正常细胞)可以经基因修饰以表达一种或多种癌基因或具有增加的一种或多种癌基因表达或以具有减少的一种或多种肿瘤抑制基因或不存一种或多种肿瘤抑制基因的表达。目的基因可以编码例如蛋白质、微RNA、短发夹RNA等可以将一种或多种载体(例如，质粒、病毒载体等)导入细胞中。用于如此导入的各种方法如转染、病毒感染等是本领域已知的。在一些实施方案中，这类基因修饰可以用来产生疾病模型。
[0160]在一些实施方案中，培养的细胞用于产生重组蛋白，例如，治疗性蛋白。
[0161]如本领域理解，筛选一般涉及测试一种或多种物质并且相对于某种适宜的对照比较一种或多种物质的作用。对照的使用允许研究者评估变化是否为显著的。在某些实施方案中，细胞用来筛选化合物文库，如以高通量方式筛选。
实施例 [0162]已经总体上描述了本发明， 申请人:提到以下示意性实施例以帮助理解总体描述的发明。包括这些具体实施例仅显示本发明的某些方面和实施方案，并且它们不意在以任何方面限制本发明。然而，实施例中描述的某些一般原理可以总体上适用于本发明的其他方面或实施方案。本发明构思，可以组合上文和下文描述的方面、实施方案和其他特征中的任一个或多个。
[0163]实施例1:正常卵巢培养物和输卵管培养物的建立。
[0164]a.WIT-fo培养基:正常卵巢上皮细胞和输卵管上皮细胞在WIT_fo营养培养基中培养至少15次群体倍增(图2A-B，蓝线)，而在几次传代后，相同细胞的重复平板在标准培养基条件下停止生长(图2A-B，红线)。
[0165]b.标准卵巢上皮培养基:对于卵巢上皮细胞，使用对照培养基，其由补充有范围5-10%的胎牛血清、2mmL-谷氨酰胺和10ng/ml表皮生长因子的MCDB105/培养基199的1:1混合物组成。作为对照培养基，含10-15%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/Ham’ sF-12(l:l混合物)产生相似的结果。这两种培养基已经在过去二十年由许多的其他研究者用于短期卵巢细胞培养。卵巢细胞在这些对照培养基中不增殖超过几次群体倍增。(图2A，红线)。
[0166]c.标准输卵管培养基:对于输卵管上皮细胞，使用Cromer等人描述的对照培养基，所述对照培养基由补充有0.1%BSA、5%血清(2.5%胎牛血清外加2.5%Nu血清的1:1混合物)和17 β雌二醇的Dulbecco改良Eagle培养基(DME)和Ham’s F12的1:1混合物组成。也测试了 Levanon等人的这种培养基的略微改良形式,它由补充有2%血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DME)和Ham’s F12的1:1混合物组成。(图2B，红线)。
[0167]在WIT-fo培养基中培育的卵巢细胞已经在7次传代(42天)中实现14次群体倍增，这等于净细胞数目增加8，192倍(图2B)。在标准对照培养基(DME:F12)中，相同细胞也可以传代7次(42天)，然而，它们在7次传代(42天)中仅具有2.4次群体倍增，这等于细胞数目净增加5.3倍。因此，细胞数目在WIT-fo中的净增加1，526倍于标准DME:F12培养基中的净增加(8，192 + 5.3=1，526)(图2B)。[0168]测试了用于培养卵巢细胞的可用细胞培养基的几种变例。在下文列出的培养基中，卵巢细胞和输卵管细胞在3-5周内部停止分裂并且未观察到细胞数目的净增加。
[0169]?含10%胎牛血清和10ng/ml表皮生长因子的MCDB105/培养基199 (1:1混合物)(Karlan 等人,American J.0f Obs.Gyn.173 (I), 97-104，1995)。
[0170].含5%胎牛血清的MCDB105/培养基199(1:1混合物)(Auersperg等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA Vol.96，6249-6254，1999)。
[0171]?含 15% 胎牛血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基(DMEM) /Ham's F_12(l:l 混合物)(Nitta 等人,Gynecologic Oncology 第 81 卷，第 I 期，第 10-17 页,2001)。
[0172].含10%胎牛血清、2mmL-谷氨酰胺和10ng/ml表皮生长因子的MCDB105/培养基199 (1:1 混合物)。(Liu 等人，Cancer Res.1; 64 (5): 1655-63，2004)。
[0173]实施例2:在WIT-fo中培养的正常卵巢细胞和输卵管细胞的表征。
[0174]为了鉴定培养细胞的谱系和来源，进行正常人卵巢组织和输卵管组织的免疫组织化学表征，并且开发了区分体内正常输卵管组织和卵巢组织中不同上皮细胞亚类的标记组。
[0175]采用识别不同细胞的抗体对正常人卵巢组织和输卵管组织的福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)切片的免疫组织化学检验定义出正常细胞亚类。在筛选许多种抗体后，确定一组三种抗体-PAX8、F0XJ1和角蛋白7(CK7)_以允许区分卵巢中的表面上皮与包涵囊肿上皮以及输卵管中的带纤毛细胞与不带纤毛细胞。确定全部卵巢上皮和输卵管上皮亚类均为角蛋白7阳性(+)。尽管卵巢表面上皮是PAX8阴性(_)，但卵巢包涵囊肿上皮是PAX8阳性(+)。另外，不带纤毛的输卵管上皮亚类为PAX8阳性⑴和F0XJ1阴性(_)，这使其区别于带纤毛的细胞，后者为F0XJ1阳 性⑴但是PAX8阴性㈠(图3A-E)。
[0176]
输卵管卵巢细胞类型 I角蛋白7 & IfoxJI
卵巢表面上皮+-
卵巢包涵囊肿上皮++—
带纤毛的输卵管细胞 ''+
不带纤毛的输卵管细胞~++~
[0177]检查从卵巢和输卵管培养的细胞。从卵巢培养的细胞表达CK7(+)蛋白、PAX8(+)蛋白，但是对F0XJ1 (-)为阴性。这份图谱与卵巢包涵囊肿衬层一致。此后，培养的卵巢细胞称作卵巢包涵囊肿(OC)细胞(图3G)。
[0178]从正常输卵管伞部培养的细胞表达CK7(+)蛋白、PAX8(+)蛋白，但是对F0XJ1 (-)为阴性。这份图谱与不带纤毛的输卵管上皮细胞一致。这些培养的细胞此后称作FN细胞(不带纤毛的输卵管细胞)(图3G)。
[0179]实施例3:hTERT永生化的正常卵巢培养物和输卵管培养物的建立。
[0180]a.正常卵巢培养物和输卵管培养物的永生化。正常人上皮细胞在细胞培养下并不生长良好并且在常规的培养基中具有有限寿命。相比之下，更直接明了的是培养全部啮齿类细胞和人类非上皮细胞类型。
[0181]为了建立连续型正常人上皮细胞培养物，将致癌性转化用来产生可以连续培养的细胞系。在这种方案中，通过使正常人细胞暴露于化学诱变剂、辐射或其他致癌物质实现正常上皮细胞的致癌性转化。这些物质造成广泛的突变、DNA断裂和染色体重排，并且细胞可以不再视作完全正常的细胞。用于转化正常细胞的备选方法使用病毒癌基因来转化正常细胞。在这些基因当中有人乳头瘤病毒E6/7 (HPV E6/7)基因、猴病毒40大T/小t (SV40T/t)抗原和腺病毒蛋白(ElA)，但是这些方法可以带来问题。
[0182]一种侵入性较小的延长正常人细胞寿命的不造成遗传不稳定性或DNA突变的方法是过量表达端粒酶催化性亚基(hTERT)。hTERT表达实际上使基因组稳定，并且细胞保持类似于正常细胞的近乎双倍体。
[0183]在WIT-fo培养基中(见，表3，列标记“WIT-fo”)，正常卵巢包涵囊肿(OC)上皮细胞和不带纤毛的输卵管(FN)上皮细胞仅用hTERT进行永生化。这些永生化的OC和FN细胞下文分别称作OCE细胞和FCE细胞(图3A-E)。将这些细胞连续培养超过40次群体倍增，细胞数目净增加几乎IO12倍，表明它们永生化。相比之下，在几次传代后，甚至在存在hTERT过量表达时，表达hTERT的相同细胞的重复平板在标准培养基条件下停止生长(图4A-E)。
[0184]实施例4:卵巢包涵囊肿(OC)上皮和不带纤毛的输卵管(FN)正常上皮的致瘤性转化:
[0185]如之前描述，hTERT永生化的OCE和FNE细胞用SV40T/t和H-Ras转化(图5A)。尽管表达SV40T/t转化了正常人细胞，但是这些细胞在小鼠中没有变成具有致肿瘤性。癌基因如H-Ras的额外表达使得这些转化的细胞在小鼠中具有致肿瘤性。转化的致肿瘤性OC细胞(OCLER)和FN细胞(FNLER)表达PAX8和角蛋白7并且对于FOXJl为阴性，从而证实它们分别保留其原始卵巢包`涵囊肿表型和输卵管非纤毛表型。将相等数目的OVLER细胞和FNLER细胞注射至免疫受损裸鼠的腹膜间隙中。5-9周后的小鼠尸体剖检分析揭示两个组中大小相似的腹内原发性肿瘤。OCLER肿瘤和OVLER肿瘤均具有不良分化的形态，然而，可以鉴定局灶性小的微乳头状样结构(图6A-B)。肿瘤细胞也为PAX8+(图6，C-D)并且局部侵入周围的腹膜内如胰脏(图7A-B)。
[0186]对来自携瘤小鼠的肺的检验揭示了源自OC和FN的致瘤细胞之间的明显差异。首先在解剖显微镜下对每只小鼠的肺检验gfp+肿瘤细胞(图7C)，并且检验相同肺的FFPE切片，对于非典型的肿瘤细胞，采用H&E切片显微镜检验(图7D)，并且用p53和SV40T/t免疫组织化学染色(图7E-F)。
[0187]转化的不带纤毛的输卵管细胞(FNLER)在67%小鼠的肺中形成转移(4/6)，而用相同癌基因转化的同基因正常卵巢细胞(OCLER)在13%的小鼠(1/8)中形成转移(图6G)。由于这些细胞从相同患者分离并用相同的癌基因转化，因此这表明肿瘤中转移潜力的差异在OC与FN中出现。
[0188]实施例5:预示性细胞源基因表达特征标识的发现:
[0189]a.细胞来源FNE (输卵管)与OCE (卵巢的)表达特征标识。使用源自这些实验性研究的基因特征标识，将源自患者的原代卵巢肿瘤组织划分为输卵管(FT)样和卵巢(OV)样。1，017种探针的表达水平在正常的永生化(FNE与0CE)细胞之间显著地变动(FDR校正P〈0.05)。为了在卵巢癌数据集内部产生FT样和OV样亚类，应用一项方案，该方案不同于先前广泛使用的基于全面基因表达谱将患者聚类的策略。另外，该方案涉及选择在FNE (D0K5、CD47、HS6ST3、DPP6、0SBPL3)或 0CE(STC2、SFRPl、SLC35F3、SHMT2、TMEM164)中过量表达的5个具有独特基因符号的最高度显著的探针集合和通过将FNE基因权重为(+1)和将OCE基因权重为(-1)，计算两个卵巢癌数据集中这些基因的归一化表达值的总和；具体而言，将OCE基因的归一化表达值的总和从FNE基因的表达值的总和中扣除以计算每种肿瘤的评分。因此，较高评分暗示更为FT样。对这种评分使用混合建模拟合高斯曲线的双峰分布，以鉴定该数据集中的两个亚群；一个更为OV样而一个更为FT样。
[0190]这种聚类在Wu等人，数据集(GE0GSE6008)中进行。这项研究在相似阵列平台上剖析了 99份新鲜的冷冻显微解剖的上皮卵巢癌(包括许多非浆液性组织学亚型)。因平台差异，10个基因中有8个可用于分析。在整体检验中，这8个基因强烈地与组织学亚型(Ρ=9.93Χ10-η)、等级(Ρ=2.03Xl(T)和分期(Ρ=9.55X 10_12)相关。为了鉴定与这些临床因素最强烈相关的特定基因，应用对数回归，其揭示出D0K5、CD47和SFRPl似乎推动这种关联(图8a)。将8-基因特征标识用来定义Wu数据中的FT样亚群和OV样亚群，并且密度曲线中评分的可视化显示或多或少的双峰分布(图8b)，这支持划分成两个组(0V样和FT样)。值得注意地，使用这种评定系统时，归于Wu数据集中的4份正常卵巢表面上皮样品均划分为OV样。细胞源划分与患者肿瘤中的临床差异相关；FT样亚群包括这些肿瘤，它们具有显著更高的分期(P=3.27X_6)、等级(P=4.46X10_4)并且优势地由浆液性肿瘤组成(P=L 83 X 10_8)(图Sc)。相比之下，OV样肿瘤包括多种非浆液性组织学亚型，如子宫内膜样、透明细胞和粘液性肿瘤，并且包括等级更低的肿瘤。
[0191]进一步在Tothill数据集(GE0GSE9891)中验证这种10基因特征标识，其中所述Tothill数据集在相同平台上排列来自246份浆液性肿瘤和20份子宫内膜样恶性肿瘤的新鲜冷冻肿瘤片(未进行显微解 剖)；重要地，这些组织可能与患者存活数据联系。相同高斯混合建模法的应用鉴定到OV样和FT样评分，所述评分不是明显双峰的，然而我们观察到提示OV样肿瘤小亚群的轻微左偏移(图8d)。FT样亚群显著地富集浆液性肿瘤(P=0.0109)，含有更多的高分期肿瘤(这是非显著的，P=0.0691)并且显示与等级不相关(P=0.876)(图8e)。FT样肿瘤具有显著更差的无疾病生存期(P=0.000297)和总生存期(P=0.0495)(图8f)。由于Tothill数据集中缺少明显的双峰性，肿瘤错误划分为OV样或FT样是可能的。然而，基于来自Wu和Tothill数据集的联合结果，我们得出结论，细胞源特征标识存在于输卵管卵巢肿瘤中并且这种分类似乎阐明了先前未认识的临床上不同的输卵管卵巢癌亚组。
[0192]b.转化的与永生化的基因特征标识。无论细胞来源如何，与其匹配的转化细胞特征标识(TCS)相比，不同细胞系使得评价正常永生化细胞特征标识(ICS)之间的基因表达差异成为可能(图9)。为了做到这一点，测量仅表达hTERT的永生化FNE/0CE和表达hTERT+LT/st和H-Ras癌基因的转化FNLER/0CLER的mRNA表达谱。
[0193]结果表明，与TCS+卵巢癌相比，ICS+基因表达特征标识预测出卵巢癌患者中统计显著的更差临床转归(图9)。
[0194]与转化的细胞特征标识(TCS)相比，正常永生化细胞特征标识(ICS)与更差结局相关(图9A)。这个结果表明“转化的细胞特征标识”可以与针对化疗的更好反应相关并且预测更好的转归。在化疗法治疗后，对毗邻于肿瘤的正常上皮的显微镜检验几乎从未显示坏死或凋亡的迹象。相比之下，显著的坏死、凋亡、炎症和/或纤维化与肿瘤中的化疗反应相关。因为涉及DNA损伤反应、细胞周期调节、核苷酸和能量代谢的许多缺陷性途径，肿瘤细胞可能对化疗更敏感。
[0195]另外，在借助Tothill在其数据集中鉴定的经验限定的不良转归组和通过检验其数据集所鉴定的ICS特征标识之间观察到惊人的重叠。从我们划归为ICS的51个病例中，仅3个病例由Tothill划归为不良预后(Cl)。相比之下，85个ISC肿瘤中有46个由Tothill划归为不良预后(Cl)(图9B)。
[0196]实施例6:肿瘤细胞在标准培养基中的生长动力学
[0197]肿瘤是由许多细胞类型组成的复杂组织；这些细胞类型包括与肿瘤细胞混杂的多种间质细胞如成纤维细胞、内皮细胞、淋巴细胞、白细胞、巨噬细胞、正常上皮细胞等。在这些细胞类型当中，成纤维细胞已经在历史上最早在标准培养基中生长。将肿瘤组织置于培养平板中时，一般存在成纤维细胞的爆发式生长，从而在几周内，成纤维细胞完全占据培养物，并且全部其他细胞类型包括肿瘤细胞很快从培养物中消除。在使用补充有血清的RPM1、DMEM、F12MCDB105/M199培养基几乎全部情况下获得相似的结果；成纤维细胞是正在增殖的主要细胞类型。因此，在这些培养基中，间质细胞完全超越肿瘤细胞，并且不可能建立纯的癌细胞系。
[0198]在其中不出现非肿瘤细胞过度生长的罕见样品中，可能实现肿瘤细胞在标准培养基中的短期生长。然而，甚至在初始成功的这些罕见情况下，肿瘤细胞一般在几周后在最频繁地用来培养卵巢细胞系的标准培养基(如DMEM、F12、RPMI和MCDB105/M199)中生长停滞。此后一般是广泛的细胞死亡。在大多数情况下无法建立连续细胞系并且在此时抛弃培养物。在非常罕见的情况下，亚克隆可以出现并产生连续细胞系。
[0199]在其中可以在标准培养基中建立连续肿瘤细胞系的那些情况下，通常观察到4个阶段；短暂快速生长几周(a)，随后是生长平台期(b)，随后广泛的细胞死亡(C)和罕有细胞克隆的出现。
[0200]在图10中最佳地图示这种事件序列。当人卵巢肿瘤样品在RPMI培养基中铺种时，肿瘤细胞在约5次群体倍增时生长停滞(图1OA和10C，在第20-40日之前红线和绿线的扁平部分)。之后是广泛的细胞死亡，由细胞数目下降反映(图1OA和10C，第40-50日，红线和绿线的向下部分)。这种类型的生长动力学是在常规培养基中实施的绝大多少人类肿瘤培养常见的。
[0201]在使用常规细胞培养基的几乎三十多次尝试时，仅建立一个肿瘤细胞系。在这个唯一情况中，如上文所述，几乎全部其他细胞被杀死之后，肿瘤细胞的克隆才在RPMI培养基中开始增殖(图10A，红线，第90日)。
[0202]90日后检验在RPMI培养基中生成的肿瘤细胞克隆的基因组，与未培养的肿瘤DNA相比，出现显著变化(图10B)。相比之下，在WIT-oc中培育的肿瘤细胞与原始肿瘤十分相似(图10B)。
[0203] 总之，存在一个例外，在标准细胞培养基中肿瘤细胞最终死亡或培养物被成纤维细胞占据，因此，不能建立连续细胞系。类似地，Verschraegen等人将源自67位患者的90份不同卵巢癌标本铺种至RPMI培养基中，并且观察到仅可以培养90份中的11份(12%、11/90)并且仅传代15次。
[0204]传代次数与群体倍增:[0205]传代次数不等于群体倍增。图1OA中提供这个观点的例子。肿瘤细胞是在MCDB-105/M199中传代几乎20周。常见传代频率是每周一次，等同于总计20次传代。然而，这些细胞的群体倍增曲线在7次传代后是扁平的。因此，在第7代和第20代之间不存在净增加。因此，这些细胞不能为实施任何有意义的实验提供实用平台。它们在标准培养基中逐周从平板传代至平板，而细胞数目增加很少。
[0206]建立培养物的滞后时间:
[0207]在我们的操作中，在细胞系于RPMI中出现之前观察到90天滞后时间(图10A)。一般因两种过程观察这个滞后时间；在这个滞后期期间大部分细胞死亡，这转而导致已经获得新突变的罕有亚克隆出现并开始快速生长的连续细胞系。但是如图10中所示，这以细胞培养物中获得遗传改变为代价出现。因此，这种细胞系将成为明显偏离原始肿瘤细胞群体的克隆群体。
[0208]实施例7肿瘤细胞在WIT-oc培养基中的生长动力学。
[0209]肿瘤细胞在WIT-oc培养基中的生长是即刻的，无滞后时间。生长速率恒定，未观察到生长平台期或广泛的细胞死亡(图1OA和C，蓝线)。这些结果表明，在WIT-oc培养基中，大部分铺种的肿瘤细胞能够在没有显著体外克隆性选择的情况下增殖(图1OA和C，蓝线)。这一般是我们建立的全部细胞系的生长动力学。
[0210]此后，在WIT-oc培养基中建立的卵巢癌细胞系称作OCI细胞系。
[0211]建立了 25个连续OCI细胞系；14个这些构建体来自原代实体人卵巢组织，7个连续OCI细胞系来自腹水并且5个OCI细胞系来自起初在小鼠中培育的人肿瘤异体移植物(表 I)。
[0212]实施例8.不同亚型的卵巢肿瘤和输卵管肿瘤的培养物:
[0213]卵巢的腺癌是由具有不同细胞特征、形态特征和临床特征的至少6种主要组织病理学亚型组成的异质性疾病。卵巢腺癌的主要亚型包括占据超过90%卵巢腺癌的乳头状浆液性、粘液性、子宫内膜样、透明细胞、鳞状和过渡型。存在作为上皮表型和间充质表型混合体的许多其他罕有卵巢肿瘤亚型如癌肉瘤和生殖细胞源肿瘤如无性细胞瘤。
[0214]已经从6种不同亚型的人卵巢癌(包括特别难以生长的肿瘤类型如子宫内膜样癌和透明细胞癌)建立连续肿瘤细胞系(表1和2)。使用充分优化的方法和培养条件，在26次尝试中建立25个OCI系，全部这些OCI系均长期培养(>30次群体倍增)，成功率超过90%。全部25个肿瘤系均能够形成软琼脂集落(表2)。
[0215]在标准培养基中，尚不可能高效地培育出不同亚型的卵巢癌。建立的绝大部分的连续肿瘤系来自高度侵入性乳头状浆液性卵巢癌，其他亚型几乎无法培养。
[0216]另外，我们建立的细胞系中4个肿瘤细胞系来自原发性输卵管癌。直至最近，大多数原发性缪勒氏管盆腔肿瘤被命名为卵巢癌。我们开发的培养系统用来从原代输卵管和卵巢建立细胞系。
[0217]实施例9:标准培养基中OCI细胞系的培养:
[0218]在各种标准培养基中检验OCI系的生长。使用由美洲典型培养物保藏中心(ATTC)和ECACC推荐用于卵巢癌细胞的培养基。在从ATCC可获得的七种(7)人卵巢腺癌当中，仅3种具有可获得的亚型信息；(I)透明细胞癌、一种(I)乳头状浆液性癌和一种(I)子宫内膜样癌细胞系。[0219]由ATCC推荐用于这些细胞系的培养基是MCDB-105/M199，或补充有10_15%血清的Dulbecco改良Eagle(DMEM)培养基或RPMI培养基。OCI系不能在这些培养基中生长。在图11中显示采用OCI系的这些实验的一个例子(顶部3幅小图)。相比之下，我们测试的全部ATCC细胞系均可以在WIT-oc培养基中培育(图11，底部3幅小图)。这些结果显示标准培养基不能用来替代WIT-0C。
[0220]实施例10:原始肿瘤与OCI肿瘤系组织病理学的比较:
[0221]生物学中在形式和功能之间存在强烈关系。肿瘤亚型的特定组织病理学(形式)源自肿瘤细胞的遗传程序和它们的微环境及全身性因素之间的复杂相互作用。
[0222]ATCC/ECACC卵巢肿瘤系产生不类似于任何人卵巢肿瘤亚型的分化不良的肿瘤(图12A-12B)。相比之下，在WIT-oc培养基中培育的OCI系(OCI)产生具有与原始人肿瘤不可区分的组织病理学的肿瘤异体移植物(图12C-12F)。
[0223]在常见的人卵巢乳头状浆液性癌(PSC)中，乳头状结构物由含有血管的中央间质芯形成。这些芯产生越来越小的乳突，所述乳突内衬有最终形成最小分支的恶性上皮，所述最小分支由成簇的肿瘤细胞在几乎没有间质芯的情况下形成(图12E)。这是一种非常特异的构造特征，它仅见于子宫和卵巢PSC中并且是这种肿瘤特有的。0C1-P9a系从人PSC建立，并且将它们注射入免疫受损小鼠时概括了人PSC的特异性构造(图12C)。这是非凡的结果，因为大部分异体移植肿瘤并不概括原始肿瘤的组织病理学特征。
[0224]卵巢中的另一个不同肿瘤亚型是子宫内膜样腺癌，它一般与围绕中央光强组织的腺体背靠背形成。这些肿瘤一般缺少乳头状结构物。这些肿瘤一般也表达雌激素受体和黏蛋白。从子宫内膜样腺癌建立的OC1-Elp系的确形成具有腺状构造的肿瘤，表达雌激素受体和黏蛋白，从而概括肿 瘤的原始表型。
[0225]总之，不同于产生类似于人卵巢癌的肿瘤的ATCC/ECACC标准卵巢癌系，OCI系产生在组织病理学水平上作为人卵巢癌的形态表型副本的肿瘤。
[0226]实施例11:原始肿瘤与OCI肿瘤系DNA的比较:
[0227]单核苷酸多态性(SNP)芯片允许一种高分辨率方法来比较培养的卵巢肿瘤细胞和它们源自其中的原代未培养肿瘤组织的DNA。这种分析允许基因组级别地检测染色体拷贝数变化、重排和杂合性丧失(LOH)。
[0228]检验了 12个OCI系和匹配性原始肿瘤组织以及9个ATCC卵巢癌系的基因组DNA。来自细胞系及其亲本肿瘤的基因组DNA杂交于AffymetriX250K SNP阵列并且相对于正常参考DNA进行分析。将这些数据在热图中作图，其中存在反常变化的DNA区域以蓝色突出显示并且无可检测变化的区域以黄色突出显示。这些交替的黄色和蓝色SNP条带的基因组级图样为每种肿瘤提供独特的DNA指纹，并且与原始肿瘤相比，允许验证培养的肿瘤细胞。
[0229]在基因组DNA的CGH图谱中存在惊人的相似性，其中所述基因组DNA来自未培养的原代肿瘤组织和在WIT-oc中培育的细胞。数据的非监督层次聚类显示每种OCI系毗邻其亲本肿瘤组织聚类。OCI系保留了原始肿瘤的大量基因组特征标识，从而毗邻于原始肿瘤DNA参比，可以正确地鉴定它们。人肿瘤含有多个亚克隆，它们具有每个亚克隆特有的一系列特有DNA改变。因此，肿瘤的基因组级SNP追踪是分析原始肿瘤的全基因组异质性的一种优异方法。这些结果表明我们已经能够在细胞培养物上保留大部分的这种异质性。
[0230]在OCI系之间，基因组改变的规模分成两个不同组。两个OCI系(OC1-Ulp和P3a)和它们的匹配肿瘤具有涉及至多整个染色体臂的大规模改变(图13，红色比例尺，左边4条泳道)。相比之下，其他10个OCI系和它们的匹配肿瘤含有涉及狭窄染色体区域的基因组改变(图13，中央20条泳道，红色比例尺)。这些改变跨基因组分布，没有清晰的热点。
[0231]对于ATCC卵巢肿瘤系，患者配对的匹配肿瘤DNA不是公开可获得的。这些细胞系中许多在数十年前建立，并且不确定是否可以定位未培养的肿瘤组织片以便与原始肿瘤比较。因此，ATCC/ECACC系不能与原始肿瘤组织比较。然而，ATCC/ECACC系中DNA改变的分布仍可提供信息，因为全部ATCC/ECACC系无一例外地含有大规模的I型基因组改变(图13，蓝色比例尺，右侧9个条泳道)，与更细微小规模改变图样的OCI系的主要图样形成对比。
[0232]SNP图谱提供每种肿瘤的不同和独特指纹，这允许相对于原始肿瘤测试和鉴定每种细胞系(图13)。
[0233]实施例12:0CI肿瘤系的mRNA表达谱: [0234]从不同卵巢肿瘤亚型建立的OCI系的mRNA表达谱具有不同的mRNA表达特征标识。来自12个OCI系、5个正常卵巢的和输卵管系和5个ATCC/ECACC系的mRNA与Affymetrix U133Plus芯片杂交。数据的非监督层次聚类揭示，从乳头状衆液性癌、子宫内膜样癌和透明细胞癌建立的肿瘤细胞系基于它们的肿瘤来源而形成独立的不同组(图14)。另外，mRNA表达特征标识区别于正常卵巢上皮(OCE)和输卵管上皮(FNE)并且区别于ATCC/ECACC卵巢癌细胞系。
[0235]这些结果证实OCI系保留了显著水平的原始肿瘤基因表达谱，其足以在培养时彼此区分这些肿瘤类型。另外，它们表明在ATCC系和OCI系之间存在数百个基因表达的显著差异。
[0236]实施例13:0CI肿瘤系的蛋白质表达图谱:
[0237]从不同卵巢肿瘤亚型建立的OCI系的蛋白质表达谱具有不同的蛋白质表达特征标识。用反相蛋白质测定法(RPPA)检验OCI系的蛋白质提取物，这揭示OCI系再次根据它们的肿瘤来源聚类。从乳头状浆液性癌、子宫内膜样癌和透明细胞癌建立的OCI系形成独立的聚类(图15)。另外，蛋白质表达特征标识区别于正常卵巢上皮(OCE)和输卵管上皮(FNE)并且区别于ATCC卵巢癌细胞系。
[0238]这些结果证实OCI系保留了显著水平的原始肿瘤蛋白质表达谱，其足以在培养时彼此正确区分这些肿瘤类型并与正常细胞正确区分。另外，这些结果表明在ATCC/ECACC系和OCI系之间存在许多蛋白质表达的显著差异。
[0239]实施例14 =OCI系的药物反应:
[0240]如上文所述，OCI系的DNA、RNA和蛋白质图谱显著不同于从ATCC和ECACC肿瘤细胞系库可获得的常规卵巢癌系。这提出以下可能性:0CI肿瘤系的药物反应因此也可能不同于ATCC/ECACC卵巢肿瘤系。
[0241]U0126是抑制促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的药物例子。MAPK是促分裂原活化激酶的成员，也称作“胞外信号调节的激酶”(ERK)。在癌中频繁扩增并过量表达的许多生长因子如EGF和其他受体酪氨酸激酶激活MAPK/ERK途径。此外，许多突变的癌基因(如Ras)激活MAPK/ERK，这使该途径在许多类型癌症的发展中成为中心途径。因此，MAPK/ERK途径的许多组分是抗癌药物开发的活跃领域活性。
[0242]检验了ATCC/ECACC 系(SK0V3、0V90、T0V_1120 和 A2780)和 OCI 卵巢肿瘤系(C5x、P9al、P7a和FC1-Plp)对MAPK抑制剂U0126的反应。将OCI细胞系和ATCC/ECACC细胞系均一式三份在WIT-oc培养基(5000个细胞/孔)中铺种至96孔平板。次日，将MAPK抑制剂U0126的连续稀释物添加至该平板。与药物孵育144小时后，用阿尔玛蓝测定法测量活细胞，度量为590/530荧光。
[0243]在MAPK抑制剂对OCI细胞与ATCC/ECACC的影响方面存在显著差异。如预期，5uM的U0126抑制ATCC/ECACCC细胞系增殖50% (LD5tl)。相比之下，在OCI系中需要大约5倍更多的 U0126 以实现 50% 抑制(LD50>30uM)(图 16A)。
[0244]紫杉醇是抑制微管装配的药物例子。微管是作为细胞骨架的部分的纤丝，其中所述细胞骨架参与细胞分裂和囊泡转运。需要微管组合体来建立在有丝分裂期间使染色体分离进入子代细胞的纺锤丝。因此，抑制微管的药物也抑制肿瘤细胞的增殖。
[0245]在96孔平板中的WIT-oc培养基(5000个细胞/孔)中一式三份铺种OCI卵巢肿瘤系(P7a、P2a、C2p)和ATCC/ECACC卵巢肿瘤系(ES2和0V90)。次日，将紫杉醇的连续稀释物添加至该平板。与药物孵育72小时后，用阿尔玛蓝测定法将活细胞度量为590/530荧光。
[0246]在紫杉醇对OCI细胞与ATCC/ECACC的影响方面存在明显差异。与ATCCC/ECACC系相比，紫杉醇的导致肿瘤细胞数目下降50%的浓度(LD9tl)在OCI系中高出超过5倍(图16B)。
[0247]顺钼是造成DNA交联的化疗药物例子。顺钼与DNA结合并且化学地交联两条链，这造成细胞分裂期间的DNA损伤。这激发修复机制，当证明不可能修复时，所述修复机制转而激活凋亡。我们在平板中的WIT-oc培养基(5000个细胞/孔)中一式三份铺种的OCI卵巢肿瘤系(P7a、P2a、C2p)和ATCC/ECACC卵巢肿瘤系(ES2和0V90)。次日，将顺钼的连续稀释物添加至该平板。与`药物孵育72小时后，用阿尔玛蓝测定法将活细胞度量为590/530荧光。
[0248]在顺钼对OCI细胞系与ATCC/ECACC细胞系的影响方面存在明显差异。与ATCCC/ECACC系相比，这些药物的导致肿瘤细胞数目下降50%的浓度(LD9tl)在OCI系中高出超过6倍(图7C)。
[0249]因此，与常规的卵巢癌细胞系(ATCC/ECACC)相比，OCI系对作用机制各异的十分不同的三类癌症药物更耐受。
[0250]紫杉醇和顺钼是治疗卵巢癌时常使用的一线药物，因此上文描述结果对于开发更好治疗法是高度有意义的。现存肿瘤细胞系的一个缺点是它们对抗癌药物的高水平灵敏度。这种灵敏度导致药物开发期间的许多“假阳性”结果，即；能够杀死培养下的细胞系的药物被挑选用于进一步前临床和临床开发。然而，当患者中测试时，有效消灭肿瘤细胞系的这些药物中许多证明在临床中证明无效。肿瘤细胞系的药物敏感性与患者之间缺少相关性是快速开发有效癌症治疗法的主要障碍。携带具有OCI样基因表达特征标识的卵巢肿瘤患者的存活:携带具有OCI样基因表达谱的肿瘤的卵巢肿瘤患者比携带具有ATCC样表达谱的肿瘤的卵巢肿瘤患者具有统计显著更差的存活(图17)。这与反应上文描述的体外药物结果一致，在所述结果中OCI系更耐受最常用来治疗卵巢癌患者的药物，如紫杉醇和顺钼。这些结果表明与现存在的肿瘤细胞系相比，OCI系的确提供更多关于患者治疗反应的相关信肩、O[0251]实施例15:除输卵管-卵巢来源之外的肿瘤类型已经在WIT-oc培养基中成功培育。
[0252]从人乳腺癌、胰腺癌、腺样囊性癌、来自肺或来自胃肠道的神经内分泌肿瘤(类癌)取出几份肿瘤样品并且在WIT-oc培养基中测试。本文中所述的方法和培养基使得培养这些肿瘤成为可能(图18)。
[0253]表格
[0254]表1.从不同肿瘤亚型建立的连续卵巢肿瘤细胞系的数目的汇总。该表显示，列出了从原发性实体瘤、恶性腹水或从异体移植肿瘤以及从不同输卵管卵巢亚型建立的原代输卵管卵巢癌细胞系的数目。
[0255]
【权利要求】
1.细胞培养基，或用于制备细胞培养基的试剂盒，其包含: (a)三磷酸腺苷； (b)载体蛋白； (C)胆固醇、亚油酸和硫辛酸； (d)谷胱甘肽； (e)选自次黄嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤和胸苷的核苷酸补救途径前体碱基； (f)磷脂酰乙醇胺； (g)硒； (h)转铁蛋白； (i)三碘甲腺原氨酸； (j)维生素A、维生素C和维生素D ；
(k) Zn、Mg 和 Cu ； (I)增加胞内cAMP的药剂； (m)表皮生长因子(EGF)； (η)氢化可的松； (ο)胰岛素；和` (P)血清。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其还包含腺苷单磷酸。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的细胞培养基，其还包含维生素Ε。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的细胞培养基，其中所述载体蛋白是白蛋白。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的细胞培养基，其中所述核苷酸补救途径前体碱基是黄嘌呤或次黄嘌呤。
6.根据权利要求5所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含黄嘌呤和次黄嘌呤。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的细胞培养基，其还包含维生素Κ3、烟酸或烟酰胺中的至少一种。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的细胞培养基，其中增加胞内cAMP的试剂是霍乱毒素。
9.根据权利要求8所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含10ng/mL和70ng/mL之间的霍乱毒素。
10.根据权利要求9所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含20ng/mL和25ng/mL之间的霍乱毒素。
11.根据权利要求10所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含约20ng/mL的霍乱毒素。
12.根据权利要求10所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含约25ng/mL的霍乱毒素。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含3ng/mL和50ng/mL之间的EGF。
14.根据权利要求13所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含约10ng/mL的EGF。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含.0.005 μ g/mL和1.5 μ g/mL之间的氢化可的松。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含.1.0 μ g/mL和75.0 μ g/mL之间的胰岛素。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含0.2%和.10.0%v/V之间的血清。
18.根据权利要求17所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含1.0%和5.0%ν/ν之间的血清。
19.根据权利要求18所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含1.8%v/v和2%v/v之间的血清。
20.根据权利要求所述19的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含约1.8%v/v的血清。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含.0.15 μ g/mL和0.3 μ g/mL之间的氢化可的松。
22.根据权利要求21所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含约0.15 μ g/mL的氢化可的松。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含.5.0 μ g/mL和50.0 μ g/mL之间的胰岛素。
24.根据权利要求23所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含约15.0 μ g/mL的胰岛素。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的细胞培养基，其还包含雌激素。
26.根据权利要求25所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基以具有与30nM和300nM之间的17-β -雌二醇等同效力的浓度包含雌激素。
27.根据权利要求26所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基以具有与约.100ηΜ17-β-雌二醇等同效力的浓度包含雌激素。
28.根据权利要求24-27中任一项所述的细胞培养基，其中所述雌激素是17-β-雌二醇。
29.根据权利要求1-23中任一项所述的细胞培养基，其中所述培养基基本上不含雌激素。
30.根据权利要求17所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含0.2%ν/ν和5.0%ν/V之间的血清。
31.根据权利要求30所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含0.25%ν/ν和.0.75%ν/ν之间的血清。
32.根据权利要求31所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含约0.5%ν/ν的血清。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含.0.25 μ g/mL和0.50 μ g/mL之间的氢化可的松。
34.根据权利要求33所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含约0.5 μ g/mL的氢化可的松。
35.根据权利要求30-34中任一项所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含.5.0 μ g/mL和50.0 μ g/mL之间的胰岛素。
36.根据权利要求35所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含约20.00 μ g/mL的胰岛素。
37.根据权利要求1-29中任一项所述的细胞培养基，其中所述培养基支持卵巢肿瘤细胞体外增殖至少约15次群体倍增(PD)。
38.根据权利要求1-17和30-36中任一项所述的细胞培养基，其中所述培养基支持卵巢细胞和/或输卵管细胞体外增殖至少约15次群体倍增(PD)。
39.用于制备根据权利要求1-38中任一项所述的细胞培养基的试剂盒，其包括一个或多个包含组分(a)-(k)的第一容器和一个或多个包含组分(l)-(p)和任选地雌激素的第二容器，从而以适宜的比例组合第一容器和第二容器的内容物产生所述细胞培养基。
40.细胞培养基补充物，其中所述补充物包含: (a)增加胞内cAMP的试剂； (b)表皮生长因子(EGF)； (c)氢化可的松； (d)胰岛素； (e)血清；和任选地， (f)雌激素， 其中向基础细胞培养基添加所述补充物产生根据权利要求1-38中任一项所述的细胞培养基。`
41.一种制备根据权利要求1-38中任一项所述的细胞培养基的方法,其包括混合组分(a)-(p)和任选地雌激素。
42.根据权利要求41所述的方法，其中从一个或多个第一容器添加组分(a)-(k)，并且从一个或多个第二容器添加组分(I)-(P)和任选地雌激素。
43.一种用于培养卵巢细胞和输卵管细胞的方法，其包括: (a)从卵巢或输卵管获得卵巢和/或输卵管细胞； (b)在根据权利要求1-17、30-36和38中任一项所述的细胞培养基中培养细胞， 其中所述细胞培养基支持卵巢上皮细胞和输卵管上皮细胞的至少15次群体倍增。
44.一种用于培养肿瘤细胞的方法，其包括: (a)获得肿瘤细胞； (b)在根据权利要求1-17、18-29和37中任一项所述的细胞培养基中培养肿瘤细胞， 其中所述细胞培养基支持所述肿瘤细胞的至少15次群体倍增。
45.根据权利要求44所述的方法，还包括对于前1-5次细胞传代用胰蛋白酶处理培养平板，从而富集癌细胞。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述肿瘤细胞是卵巢癌细胞、人乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、腺样囊性癌细胞和/或来自肺或胃肠道的神经内分泌肿瘤(类癌)细胞。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述肿瘤细胞是卵巢癌细胞。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述卵巢癌细胞从患者的原代实体卵巢组织或腹水获得，或从在动物模型中培育的肿瘤异体移植物获得。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述肿瘤细胞是乳头状浆液性肿瘤细胞、透明细胞肿瘤细胞、癌肉瘤细胞或无性细胞瘤细胞。
50.根据权利要求48所述的方法，其中所述细胞培养基还以与约100ηΜ17-β-雌二醇等效的量包含雌激素，并且所述肿瘤细胞是子宫内膜样肿瘤细胞或粘液性肿瘤细胞。
51.根据权利要求39所述的试剂盒，其中所述培养基支持细胞体外增殖至少15、25或35次群体倍增(PD)。
52.一种组合物，其包含 权利要求1-17、30-36和38中任一项所述的细胞培养基，和 细胞，其中所述细胞是永生化的卵巢细胞和/或输卵管细胞。
53.根据权利要求52所述的组合物，其中所述永生化细胞过量表达端粒酶的催化性亚基。
54.根据权利要求53所述的组合物，其中所述端粒酶的催化性亚基是人端粒酶逆转录酶(hTERT)。
55.根据权利要求43所述的方法，其中所述卵巢细胞是卵巢上皮细胞。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述卵巢上皮细胞源自卵巢表面。
57.根据权利要求43所述的方法，其中所述输卵管细胞是输卵管上皮细胞。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述输卵管上皮细胞源自输卵管的缨饰表面。
59.—种鉴定候选治疗药的方法,包括: (a)根据权利要求43-50所述的方法培养细胞； (b)使细胞与药物接触；以及 (c)测量所述细胞的一个或多个生理特征； 其中调节细胞的一个或多个生理特征的药物是候选治疗药。
60.根据权利要求59所述的方法，还包括在步骤(b)之前，在试验动物中培育步骤(a)的细胞。
61.根据权利要求59和60所述的方法，其中所述细胞是致癌转化的卵巢细胞和/或输卵管细胞。
62.根据权利要求59和60所述的方法，其中所述细胞源自原发性肿瘤。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述原发性肿瘤是卵巢肿瘤。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述卵巢肿瘤是以下的至少一种:乳头状浆液性肿瘤、透明细胞肿瘤、癌肉瘤、无性细胞瘤、子宫内膜样肿瘤或粘液性肿瘤。
65.根据权利要求59-64中任一项所述的方法，其中测量的生理特征包括细胞增殖，并且抑制细胞增殖的药物是候选治疗药。
66.基本上纯化的卵巢细胞培养物，其中所述卵巢细胞过量表达探针集合DOK5、CD47、HS6ST3、DPP6、OSBLP3 ;其中所述培养物包含至少IO3个细胞；并且其中所述细胞能够发生至少14次群体倍增。
67.基本上纯化的输卵管细胞培养物，其中所述输卵管细胞过量表达探针集合STC2、SFRPl、SLC35F3、SHMT2、TMEM164 ;其中所述培养物包含至少IO3个细胞；并且其中所述细胞能够进行至少14次群体倍增。
68.一种培养物，包含其中hTERT已经过量表达的细胞，其中hTERT的过量表达足以使得所述细胞能够进行至少14次群体倍增。
69.根据权利要求66、67或68所述的培养物，其中hTERT的过量表达足以使得所述细胞能够进行至少25次群体倍增。
70.根据权利要求66、67或68所述的培养物，其中hTERT的过量表达足以使得所述细胞能够进行至少35次 群体倍增。
【文档编号】C12N5/09GK103732737SQ201280023104
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年3月23日 优先权日:2011年3月24日
【发明者】T·A·因斯 申请人:怀特黑德生物制剂研究所, 布里格海姆妇女医院公司