修饰型氨基转移酶、其基因以及利用它们的光学活性氨基化合物的制造方法
【专利摘要】本发明提供用于从酮化合物高效地制造作为医药品、农药等的中间体有用的光学活性氨基化合物的方法。通过对来自荧光假单胞菌的氨基转移酶进行修饰，得到与野生型的酶相比，立体选择性、耐热性、对胺化合物的抗性得以提高的具有氨基转移酶活性的多肽、编码该多肽的基因、高表达该基因的转化体。
【专利说明】修饰型氨基转移酶、其基因以及利用它们的光学活性氨基化合物的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及能够通过氨基转移反应、将酮化合物高效地转化为光学活性氨基化合物的酶以及使用了该酶的光学活性氨基化合物的制造方法。所得到的光学活性氨基化合物能够作为医药品或农药等的中间体利用。
【背景技术】
[0002]目前为止已知的氨基转移酶有许多种类，但生成α-氨基酸以外的光学活性氨基化合物的酶的报告例少(非专利文献I)。
[0003]因此，现有的酶中，对于目的化合物的立体选择性不充分、在适于底物的物性的温度条件或pH条件的反应中酶的稳定性低等，工业利用中存在问题的情况较多。
[0004]这样，在针对目的化合物的反应中，如能够提供立体选择性高、稳定性高的氨基转移酶，在光学活性氨基化合物的工业化生产上是有用的。
[0005]现有技术文献
[0006]非专利文献
[0007]非专利文献1:Trends in Biotechnology, 28，324-332 (2010)
【发明内容】
[0008]发明要解决的问题
[0009]本发明的课题在于提供与由序列表的序列编号I记载的氨基酸序列所构成的野生型酶相比，反应性得到提高的修饰型氨基转移酶。还在于提供用于使用该酶、或生产该酶的转化体，从酮化合物高效地制造光学活性氨基化合物的方法。
[0010]解决问题的方法
[0011]本发明的
【发明者】们为了实现上述目的，反复进行各种研究的结果，发现通过在来自荧光假单胞菌KNK08-18的氨基转移酶(由序列编号I所示的氨基酸序列所构成的多肽)中导入变异，能够得到与野生型的酶相比，活性、立体选择性、稳定性、由产物造成的抑制得到改善的氨基转移酶，从而完成了本发明。即，本发明提供以下内容。
[0012]项1.显示出以下⑴至(iii)的性质的多肽:
[0013]⑴与序列表的序列编号I所示的氨基酸序列的序列同一性(sequenceidentity)为 85% 以上，
[0014](?)在氨基供体的存在下，能够进行与7-甲氧基-2-萘满酮作用而生成
(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的反应，
[0015](iii)与由序列表的序列编号I所示的氨基酸序列所构成的氨基转移酶相比较，其反应性更高。
[0016]项2.以下的㈧至(C)中任一项所示的多肽。
[0017](A)由如下序列构成的多肽，所述序列为序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中的选自第 161、420、17、84、171、176、262、302、421、435、29、42、116、153、190、284、209、235、236、408、418、434、442、3、11以及第151位中的I个或多个氨基酸被取代的氨基酸序列，
[0018](B)多肽，其为在序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中的选自161、420、17、84、171、176、262、302、421、435、29、42、116、153、190、284、209、235、236、408、418、434、442、
3、11以及第151位中的I个或多个氨基酸被取代的氨基酸序列中，上述氨基酸部位以外的氨基酸的I个或多个被取代、添加、插入或缺失，并且，该多肽在氨基供体的存在下，能够进行与7-甲氧基-2-萘满酮作用而生成(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的反应，与由序列表的序列编号I所示的氨基酸序列所构成的氨基转移酶相比较，其反应性高，
[0019](C)多肽，其为在序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中的选自161、420、17、84、171、176、262、302、421、435、29、42、116、153、190、284、209、235、236、408、418、434、442、
3、11以及第151位中的I个或多个氨基酸被取代的氨基酸序列中，除去了所述氨基酸部位，相对于序列表的序列编号I所示的氨基酸序列的序列同一性为85%以上，并且，在氨基供体的存在下，该多肽能够进行与7-甲氧基-2-萘满酮作用而生成(S) -7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的反应，与由序列表的序列编号I所示的氨基酸序列构成的氨基转移酶相比较，其反应性更高的多肽。
[0020]项3.在项I或2中记载的多肽，其中，在序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中，导入有选自如下氨基酸取代 群组中的I个或多个氨基酸取代:
[0021]第161位被取代为不带电氨基酸或非极性氨基酸，
[0022]第420位被取代为脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸以及苏氨酸以外的氨基酸，
[0023]第17位被取代为非极性氨基酸，
[0024]第84位被取代为不带电氨基酸，
[0025]第171位被取代为碱性氨基酸，
[0026]第176位被取代为不带电氨基酸，
[0027]第262位被取代为非极性氨基酸，
[0028]第302位被取代为非极性氨基酸，
[0029]第421位被取代为不带电氨基酸，
[0030]第435位被取代为非极性氨基酸，
[0031]第29位被取代为碱性氨基酸，
[0032]第42位被取代为不带电氨基酸，
[0033]第116位被取代为非极性氨基酸，
[0034]第153位被取代为非极性氨基酸，
[0035]第190位被取代为非极性氨基酸，
[0036]第284位被取代为不带电氨基酸，
[0037]第209位被取代为非极性氨基酸，
[0038]第235位被取代为非极性氨基酸，
[0039]第236位被取代为非极性氨基酸，
[0040]第408位被取代为不带电氨基酸，
[0041]第418位被取代为不带电氨基酸，[0042]第434位被取代为非极性氨基酸，
[0043]第442位被取代为非极性氨基酸，
[0044]第3位被取代为碱性氨基酸，
[0045]第11位被取代为不带电氨基酸，以及
[0046]第151位被取代为碱性氨基酸。
[0047]项4.在项I或2中记载的多肽，其中，在序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中，导入有选自如下氨基酸取代群组中的I个或多个氨基酸取代:
[0048]第161位被取代为苏氨酸或缬氨酸，
[0049]第420位被取代为组氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、缬氨酸或色氨酸，
[0050]第17位被取代为异亮氨酸或亮氨酸，
[0051]第84位被取代为半胱氨酸，
[0052]第171位被取代为精氨酸，
[0053]第176位被取代为丝氨酸，
[0054]第262位被取代为缬氨酸，
[0055]第302位被取代为异亮氨酸，
[0056]第421位被取代为苏氨酸，
[0057]第435位被取代为丙氨酸，
[0058]第29位被取代为赖氨酸，
[0059]第42位被取代为酪氨酸，
[0060]第116位被取代为亮氨酸，
[0061]第153位被取代为苯丙氨酸，
[0062]第190位被取代为酪氨酸，
[0063]第284位被取代为异亮氨酸，
[0064]第209位被取代为丙氨酸，
[0065]第235位被取代为缬氨酸，
[0066]第236位被取代为异亮氨酸，
[0067]第408位被取代为苏氨酸，
[0068]第418位被取代为亮氨酸，
[0069]第434位被取代为丙氨酸，
[0070]第442位被取代为缬氨酸，
[0071]第3位被取代为精氨硼酸，
[0072]第11位被取代为甘氨酸，以及
[0073]第151位被取代为组氨酸。
[0074]项5.在项I或2中记载的多肽，其中，在序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中，导入有选自下述(I)~(15)中的任意氨基酸取代:
[0075](I)第161位被取代为不带电氨基酸；第17位被取代为非极性氨基酸；且第420位被取代为组氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，
[0076](2)第161位被取代为不带电氨基酸；且第418位被取代为不带电氨基酸，[0077](3)第161位被取代为不带电氨基酸；第236位被取代为非极性氨基酸；且第442位被取代为非极性氨基酸，
[0078](4)第161位被取代为不带电氨基酸；且第434位被取代为非极性氨基酸，
[0079](5)第11位被取代为不带电氨基酸；第151位被取代为碱性氨基酸；第161位被取代为不带电氨基酸；且第262位被取代为非极性氨基酸、优选取代为缬氨酸，
[0080](6)第161位被取代为不带电氨基酸；第209位被取代为非极性氨基酸；且第235位被取代为非极性氨基酸，
[0081](7)第42位被取代为不带电氨基酸；且第408位被取代为不带电氨基酸，
[0082](8)第17位被取代为非极性氨基酸；且第153位被取代为非极性氨基酸，
[0083](9)第29位被取代为碱性氨基酸；且第262位被取代为非极性氨基酸，
[0084](10)第161位被取代为不带电氨基酸；且第284位被取代为不带电氨基酸，
[0085](11)第3位被取代为碱性氨基酸；第17位被取代为非极性氨基酸；第116位被取代为非极性氨基酸；且第190位被取代为非极性氨基酸，
[0086](12)第84位被取代为不带电氨基酸；且第420位被取代为苏氨酸以外的不带电
氨基酸，
[0087](13)第161位被取代为不带电氨基酸；且第17位被取代为非极性氨基酸，
[0088](14)第161位被取代为不带电氨基酸；且第420位被取代为碱性氨基酸，以及
[0089](15)第17位被取代为非极性氨基酸；且第420位被取代为碱性氨基酸。
[0090]项6.在项I或2中记载的多肽，在序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中，导入有选自下述(16)~(30)中的任意氨基酸取代:
[0091](16)第17位被取代为异亮氨酸；第161位被取代为苏氨酸；且第420位被取代为
组氨酸、
[0092](17)第161位被取代为苏氨酸；且第418位被取代为亮氨酸，
[0093](18)第161位被取代为苏氨酸；且第236位被取代为异亮氨酸；且第442位被取代为缬氨酸，
[0094](19)第161位被取代为苏氨酸；且第434位被取代为丙氨酸，
[0095](20)第11位被取代为甘氨酸；第151位被取代为组氨酸；第161位被取代为苏氨酸；且第262位被取代为缬氨酸，
[0096](21)第161位被取代为苏氨酸；第209位被取代为丙氨酸；且第235位被取代为
缬氨酸，
[0097](22)第42位被取代为酪氨酸；且第408位被取代为苏氨酸，
[0098](23)第17位被取代为亮氨酸；且第153位被取代为苯丙氨酸，
[0099](24)第29位被取代为赖氨酸；且第262位被取代为缬氨酸，
[0100](25)第161位被取代为苏氨酸；且第284位被取代为异亮氨酸，
[0101](26)第3位被取代为精氨酸；第17位被取代为亮氨酸；第116位被取代为亮氨酸；且第190位被取代为酪氨酸，
[0102](27)第84位被取代为半胱氨酸；且第420位被取代为丝氨酸，
[0103](28)第17位被取代为异亮氨酸；且第161位被取代为苏氨酸、
[0104](29)第161位被取代为苏氨酸；且第420位被取代为组氨酸，以及[0105](30)第17位被取代为异亮氨酸；且第420位被取代为组氨酸。
[0106]项7.—种分离得到的DNA，其编码项I~6中任一项中记载的多肽。
[0107]项8.—种载体，其包含项7中记载的DNA。
[0108]项9.一种转化体，其通过项8中记载的载体转化宿主细胞而得到。
[0109]项10.—种光学活性氨基化合物的制造方法，其特征在于，在氨基供体的存在下，使项I~6的任一项中记载的多肽、或项7中记载的转化体和/或其处理物与酮化合物作用。
[0110]项11.在项8中记载的制造方法，其中，上述酮化合物为下述式(I):
[0111][化学式I]
[0112]
【权利要求】
1.一种多肽，其显示出以下(i)至(iii)的性质: (i)与序列表的序列编号I所示的氨基酸序列的序列同一性为85%以上， (?)在氨基供体的存在下，能够进行与7-甲氧基-2-萘满酮作用而生成(S)-7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的反应， (iii)与由序列表的序列编号I所示的氨基酸序列所构成的氨基转移酶相比较，其反应性高。
2.以下的㈧至(C)中任一项所述的多肽: (A)由如下序列构成的多肽，所述序列为序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中的选自第 161、420、17、84、171、176、262、302、421、435、29、42、116、153、190、284、209、235、236、408、418、434、442、3、11以及151位中的I个或多个氨基酸被取代的氨基酸序列， (B)多肽，其为在序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中的选自第161、420、17、84、171、176、262、302、421、435、29、42、116、153、190、284、209、235、236、408、418、434、442、3、11以及151位中的I个或多个氨基酸被取代的氨基酸序列中，所述氨基酸部位以外的氨基酸的I个或多个被取代、添加、插入或缺失，并且，该多肽在氨基供体的存在下，能够进行与7-甲氧基-2-萘满酮作用而生成(S) -7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的反应，与由序列表的序列编号I所示的氨基酸序列所构成的氨基转移酶相比较，其反应性高， (C)多肽，其为在序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中的选自第161、420、17、84、171、176、262、302、421、435、29、42、116、153、190、284、209、235、236、408、418、434、442、3、11以及151位中的I个或多个氨基酸被取代的氨基酸序列中，除去了所述氨基酸部位，相对于序列表的序列编号I所示 的氨基酸序列的序列同一性为85%以上，并且，在氨基供体的存在下，该多肽能够进行与7-甲氧基-2-萘满酮作用而生成(S) -7-甲氧基-2-氨基四氢化萘的反应，与由序列表的序列编号I所示的氨基酸序列所构成的氨基转移酶相比较，其反应性高。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中， 在序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中，导入有选自如下氨基酸取代群组中的I个或多个氨基酸取代: 第161位被取代为不带电氨基酸或非极性氨基酸， 第420位被取代为脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸以及苏氨酸以外的氨基酸， 第17位被取代为非极性氨基酸， 第84位被取代为不带电氨基酸， 第171位被取代为碱性氨基酸， 第176位被取代为不带电氨基酸， 第262位被取代为非极性氨基酸， 第302位被取代为非极性氨基酸， 第421位被取代为不带电氨基酸， 第435位被取代为非极性氨基酸， 第29位被取代为碱性氨基酸， 第42位被取代为不带电氨基酸， 第116位被取代为非极性氨基酸，第153位被取代为非极性氨基酸， 第190位被取代为非极性氨基酸， 第284位被取代为不带电氨基酸， 第209位被取代为非极性氨基酸， 第235位被取代为非极性氨基酸， 第236位被取代为非极性氨基酸， 第408位被取代为不带电氨基酸， 第418位被取代为不带电氨基酸， 第434位被取代为非极性氨基酸， 第442位被取代为非极性氨基酸， 第3位被取代为碱性氨基酸， 第11位被取代为不带电氨基酸，以及 第151位被取代为碱性氨基酸。
4.根据权利要求1或2所述的多肽，其中， 在序列表的序列编号I所示的`氨基酸序列中，导入有选自如下氨基酸取代群组中的I个或多个氨基酸取代: 第161位被取代为苏氨酸或缬氨酸， 第420位被取代为组氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、缬氨酸或色氨酸， 第17位被取代为异亮氨酸或亮氨酸， 第84位被取代为半胱氨酸， 第171位被取代为精氨酸， 第176位被取代为丝氨酸， 第262位被取代为缬氨酸， 第302位被取代为异亮氨酸， 第421位被取代为苏氨酸， 第435位被取代为丙氨酸， 第29位被取代为赖氨酸， 第42位被取代为酪氨酸， 第116位被取代为亮氨酸， 第153位被取代为苯丙氨酸， 第190位被取代为酪氨酸， 第284位被取代为异亮氨酸， 第209位被取代为丙氨酸， 第235位被取代为缬氨酸， 第236位被取代为异亮氨酸， 第408位被取代为苏氨酸， 第418位被取代为亮氨酸， 第434位被取代为丙氨酸，第442位被取代为缬氨酸， 第3位被取代为精氨酸， 第11位被取代为甘氨酸，以及 第151位被取代为组氨酸。
5.根据权利要求1或2所述的多肽，其中， 在序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中，导入有选自下述(I)~(15)中的任意氨基酸取代: (1)第161位被取代为不带电氨基酸；第17位被取代为非极性氨基酸；且第420位被取代为组氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸， (2)第161位被取代为不带电氨基酸；且第418位被取代为不带电氨基酸， (3)第161位被取代为不带电氨基酸；第236位被取代为非极性氨基酸；且第442位被取代为非极性氨基酸， (4)第161位被取代为不带电氨基酸；且第434位被取代为非极性氨基酸， (5)第11位被取代为不带电氨基酸；第151位被取代为碱性氨基酸；第161位被取代为不带电氨基酸；且第262位被取代为非极性氨基酸、优选被取代为缬氨酸， (6)第161位被取代为不带电氨基酸；第209位被取代为非极性氨基酸；且第235位被取代为非极性氨基酸， (7)第42位被取代为不带电氨基酸；且第408位被取代为不带电氨基酸， (8)第17位被取代为非极性氨基酸；且第153位被取代为非极性氨基酸， (9)第29位被取代为碱性氨基酸；且第262位被取代为非极性氨基酸， (10)第161位被取代为不带电氨基酸；且第284位被取代为不带电氨基酸， (11)第3位被取代为碱性氨基酸；第17位被取代为非极性氨基酸；第116位被取代为非极性氨基酸；且第190位被取代为非极性氨基酸， (12)第84位被取代为不带电氨基酸；且第420位被取代为苏氨酸以外的不带电氨基酸， (13)第161位被取代为不带电氨基酸；且第17位被取代为非极性氨基酸， (14)第161位被取代为不带电氨基酸；且第420位被取代为碱性氨基酸，以及 (15)第17位被取代为非极性氨基酸；且第420位被取代为碱性氨基酸。
6.根据权利要求1或2所述的多肽，其中， 在序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中，导入有选自下述(16)~(30)中的任意氨基酸取代: (16)第17位被取代为异亮氨酸；第161位被取代为苏氨酸；且第420位被取代为组氨酸， (17)第161位被取代为苏氨酸；且第418位被取代为亮氨酸， (18)第161位被取代为苏氨酸；且第236位被取代为异亮氨酸；且第442位被取代为缬氨酸， (19)第161位被取代为苏氨酸；且第434位被取代为丙氨酸， (20)第11位被取代为甘氨酸；第151位被取代为组氨酸；第161位被取代为苏氨酸；且第262位被取代为缬氨酸，(21)第161位被取代为苏氨酸；第209位被取代为丙氨酸；且第235位被取代为缬氨酸， (22)第42位被取代为酪氨酸；且第408位被取代为苏氨酸， (23)第17位被取代为亮氨酸；且第153位被取代为苯丙氨酸， (24)第29位被取代为赖氨酸；且第262位被取代为缴氨酸， (25)第161位被取代为苏氨酸；且第284位被取代为异亮氨酸， (26)第3位被取代为精氨酸；第17位被取代为亮氨酸；第116位被取代为亮氨酸；且第190位被取代为酪氨酸， (27)第84位被取代为半胱氨酸；且第420位被取代为丝氨酸， (28)第17位被取代为异亮氨酸；且第161位被取代为苏氨酸， (29)第161位被取代为苏氨酸；且第420位被取代为组氨酸，以及 (30)第17位被取代为异亮氨酸；且第420位被取代为组氨酸。
7.一种分离得到的DNA，其编码权利要求1~6中任一项所述的多肽。
8.一种载体,其包含权利要求7所述的DNA。
9.一种转化体,其通过权利要求8所述的载体转化宿主细胞而得到。
10.一种光学活性氨基化合物的制造方法，其特征在于: 在氨基供体的存在下，使权利要求1~6中任一项所述的多肽、或权利要求7所述的转化体和/或其处理物与酮化合物作用。
11.根据权利要求8所述的制造方法， 所述酮化合物为下述式(I)所示的非对称酮，
12.一种光学活性氨基化合物的制造方法，其特征在于: 在氨基受体的存在下，使权利要求1~6中任一项所述的多肽、或者权利要求7所述的转化体和/或其处理物与氨基化合物的对映体混合物作用。
13.根据权利要求10所述的制造方法，其中， 所述氨基化合物的对映体为下述式(3)所示的对映体混合物，
14.根据权利要求11所述的制造方法，其中， 上述式(I)所示的酮化合物为选自1-萘满酮、2-萘满酮、5-甲氧基-2-萘满酮、6-甲氧基-2-萘满酮、7-甲氧基-2-萘满酮、8-甲氧基-2-萘满酮、1-苄基-3-吡咯烷酮、l-Boc-3-吡咯烷酮、l-Cbz-3-吡咯烷酮、1_苄基_3_哌啶酮、l-Boc_3-哌啶酮、l_Cbz_3_哌啶酮、苯乙酮、3，4-二甲氧基苯基丙酮所构成的群组中的I种以上的酮化合物。
15.根据权利要求13所述的制造方法，其中， 上述式(3)所示的氨基化合物为选自1-氨基四氢化萘、2-氨基四氢化萘、5-甲氧基-2-氨基四氢化萘、6-甲氧基-2-氨基四氢化萘、7-甲氧基-2-氨基四氢化萘、8-甲氧基-2-氨基四氢化萘、1-苄基-3-氨基批咯烧、l-Boc-3-氨基批咯烧、l-Cbz-3-氨基批咯烧、1-苄基_3_氛基喊唳、l-Boc-3-氛基喊唳、l-Cbz-3-氛基喊唳、1_苯乙胺、3，4- 二甲氧基苯异丙胺所构成的群组中的I种以上的氨基化合物。
16.根据权利要求10或11所述的制造方法，其中， 氨基供体为选自1_苯乙胺、2- 丁胺、2-戍胺、2-庚胺、3-庚胺、正乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺、异丙胺、异丁胺、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、3-氨基-1-苯基丁烷、苯甲胺、β -苯乙胺、环己胺以及它们的光学活性体所构成的群组中的I种以上的化合物。
17.根据权利要求12或13所述的制造方法，其中， 氨基受体为丙酮酸或乙醛酸。
18.一种光学活性氨基化合物的制造方法，其特征在于: 其是权利要求10~17中任一项所述的制造方法，且反应温度保持在35°C以上。
【文档编号】C12P41/00GK103534353SQ201280022839
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年3月9日 优先权日:2011年3月11日
【发明者】伊藤纪幸, 川野茂, 八十原良彦 申请人:株式会社钟化