病毒样颗粒及其制备方法

病毒样颗粒及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了由重组番木瓜花叶病毒外壳蛋白和ssRNA制备病毒样颗粒(VLP)的体外方法，其允许以高产率大规模生产VLP。还提供了通过所述体外方法制备的包含ssRNA的VLP。所述VLP可用作佐剂，并且当与抗原融合时用作疫苗。还提供了所述VLP用于刺激先天免疫应答的用途。
【专利说明】病毒样颗粒及其制备方法【技术领域】
[0001]本发明涉及佐剂和免疫调节剂的领域，并且特别地涉及病毒样颗粒(Virus-likeparticle, VLP)及制备VLP的方法。
【背景技术】
[0002]以下专利和专利申请描述了番木瓜花叶病毒(papaya mosaic virus,PapMV)病毒样颗粒(VLP)增强抗原的免疫原性的能力。
[0003]美国专利N0.7,641, 896、加拿大专利申请N0.2，434，000和国际专利申请N0.PCT/CA03/00985 (W02004/004761)描述了 PapMV或来源于PapMV外壳蛋白的VLP用于在动物中加强对抗原的免疫应答的用途。抗原可与PapMV或VLP连接或者它们可与PapMV或VLP组合施用。
[0004]国际专利申请N0.PCT/CA2007/002069 (W02008/058396)描述了基于 PapMV 和PapMV VLP的流感疫苗。疫苗包含PapMV或PapMV VLP和一种或更多种流感抗原，所述抗原可与PapMV或VLP连接或者可与PapMV或VLP组合施用。
[0005]国际专利申请N0.PCT/CA2007/001904(W02008/058369)描述了基于 PapMV 的免疫原性亲和缀合抗原系统。该申请描述了 PapMV外壳蛋白与能够结合目的抗原的多种亲和肽的融合体。
[0006]国际专利申请N0.PCT/CA2008/000154(W02008/089569)描述了基于 PapMV 的对抗伤寒沙门氏菌(S.typhi)和其他肠道菌病原体的疫苗。所述疫苗包含PapMV或PapMV VLP和一种或更多种肠道菌抗原，所述抗原可与PapMV或VLP连接，或者可与PapMV或VLP组合施用。
[0007]国际专利申请 N0.PCT/CA2009/00636 (W02010/012069)描述了包含 PapMV 成分和一种或更多种抗原的多价疫苗，及其提供对抗多种病原体株或对抗多于一种病原体的保护的用途。所述疫苗可任选地包含沙门氏菌属(Salmonella spp.)孔蛋白成分。
[0008]已描述了由经分离的PapMV外壳蛋白制备PapMV VLP。Erickson和Bancroft (1978，Virology, 90:36_46&1978，Virology, 90:47-53)首先描述了通过体外自组装经分离的PapMV外壳蛋白和PapMV RNA来制备PapMV VLP。用于这些实验的PapMV外壳蛋白制备物分离自PapMV并且以蛋白质的聚合形式为主(在3S、14S和25S沉积)，其中的一种或更多种被认为是对于引发VLP形成必不可少的。Sit等(1994, Virology, 199:238-242)的后续研究确立了引发组装需要PapMV基因组的前38至47个核苷酸，并且提出了引发复合也需要14S聚合物种类(species)。
[0009]后来，证明了 PapMV VLP可由在大肠杆菌中表达的PapMV外壳蛋白的单体形式来制备。重组外壳蛋白在细菌细胞中自组装，并且可通过使细胞破裂，然后进行几步纯化步骤(包括去污剂处理)来分离VLP (参见Tremblay等? 2006，FEBS J.，273: 14-25 ;国际专利申请 N0.PCT/CA2007/002069 (W02008/058396)、PCT/CA2007/001904 (W02008/058369) ,PCT/CA2008/000154(W02008/089569)和 PCT/CA2009/00636(W02010/012069))。[0010]提供该背景信息的目的是为了告知本 申请人:认为的可与本发明相关的信息。既未必旨在承认也不应解释为任何以上信息构成针对本发明的现有技术。

【发明内容】

[0011]本发明的一个目的是提供番木瓜花叶病毒样颗粒及用于制备所述病毒样颗粒的方法。根据本发明的一个方面，提供了用于制备病毒样颗粒(VLP)的体外方法，其包括以下步骤:a)在约6.0至约9.0的pH下和约2°C至约37°C的温度下，将蛋白质:RNA比按重量计为约1:1至50:1的重组马铃薯X病毒(potexvirus)外壳蛋白与ssRNA组合足以允许VLP组装的时间山)用核酸酶处理VLP以移除从颗粒中突出的任何RNA ；以及c)将VLP与其他处理成分分尚。
[0012]根据另一个方面，提供了通过根据本发明之方法制备的病毒样颗粒(VLP)。
[0013]根据另一个方面，提供了包含通过根据本发明之方法制备的VLP的药物组合物。
[0014]根据另一个方面，提供了通过根据本发明之方法制备的VLP，其用作佐剂。
[0015]根据另一个方面，提供了通过根据本发明之方法制备的VLP，其用于在对象中刺激先天免疫应答并从而预防对象中的微生物感染或降低其严重程度。
[0016]根据另一个方面，提供了通过根据本发明之方法制备的VLP，其与一种或更多种抗原组合用作疫苗。
[0017]根据另一个方面，提供了通过根据本发明之方法制备的VLP，其用于制备药物。
[0018]根据另一个方面，提供了一种在对象中增强对抗原的免疫应答的方法，其包括向对象施用包含通过根据本发明之方法制备的VLP的佐剂。
`[0019]根据另一个方面，提供了一种在对象中刺激先天免疫应答并从而预防对象中的微生物感染或降低其严重程度的方法，其包括向对象施用通过根据本发明之方法制备的VLP。
[0020]根据另一个方面，提供了一种在对象中刺激免疫应答的方法，其包括向对象施用与一种或更多种抗原组合的通过根据本发明之方法制备的VLP。
[0021]根据本发明的另一个方面，提供了包含重组PapMV外壳蛋白和ssRNA的番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)，其中所述ssRNA的长度为约50个核苷酸至约5000个核苷酸并且其包含对应于SEQ ID NO:5或6所示核酸序列的序列或其片段。
[0022]根据本发明的另一个方面，提供了包含番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)的药物组合物，所述VLP包含重组PapMV外壳蛋白和ssRNA，其中所述ssRNA的长度为约50个核苷酸至约5000个核苷酸并且其包含对应于SEQ ID NO:5或6所示核酸序列的序列或其片段。
[0023]根据本发明的另一个方面，提供了包含重组PapMV外壳蛋白和ssRNA的番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)，其中所述ssRNA的长度为约50个核苷酸至约5000个核苷酸并且其包含对应于SEQ ID NO:5或6所示核酸序列的序列或其片段，所述VLP用作佐剂。
[0024]根据本发明的另一个方面，提供了包含重组PapMV外壳蛋白和ssRNA的番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)，其中所述ssRNA的长度为约50个核苷酸至约5000个核苷酸并且其包含对应于SEQ ID N0:5或6所示核酸序列的序列或其片段，所述VLP用于在对象中刺激先天免疫应答并从而预防对象中的微生物感染或降低其严重程度。[0025]根据本发明的另一个方面，提供了包含重组PapMV外壳蛋白和ssRNA的番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)，其中所述ssRNA的长度为约50个核苷酸至约5000个核苷酸并且其包含对应于SEQ ID N0:5或6所示核酸序列的序列或其片段，所述VLP与一种或更多种抗原组合用作疫苗。
[0026]根据本发明的另一个方面，提供了包含重组PapMV外壳蛋白和ssRNA的番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)，其中所述ssRNA的长度为约50个核苷酸至约5000个核苷酸并且其包含对应于SEQ ID N0:5或6所示核酸序列的序列或其片段，所述VLP用于制备药物。
[0027]根据本发明的另一个方面，提供了一种在对象中增强对抗原的免疫应答的方法，其包括向对象施用包含番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)的佐剂，所述VLP包含重组PapMV外壳蛋白和ssRNA，其中所述ssRNA的长度为约50个核苷酸至约5000个核苷酸并且其包含对应于SEQ ID NO:5或6所示核酸序列的序列或其片段。
[0028]根据本发明的另一个方面，提供了一种在对象中刺激先天免疫应答并从而预防对象中的微生物感染或降低其严重程度的方法,其包括向对象施用包含重组PapMV外壳蛋白和ssRNA的番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)，其中所述ssRNA的长度为约50个核苷酸至约5000个核苷酸并且其包含对应于SEQ ID NO:5或6所示核酸序列的序列或其片段。
[0029]根据本发明的另一个方面，提供了一种在对象中刺激免疫应答的方法，其包括向对象施用与一种或更多种抗原组合的包含重组PapMV外壳蛋白和ssRNA的番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)，其中所述ssRNA的长度为约50个核苷酸至约5000个核苷酸并且其包含对应于SEQ ID NO:5或6所示核酸序列的序列或其片段。
[0030]根据本发明的另一个方面，提供了一种用于制备番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)的体外方法，其包括以下步骤:a)在pH为约6.5至约8.5的缓冲溶液中和约22°C至约37°C的温度下，将蛋白质:RNA比按重量计为约5:1至40:1的重组PapMV外壳蛋白与ssRNA组合足以允许VLP组装的时间，其中所述重组PapMV主要为以小于20-mer的低分子量种类(10w molecular weight species)的形式；b)用核酸酶处理VLP以移除从颗粒中突出的任何RNA ；以及c)将VLP与其他处理成分分离。
【专利附图】

【附图说明】
[0031]本发明的这些和其他特征将从参照附图的以下详述中变得更明显。
[0032]图1示出了(A)野生型PapMV外壳蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和⑶野生型PapMV外壳蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。
[0033]图2示出了 (A)经修饰PapMV外壳蛋白CPAN5的氨基酸序列(SEQ ID NO:3);和(B)经修饰PapMV外壳蛋白PapMV CPsm的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
[0034]图3示出了概括根据本发明的一个实施方案用于制备包含ssRNA之体外组装PapMV VLP的步骤的流程图(rCP=重组PapMV VLP外壳蛋白；SRT=合成RNA模板；rVLP=重组 VLP)。
[0035]图4示出了概括根据本发明的一个实施方案用于制备包含ssRNA之体外组装PapMV VLP的步骤的流程图(缩写如图3 ；prCP=编码rCP的质粒)。[0036]图5示出了概括根据本发明的一个实施方案用于制备包含ssRNA之体外组装PapMV VLP的步骤的流程图(缩写如图4)。
[0037]图6示出了概括根据本发明的一个实施方案用于制备包含ssRNA之体外组装PapMV VLP的步骤的流程图(缩写如图4 ;Ec.prCP=包含编码rCP的质粒的大肠杆菌；Ec.pSRT=包含编码SRT的质粒的大肠杆菌)。
[0038]图7示出了(A)用于根据本发明之方法的一个实施方案的合成RNA模板(SRT)的序列[SEQ ID N0:5]，以及⑶用于根据本发明之方法的另一个实施方案的合成RNA模板(SRT)的序列[SEQ ID NO:6];所有的ATG密码子已突变为TAA终止密码子(粗体)，前16个核苷酸来自于位于pBluescript表达载体中的T7转录起始位点，并且所述序列包含用于rVLP组装的PapMV成核位点((A)中的框中)。
[0039]图8示出了与ssRNA自组装的PapMV VLP⑷和与聚1:C (dsRNA)自组装的PapMVVLP(B)的电子显微图。
[0040]图9示出了证明PapMV VLP诱导控制流感感染的抗病毒应答的结果，⑷描绘用含ssRNA 的 PapMV VLP,60 u g 含聚 1:C 的 PapMV VLP,3 u gssRNA,3u g 聚 1:C 的 PapMV、60 u g的PapMV CP单体或对照缓冲液(Tris HCllOmM pH8)鼻内处理并用200pfu的流感病毒株WSN/33攻击的Balb/C小鼠(每组10只)的重量减轻；⑶示出在感染期间小鼠产生症状的总结(症状:0，无症状。1，轻微竖毛，轻微弯曲后背。2，竖毛，弯曲后背。3，竖毛，弯曲后背，移动困难和轻度脱水。4，竖毛，弯曲后背，移动困难，严重脱水，闭眼以及眼部分泌物)。
[0041]图10 示出了表明用 PapMV VLP (60 U g), Pam3CSK4 (15 U g)或对照缓冲液(TrisHCllOmM pH8)鼻内处理的Balb/C小鼠的支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage)中IP-1O(A)和IL-9⑶的存在的图。每个点对应于每只小鼠中检测到的细胞因子的水平。还示出了存在于小鼠鼻咽灌洗(“LNP”)中的IP-10或IL-9的量。
`[0042]图11示出了表明用PapMV VLP (60 U g)或用对照缓冲液(Tris HCllOmM pH8)鼻内处理一次或两次的Balb/C小鼠的支气`管肺泡灌洗中(A)MIP-1 a、(B)MIP-1 P、(C)MIP_2、(D) KC, (E) TNF- a , (F) RANTES, (G) VEGF, (H)MCP-U (I)IP_10、(J)IL_17、(K)IL_13、(L)IL-12(p70)、(M) IL-9、(N)IL-6、(0) IL-1 a、(P) IL-1 ^ , (Q)GM-CSF 和(R)G-CSF 的存在的图。每个点对应于在每只小鼠中检测到的细胞因子的水平。
[0043]图12 示出了描绘 PapMV VLP ssRNA (100 u g)或 PBS 免疫 24 小时后 C57BL/6、TLR7敲除(KO)、MYD88K0和IRF5/7K0小鼠的DC、CD8+T细胞和B细胞中⑷CD86和⑶CD69表达的编辑图。通过FACS分析结果，并且表示为所分析样品对PBS样品的平均荧光强度(MFI)比。
[0044]图13示出了描绘用PapMV PapMV VLP ssRNA(用抗-BST2抗体处理或不用抗-BST2处理)免疫C57BL/6小鼠24小时后(A)CD69、(B)MHC-1和(C)CD86表达的流式细胞分析的编辑图。***p〈0.001，**p〈0.01，*p〈0.05，NS:不显著。
[0045]图14示出了描绘以下内容的图:(A)通过ELISA对血清中IFN-a产生的动力学的评价；⑶用100 u gPapMV VLP ssRNA免疫后C57BL/6小鼠的脾；以及(C)用100 u gPapMVVLP ssRNA或PBS免疫6小时后C57BL/6小鼠和不同敲除小鼠中血清IFN-a的ELISA定量。
[0046]图15示出了描绘以下内容的图:来自用PapMV VLP ssRNA或PBS免疫24小时后C57BL/6和IFNAR KO小鼠之脾的(A)B淋巴细胞和⑶树突细胞中⑶86、MHC_I和⑶69表达的编辑图；以及(C)PapMV VLPssRNA免疫后不同时间点上C57BL/6和IFNAR KO小鼠血清中对抗PapMV VLP ssRNA的抗体的ELISA定量。
[0047]图16示出了描绘用IOOii gPapMV VLP ssRNA (实心方形)或PBS (空心圆)处理6小时后用2 X IO6PFU LCMV克隆13感染的C57BL/6小鼠血液中LCMv克隆13的病毒动力学的图(滴度以PFU/毫升血液表示；L0D:检测限)。
[0048]图17示出了描绘用2X IO6PFU LCMV克隆13感染15天后C57BL/6和TLR7敲除(KO)小鼠的(A)脾、⑶肾、(C)肝和⑶脑中的病毒滴度的图；小鼠用IOOii g PapMV VLPssRNA、100 ii gR837或PBS处理6小时后进行感染(滴度以PFU/器官表示)。LOD:检测限。
[0049]图18示出了描绘以下内容的图:对分离自用IOOiigPapMV VLPssRNAUOO U gR837或PBS免疫6小时后用2X IO6Pfu LCMV克隆13感染并在感染15天后处死的小鼠的脾细胞进行GP33再刺激之后，产生(A) IFN- y、(B) TNF- a和(C)两种细胞因子的⑶8+T细胞的比例；在GP33再刺激后由CD8+T细胞产生的(D) IFN- y量和(E) TNF- a量，(F)GP33特异性⑶8+T淋巴细胞中I3D-1表达的平均荧光强度(MFI)，以及(G)脾细胞中DbGP33+⑶8+⑶44+的百分比。
[0050]图19示出了描绘用2X IO6PFU LCMV克隆13感染45天后C57BL/6小鼠的(A)脾、(B)肾、(C)脑和(D)肝中的病毒滴度的图；小鼠用IOOiigPapMV VLP ssRNA或PBS处理6小时后进行感染(滴度以PFU/器官表示)。LOD:检测限。
[0051]图20示出了描绘用PapMV VLP ssRNA刺激18小时后人PBMC(CD14+CDllb+细胞群)中CD86表达的流式细胞术分析的示图(MF1:平均荧光强度)。
[0052]图21示出了描绘以2周间隔用2个剂量PapMV VLP ssRNA处理之后用亚致死剂量肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)攻击的小鼠存活的图。
[0053]图22示出了描绘慢性感染LCMV并且(A)在感染后第1、2、3、4和5天，以及(B)仅在感染后第6天和第7天用100 u gPapMV VLP ssRNA静脉内处理(一次/天)的小鼠的病毒载量的图(滴度以PFU/mL表示)。
[0054]图23示出了描绘在如图22所述处理第15天(实验结束)的小鼠不同器官中的病毒滴度的图。
[0055]图24示出了说明以I周间隔用PapMV VLP处理I次(Ix)、2次(2x)、5次(5x)和10次(IOx)并在最后一次处理3天后用流感WSN/33病毒攻击的小鼠重量减轻的图。
[0056]图25示出了显示出用(A)缓冲液和⑶PapMV VLP处理的小鼠的支气管肺泡灌洗(broncho-aleolar lavage,BAL)中发现的细胞(中性粒细胞标有圆圈)的电子显微图，以及(C)描绘BAL中发现的中性粒细胞的数目的图。
[0057]图26示出了描绘在用与三价灭活流感疫苗(TIV)组合之PapMV VLP经鼻内免疫的小鼠血液中测量的IgG和IgG2a滴度的图，(A) 一次免疫后的总IgG滴度，⑶以14天间隔两次免疫后的总IgG滴度，以及(C)两次免疫后测量的IgG2a滴度。
[0058]图27示出了描绘如`图23所述进行免疫的小鼠在两次免疫之后测量的抗体滴度的图，(A)支气管肺泡灌洗(BAL)中的IgA滴度，(B)BAL中的总IgG滴度，和(C)排泄物中的
IgAo
[0059]图28示出了显示出如图26所述进行免疫并在第15天用ILD5tl流感WSN/=33病毒攻击的小鼠重量减轻的图，跟踪重量减轻14天的时间。
[0060]图29示出了说明细菌细胞中产生的PapMV VLP与人单核细胞系(THP-1)中的TLR-2和⑶14相互作用并且该相互作用被对抗TLR-2和⑶14之抗体(Ac)阻断的图。
[0061]图30示出了显示出接种与作为佐剂的不同量PapMV VLP组合的来自流感病毒HlNlA/加利福尼亚/7/2009之10 y gNP的小鼠中IgG2水平的图(与单独的NP(10 u g)相比，*p〈0.05)。
[0062]图31示出了显示出用来自流感病毒HlNlA/加利福尼亚/7/2009之NP单独免疫或与作为佐剂的PapMV VLP混合免疫并且用异源亚型株H1N1WSN/33攻击的小鼠的(A)重量减轻和(B)症状的图。症状如图9所述。
[0063]图32示出了 PapMV sm VLP(“PapMV sm”)和通过根据本发明之方法制备的PapMVVLP( “新PapMV”)对三价流感疫苗(TIV)的佐剂作用的比较，(A)对抗TIV的总IgG的滴度，和⑶对抗TIV的IgG2的滴度。
[0064]发明详述
[0065]本发明提供了由重组PapMV外壳蛋白和ssRNA制备番木瓜花叶病毒(PaMV)病毒样颗粒(VLP)的体外方法，其允许以高产率大规模生产PapMV VLP。
[0066]之前由单体重组PapMV外壳蛋白制备PapMV VLP的方法(如Tremblay等,2006所述，出处同上)允许以VLP形式回收总表达之PapMV外壳蛋白的约20%。在分离自宿主细胞的表达外壳蛋白进行超离心之后，仅保留包含VLP的沉淀，并弃去上清液(包含低分子量形式的PapMV外壳蛋白， 包括单体、二聚体、以及多至20-mer的盘(disc))中剩余的约80%的PapMV外壳蛋白。相反地,本文所述的体外方法使用由宿主细胞中回收的低分子量形式的PapMV外壳蛋白(主要是但不是唯一地，单体)，并且可提供多至约80%的PapMV外壳蛋白转化为VLP。因此，在某些实施方案中，根据本发明的方法导致PapMV外壳蛋白的损失降低3至4倍(并因此，每升细胞培养物得到的VLP产量增加3至4倍)。这样的提高有利于大规模制造并且还降低了生产成本。
[0067]此外，根据本发明的体外方法消除了对去污剂的需要，在Tremblay等(2006，出处同上)所述的方法中，需要去污剂以从以VLP形式分离自细菌细胞的PapMV外壳蛋白中移除LPS。如本领域已知的，去污剂可难以从蛋白质制备物中移除因此残留量可保留在通过之前方法制备的最终VLP制备物中。因此，在某些实施方案中，根据本发明的方法允许制备具有最小批次间变化的VLP。
[0068]虽然多种ssRNA可用于根据本发明的方法，但是在某些实施方案中，使用了合成ssRNA。使用合成序列可例如，允许最终产物的一致性，以及允许操纵序列(如果有必要的话)以使体内转录的可能性最小化。
[0069]本发明的某些实施方案还提供了通过本文所述方法制备的包含ssRNA的PapMVVLP。如本文所述，某些实施方案提供了激活位于核内体中的toll样受体7(TLR-7)和/或刺激干扰素a生产的包含ssRNA的PapMV VLP。相反地，通过在大肠杆菌细胞中自组装产生的PapMV VLP似乎更强地靶向位于免疫细胞表面的TLR-2和⑶14。不受任何具体的理论束缚，认为通过根据本发明之方法制备VLP可允许VLP更有效地进入核内体并与TLR-7相互作用，而在VLP制备中使用去污剂导致了结构改变并且使与细胞表面处TLR-2的相互作用更显著。此外，与通过Tremblay等(2006，出处同上)所述方法制备的PapMV VLP相比，根据本发明之方法制备的包含ssRNA之PapMV VLP倾向于是免疫原性更强且是更有效的佐剂。(参见，例如，实施例19)。
[0070]本发明提供的包含ssRNA之PapMV VLP可用作佐剂以增强抗原(包括商用疫苗)的免疫原性，并且单独用作先天免疫应答的刺激物以提供保护和/或治疗作用。
[0071]定义
[0072]除非另有说明，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员所通常理解的含义。
[0073]本文中使用的术语“约”是指给定值的约+/-10%变化。应理解，这样的变化常常包括在本文所提供的任何给定值中。
[0074]当在本文中术语“包含”不与数量词一起使用时可以表示“一”，但其也符合“一或更多”、“至少一”以及“一或多于一”的含义。
[0075]本文中使用的措辞“包含”(及其语法变体，例如“含”)、“具有”(及其语法变体)、“包括”(及其语法变体)或“含有”(及其语法变体)是包括性的或开放性的并且不排除另外的、未引用的元素或方法步骤。
[0076]本文中使用的“天然的”(如用于指对象)是指对象可在自然中发现的事实。例如，可分离自天然来源并且未在实验室中被人有意地改造的生物体或存在于生物体中的多肽或多核苷酸序列是天然的。
[0077]本文中使用的术语“减弱”、“抑制”、“预防”及其语法变体是指给定参数或事件的可测量降低。
[0078]本文中使用的术语“疫苗”是指在施用于对象时能够产生有益免疫应答的组合物。
[0079]本文中使用的术语“病原体”是指能够在宿主中引起疾病或病症的生物体，包括但不限于细菌、病毒、原生动物、真菌和寄生动物。
[0080]本文中使用的术语“对象”或“患者”是指有治疗需要的动物。
[0081]本文中使用的术语“动物”是指人和非人动物二者，包括但不限于哺乳动物、鸟和鱼，并且包括家畜、农场动物、动物园动物、实验室动物和野生动物，例如牛、猪、马、山羊、绵羊或其他有蹄动物、狗、猫、鸡、鸭、非人灵长类、豚鼠、兔、雪貂、大鼠、仓鼠和小鼠。
[0082]VLP与一种或更多种其他治疗剂“组合”施用旨在包括同时(同步)施用和连续施用。连续施用旨在包括治疗剂和VLP以多种顺序施用于对象，其中治疗剂和VLP施用分隔开限定的时间段，其可以短(例如，几分钟左右)或长(例如，几天或几周左右)。
[0083]在本文中可交换使用的术语“免疫刺激(immune stimulation) ”和“免疫性刺激(immunostimulation) ”是指与动物病原体或疾病无关的分子通过刺激免疫系统和/或改善动物的免疫系统响应于感染或疾病的能力来提供对抗病原体感染或对抗疾病的保护。免疫刺激可具有预防作用、治疗作用或其组合。
[0084]本文中关于核酸或氨基酸序列使用的术语“基本相同”是指，当最佳比对(例如，使用下述方法)时，核酸或氨基酸序列与限定的第二核酸或氨基酸序列(或“参考序列”)共有至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。“基本同一性”可用于指序列(例如全长序列、功能性结构域、编码序列和/或调节序列、启动子和基因组序列)的多种类型和长度。两条氨基酸或核酸序列之间的百分比同一性可以以本领域技术人员技术中的多种方式来确定，例如，使用公开可得的计算机软件，例如Smith Waterman Alignment (Smith, T.F.和M.S.Waterman(1981) J Mol Bioll47:195-7) ;“BestFit” (Smith 和 Waterman, Advancesin Applied Mathematics,482-489(1981)),合并到 GeneMatcher Plus?, Schwarz 和Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence 和 Structure, Dayhof, M.0.编，第 353-358页中;BLAST 程序(基本局部比对检索工具(Altschul, S.F.，ff.Gish, et al.(1990) J MolBiol215:403-10)及其变体，包括 BLAST-2、BLAST-P, BLAST-N、BLAST-X, WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAI^PMegalign(DNASTAR)软件。此外，本领域技术人员可确定用于测量比对的合适参数，包括在待比较序列长度上实现最大比对所需的算法。一般来说，对于氨基酸序列，比较序列的长度为至少10个氨基酸。本领域技术人员会理解，实际长度取决于待比较序列的总长度，并且可以是至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个或至少200个氨基酸，或者其可以是全长的氨基酸序列。对于核酸，比较序列的长度一般是至少25个核苷酸,但可以是至少50个、至少100个、至少125个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少550个或至少600个核苷酸，或者其可以是全长的核苷酸序列。
[0085]术语“对应于”或“相当于”指核酸序列与参考核酸序列的全部或一部分相同。相
比之下，术语“与......互补”在本文中用于指核酸序列与参考核酸序列的互补链的全部
或一部分相同。为了说明，核酸序列“TATAC”对应于参考序列“TATAC”并且与参考序列“GTATA”互补。在本文中术语“对应于”和“相当于”当用于使DNA和RNA序列互相参考时指DNA序列与参考RNA序列的全部或一部分相同(或者反之亦然)，但是，DNA序列在对应于RNA序列中尿嘧啶(U)残基的位置处包含胸腺嘧啶(T)残基。因此，为了说明，DNA序列“TATAC”对应于RNA参考序列“UAUAC”。
[0086]考虑了本文所讨论的任何实施方案可关于本发明的任何方法或组合物实施，并且反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可用于实现本发明的方法。
[0087]用于制备病毒样颗粒的方法
[0088]根据本发明的方法允许在体外组装重组外壳蛋白和ssRNA (本文中称为ssRNA模板或“SRT”)以形成VLP。
[0089]虽然通篇引用PapMV外壳蛋白描述了所述方法，但是本领域技术人员应容易地理解，所述方法同样适用于其他马铃薯X病毒外壳(或衣壳)蛋白。许多马铃薯X病毒的外壳蛋白的序列和基因组在本领域是已知的并且可得自于公共数据库，例如GenBank。
[0090]图3至6提供了本发明方法的一些示例性实施方案。简言之，所述方法包括在中性pH和约2°C至约37°C的温度下，将蛋白质:RNA比按重量计在约1:1与约50:1之间的重组外壳蛋白与SRT组合足以允许VLP形成的时间。随后，用核酸酶处理VLP以从移除从VLP中突出的任何RNA，然后经历一步或更多步纯化步骤以提供最终的重组VLP (例如，参见图3)。所述方法的某些实施方案还包括从表达重组蛋白质的宿主细胞中分离重组蛋白质(例如，参见图4)和/或由质粒DNA制备SRT (例如，参见图5)。
[0091]根据本发明的方法可以扩大规模，并因此，在某些实施方案中，本发明提供了适合于以高产率生产大量VLP的大规模方法。
[0092]PapMV外壳蛋白[0093]用于制备VLP的PapMV外壳蛋白可以是完整的PapMV外壳蛋白或其一部分，或者其可以是野生型PaPMV外壳蛋白的经遗传修饰形式，例如，包含一个或更多个氨基酸缺失、插入、替换等，前提是所述外壳蛋白保留自组装成VLP的能力。野生型PapMV外壳(或衣壳)蛋白的氨基酸序列在本领域中是已知的(参见Sit等，1989，J.Gen.Virol.,70 =2325-2331,和GenBank登记号NP_044334.1)，并且在本文中提供为SEQ ID N0:1(参见图1A)。已知该序列的变体，例如，Noa-Carrazana&SiIva-Rosales (2001, Plant Science, 85:558)所述的PapMV的Mexican分离物之外壳蛋白的序列与SEQ ID NO:1具有88%的同一丨丨生并且可得自于GenBank。PapMV外壳蛋白的核苷酸序列在本领域中也是已知的(参见，Sit等，ibid.,和GenBank登记号NC_001748 (5889至6536位核苷酸))并且在本文中提供为SEQ ID NO:2(参见图1B)。
[0094]如上所述，PapMV外壳蛋白的氨基酸序列不需要精确对应于亲本(野生型)序列，即，其可以是“变体序列”。例如，PapMV外壳蛋白可通过一个或更多个氨基酸残基的替换、插入或缺失来突变，使得该位点的残基不对应于亲本(参考)序列。但是，本领域技术人员将理解，这样的突变将不是广泛的，并且不会大大影响重组PapMV CP组装成VLP的能力。
[0095]因此，本发明还考虑了使用保留多聚和组装成VLP之能力的野生型外壳蛋白的片段(即，“功能性”片段)制备的重组PapMV CP用于所述方法。例如，片段可以包含一个或更多个氨基酸从蛋白质的N-末端、C-末端或内部或其组合缺失。一般来说，功能性片段的长度为至少100个氨基酸，例如，至少150个氨基酸、至少160个氨基酸、至少170个氨基酸、至少180个氨基酸或至少190个氨基酸。在野生型蛋白的N-末端处进行的缺失应一般缺失少于13个氨基酸以保留蛋白质自组装的能力。
[0096]在本发明的某些实施方案中，当重组外壳蛋白包含变体序列时，该变体序列与参考序列具有至少约70%的同一性，例如与参考序列有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约98%的同一性。在某些实施方案中，参考氨基酸序列是SEQ ID NO:`1 (图1A)。
[0097]在本发明的某些实施方案中，用于制备重组PapMV VLP的PapMV外壳蛋白是PapMV外壳蛋白的经遗传修饰(即变体)形式。在一些实施方案中，对PapMV外壳蛋白进行遗传修饰以从蛋白质的N-末端或C-末端缺失氨基酸和/或包含一个或更多个氨基酸替换。在一些实施方案中，对PapMV外壳蛋白进行遗传修饰以从蛋白质的N-末端或C-末端缺失约I至约10个氨基酸，例如约I至约5个氨基酸。
[0098]在某些实施方案中，PapMV外壳蛋白已被遗传修饰以移除接近野生型蛋白质N-末端存在的(即，在SEQ ID NO:1的第I位和6位)两个甲硫氨酸密码子中的一个，并且可以起始翻译。翻译起始密码子中的一个的移除使得产生同源蛋白质群体。可例如通过替换构成该密码子的一个或更多个核苷酸使得该密码子编码除甲硫氨酸以外的氨基酸或者变为无义密码子来移除所选甲硫氨酸密码子。或者，可缺失密码子的全部或一部分，或包含所选密码子的编码蛋白质之核酸的5’区。在本发明的一些实施方案中，对PapMV外壳蛋白进行遗传修饰以从蛋白质的N-末端缺失I至5个氨基酸。在一些实施方案中，经遗传修饰的PapMV外壳蛋白具有与SEQ ID NO:3(图2A)基本相同的氨基酸序列，并且可任选地包含多至6个组氨酸残基的组氨酸标签。在一些实施方案中，对PapMV外壳蛋白进行遗传修饰以在C-末端包括额外的氨基酸(例如，约I至约8个氨基酸)，这是由于在编码核苷酸序列中包含进一个或更多个特异性限制酶位点。在一些实施方案中，PapMV外壳蛋白具有与SEQID NO:4(图2B)基本相同的氨基酸序列(有或没有组氨酸标签)。
[0099]当使用包含一个或更多个氨基酸替换的变体PapMV外壳蛋白序列制备重组PapMVVLP时，这些可以是“保守”替换或“非保守”替换。保守替换涉及用具有相似侧链性质的另一个残基替换一个氨基酸残基。如本领域中已知的，可以根据其侧链的物理化学性质将二十种天然氨基酸分组。合适的组包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸(疏水侧链)；甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺(极性，不带电侧链)；天冬氨酸和谷氨酸(酸性侧链)以及赖氨酸、精氨酸和组氨酸(碱性侧链)。另一组氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸(芳族侧链)。保守替换涉及用来自同组的另一氨基酸替换一个氨基酸。非保守替换涉及用具有不同侧链性质的另一个残基替换一个氨基酸残基，例如用中性或碱性残基替换酸性残基，用酸性或碱性残基替换中性残基，用亲水性残基替换疏水性残基等等。
[0100]在本发明的某些实施方案中，所述变体序列包含一个或更多个非保守替换。将一个氨基酸替换为具有不同性质的另一个氨基酸可以改进所述外壳蛋白的性质。例如，如之前所述，外壳蛋白第128位残基的突变促进蛋白质组装成VLP (Tremblay等.2006,FEBSJ.，273:14-25)。因此，在本发明的一些实施方案中，所述外壳蛋白包含外壳蛋白第128位残基处的突变，其中该位的谷氨酸残基替换为中性残基。在一些实施方案中，第128位处的谷氨酸残基替换为丙氨酸残基。
[0101]已表明用另一个疏水性残基替换野生型PapMV外壳蛋白的F13位处的苯丙氨酸残基导致与使用野生型蛋白质序列相比，表达重组蛋白质时形成较高比例的VLP (Lalibert6_Gagn6 等，2008，FEBSJ.，275:1474-1484)。在本发明的上下文中，认为下述氨基酸残基是适合于在F13位替换的疏水性残基:Ile、Trp、Leu、Val、Met和Tyr。在本发明的一些实施方案中，所述外壳蛋白包含在13位用Ile、Trp、Leu、Val、Met或Tyr替换Phe。在一些实施方案中，所述外壳蛋白包含在13位用Leu或Tyr替换Phe。
[0102]在某些实施方案中，所述外壳蛋白F13位的突变可以与E128位的突变、N-末端的缺失或其组合相组合。`
[0103]同样地，用于制备重组PapMV外壳蛋白的编码PapMV外壳蛋白的核酸序列不需要精确对应于亲本参考序列，而是可通过遗传密码的简并性不同，和/或使得其编码如上所述的变体氨基酸序列。因此，在本发明的某些实施方案中，编码变体外壳蛋白的核酸序列与参考序列具有约70%的同一性，例如，与参考序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%或至少约90%的同一性。在某些实施方案中，参考核酸序列是SEQ ID N0:2(图1B)。
[0104]在某些实施方案中，外壳蛋白是包含与一种或更多种抗原肽融合的PapMV外壳蛋白或其变体的融合蛋白。所述肽可在C端、N端或内部位置处融合，前提是外壳蛋白仍可组装到VLP中(参见，例如，国际专利申请N0.PCT/CA2007/002069(W02008/058396)、PCT/CA2007/001904 (W02008/058369), PCT/CA2008/000154 (W02008/089569)和 PCT/CA2009/00636 (W02010/012069)) ?如以下更详细描述的，抗原肽可来源于病毒、细菌、真菌或其他病原体，或者其可以是变应原(allergen)或肿瘤相关抗原。
[0105]合适的抗原肽的大小可不同，但是一般来说长度在约3个氨基酸与约50个氨基酸之间，例如长度在约3个与约40个氨基酸之间。在一些实施方案中，抗原肽的长度是至少5个、至少6个或至少7个氨基酸，并且长度多至约50、40、35、30、25或20个氨基酸。
[0106]制备重组外壳蛋白
[0107]用于制备PapMV VLP的重组PapMV外壳蛋白可容易地由技术人员通过标准遗传工程技术来制备。遗传改造蛋白质的方法是本领域所公知的(参见，例如Ausubel等(1994&更新)Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, New York),野生型PapMV外壳蛋白的序列也是如此(参见，例如，SEQ ID NO:1和2)。
[0108]例如，编码野生型蛋白质的核酸序列的分离和克隆可使用标准技术实现(参见，例如，Ausubel等，出处同上)。例如，核酸序列可经通过标准技术提取RNA，然后由RNA模板合成cDNA(例如，通过RT-PCR)从PapMV中直接得到。PapMV可通过标准技术由显示出花叶症状的感染植物叶片中纯化。
[0109]然后将编码外壳蛋白的核酸序列直接或在一步或更多步亚克隆步骤之后插入到合适的表达载体中。本领域技术人员应理解，所使用的确切载体对于本发明不是决定性的。合适载体的实例包括但不限于，质粒、曬菌粒(phagemid)、粘粒、曬菌体、杆状病毒、逆转录病毒或DNA病毒。然后可如之前和以下所述来表达和纯化外壳蛋白。一般来说，选择载体和对应的宿主细胞使得重组外壳蛋白在细胞中表达为低分子量种类而不是VLP。在这一点上，适当载体和宿主细胞组合的选择在本领域普通技术人员的能力范围内。
[0110]或者，编码外壳蛋白的核酸序列可通过本领域公知的标准体外定点诱变技术进一步改造成引入一个或更多个突变，如以下所述的那些。突变可通过构成编码序列的适当核苷酸的一个或更多个的缺失、插入、替换、倒置或其组合引入。这可例如通过基于PCR的技术实现，对于所述基于PCR的技术，设计引入一个或更多个核苷酸错配、插入或缺失的引物。突变的存在可通过多种标准技术来验证，例如，通过限制分析或通过DNA测序来验证。
[0111]本领域技术人员应理解，编码外壳蛋白的DNA可以以多种方式变化而不影响所编码蛋白质的活性。例如，DNA序列中的变化可用于根据表达蛋白质的宿主细胞中的密码子偏好性来优化，或者可包括有助于表达的其他序列改变。
[0112]本领域技术人员应理解,表达载体还可包含调节元件,例如有效转录编码衣壳蛋白或融合蛋白的DNA序列所需的转录元件。可合并到载体中的调节元件的实例包括但不限于，启动子、增强子、终止子和多腺苷酸化信号。因此，本发明的某些实施方案提供了包含与编码经遗传改造之外壳蛋白的核酸序列可操作性连接的调节元件。本领域技术人员应理解，合适调节元件的选择取决于为表达经遗传改造之外壳蛋白所选的宿主细胞，并且这样的调节序列可来源于多种来源，包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物或昆虫基因。
[0113]在本发明的上下文中，表达载体可另外地包含有助于纯化所表达蛋白质的异源核酸序列。这样的异源核酸序列的实例包括但不限于，亲和标签(例如，金属亲和标签)、组氨酸标签、亲和素/链霉亲和素编码序列、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)编码序列和生物素编码序列。由异源核酸序列编码的氨基酸可根据本领域已知的方法在使用之前从所表达的外壳蛋白中移除。或者，如果对应于异源核酸序列表达的氨基酸不干扰其到VLP的后续组装，则其可保留在外壳蛋白上。
[0114]在本发明的一个实施方案中，外壳蛋白表达为组氨酸标签化蛋白。组氨酸标签可位于外壳蛋白的羧基端或氨基端。
[0115]可通过本领域已知的多种方法之一将表达载体引入到合适的宿主细胞或组织中。这样的方法在Ausubel等(出处同上)中进行了一般性的描述，并且包括例如，稳定转染或瞬时转染、脂质体转染、电穿孔和用重组病毒载体感染。本领域技术人员应理解，用于表达外壳蛋白的适当宿主细胞的选择取决于所选择的载体。宿主细胞的实例包括但不限于，细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞。所使用的确切宿主细胞对于本发明不是决定性的。外壳蛋白可在原核宿主(例如，大肠杆菌、杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)或枯草杆菌(B.subtilis))中或在真核宿主(例如，酵母属(Saccharomyces)或毕赤酵母属(Pichia)；哺乳动物细胞，例如，C0S、NIH3T3、CH0、BHK，293或HeLa细胞；昆虫细胞或植物细胞)中表达。
[0116]在某些实施方案中，外壳蛋白在大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中表达。
[0117]如果期望，则外壳蛋白可通过本领域已知的标准技术从宿主细胞中纯化(参见，例如，Current Protocols in Protein Science, Coligan, J.E.等编,ffiley&Sons, NewYork, NY)并且通过标准肽测序技术使用完整蛋白质或其蛋白水解片段进行测序以确定蛋白质的身份。
[0118]ssRNA 模板
[0119]用于根据本发明的方法的ssRNA模板可以是例如，合成ssRNA、天然ssRNA、经修饰的天然ssRNA、天然或合成ssRNA的片段等。
[0120]通常，用于体外组装的ssRNA的长度是至少约50个核苷酸，并且长度多至约5000个核苷酸，例如长度为至少约100、250、300、350、400、450或500个核苷酸并且长度多至约5000,4500,4000或3500个核苷酸。在某些实施方案中，用于体外组装的ssRNA的长度在约500与约3000个核苷酸 之间，例如长度在约1000与约3000个核苷酸之间，或长度在约1200与约2800个核苷酸之间。
[0121 ] 在某些实施方案中，设计ssRNA模板使得其不包含任何ATG (AUG)起始密码子以使体内转录序列的机会最小化。但是，不排除使用包含ATG起始密码子的ssRNA模板，原因是如果ssRNA未加帽，则体内转录仍然不太可能。
[0122]在某些实施方案中，用于体外组装的ssRNA包含来自天然PapMV RNA5’末端的约38至约100个核苷酸，其包含至少部分假定包装信号。不包含假定包装信号的ssRNA模板也可用于某些实施方案。图7中提供了基于可用于产生ssRNA模板的PapMV基因组的序列的非限制性实例[SEQ ID NO:5和6]。在本发明的某些实施方案中也考虑了用于产生ssRNA模板的这些序列的片段，以及多至5000个核苷酸的延长形式。在某些实施方案中，用于体外组装的ssRNA包含对应于SEQ ID NO:5核苷酸17至54的序列。在某些实施方案中，用于体外组装的ssRNA包含对应于SEQ ID NO:5核苷酸17至63的序列。
[0123]还已知富含A和C核苷酸的ssRNA序列与PapMV外壳蛋白组装(Sit，等，1994，Virology，-199:238-242)。因此，在某些实施方案中，ssRNA是富含A和/或C的序列，包括聚A和聚C ssRNA模板。在一些实施方案中，还考虑了基于其他马铃薯X病毒(例如马铃薯病毒X (PVX)、三叶草黄花叶病毒(CYMV)、马铃薯黄斑花叶病毒(PAMV)和锦葵花叶病毒(MaMV))之序列的全部或一部分的ssRNA模板用于所述方法。
[0124]制备ssRNA模板
[0125]可通过本领域已知的标准技术分离和/或制备ssRNA模板(参见，例如，Ausubel等(1994& 更新)Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons-NewYork)。
[0126]例如，对于合成ssRNA，可将编码ssRNA模板的序列插入到可用于转化适当宿主细胞的合适质粒中。在适当细胞培养条件下培养转化宿主细胞之后，可通过标准分子生物学技术从细胞培养物中纯化质粒DNA并通过限制酶消化进行线性化(linearized)。
[0127]然后使用合适的RNA聚合酶转录ssRNA并通过标准方案纯化转录产物。
[0128]本领域技术人员应理解，所使用的确切质粒对于本发明不是决定性的，前提是其能够实现其期望目的。同样地，所使用的具体宿主细胞也不是决定性的，前提是其能够使所选质粒扩增。
[0129]也可使用标准技术通过化学方法合成较短的ssRNA模板。多种商业RNA合成服务也是可获得的。
[0130]可在使用之前任选地对最终的ssRNA模板进行灭菌。[0131]体外组装VLP
[0132]使用所制备的重组外壳蛋白和ssRNA模板在体外进行组装反应。虽然在组装之前通常对重组衣壳蛋白和ssRNA模板进行纯化，但是在一些实施方案中也考虑了使用粗制备物或经部分纯化的外壳蛋白和/或ssRNA模板。
[0133]一般来说，在组装反应中采用具有相同氨基酸序列的重组外壳蛋白的制备物，使得最终的VLP在组装后包含相同的外壳蛋白亚基。在一些实施方案中也考虑了使用包含具有不同氨基酸序列的多种重组外壳蛋白的制备物，使得最终的VLP在组装后包含其外壳蛋白亚基的变化。
[0134]用于组装反应的重组外壳蛋白以低分子量种类的形式为主，所述低分子量种类主要由单体和二聚体组成，但是也包括小于20-mer的其他低分子量种类。在本发明的上下文中，当制备物所含外壳蛋白的至少约70%以低分子量种类存在时，则认为重组外壳蛋白制备物以低分子量种类的形式为主。在某些实施方案中，用于组装反应的重组外壳蛋白制备物中至少约75%、80%、85%、90%或95%的外壳蛋白以低分子量种类存在。在本发明的某些实施方案中，重组外壳蛋白制备物由至少约50 %的单体和二聚体构成，例如由约60 %、70%、75%或80%的单体和二聚体构成。
[0135]组装反应在中性水溶液中进行并且不需要任何其他的特定离子。通常，使用缓冲溶液。pH应在约pH6.0至约pH9.0的范围中，例如，在约pH6.5与约pH9.0之间，在约pH7.0至约pH9.0之间，在约pH6.0至约pH8.5之间，在约pH6.5至约pH8.5之间或在约pH7.0至约pH8.5之间。
[0136]缓冲液的性质对于本发明不是决定性的，前提是其可将pH维持在上述范围中。用于上述pH范围的缓冲液的实例包括但不限于，Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。
[0137]高浓度氯化钠(NaCl)的存在可影响PapMV外壳蛋白的组装。因此，在某些实施方案中，组装反应在基本不含NaCl的溶液中进行，例如在包含小于0.05M NaCl的溶液中进行。
[0138]组装反应可使用多种蛋白质:ssRNA比进行。一般来说，可使用按重量计在约1:1与约50:1之间(例如按重量计在至少约1:1、2:1、3:1、4:1或5:1并且不多于按重量计约50:1,40:1或30:1)的蛋白质:ssRNA比。在某些实施方案中，用于组装反应的蛋白质:ssRNA比按重量计在约5:1与约40:1之间或约10:1与约40:1之间。
[0139]组装反应可在约2°C至约37°C之间的不同温度下进行，例如，至少约:TC、4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C或10°C与约37°C、35°C、30°C或28°C之间。在某些实施方案中，组装反应在约15°C与约37°C之间的温度下进行，例如，约20°C与约37°C之间或约22°C至约
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[0140]使组装反应进行足够的时间以使得VLP形成。时间根据所采用重组外壳蛋白和ssRNA的浓度以及反应的温度而不同，并且可由技术人员容易地确定。通常，采用至少约60分钟的时间。如果需要，可通过标准技术例如动态光散射或电子显微镜来监测外壳蛋白至VLP的组装。
[0141]在使组装反应进行适当长的时间后，使VLP经历“平端化(blunting)”步骤以移除从颗粒中突出(protruding)的RNA。平端化反应使用能够切割RNA的核酸酶实现。多种核酸酶是可商购的并且其使用条件在本领域中是已知的。
[0142]组装后就可通过标准技术(例如透析、渗滤(diafiItration)或色谱)从其他反应成分中纯化VLP。
[0143]在纯化步骤之前或之后，可任选地通过例如超离心或渗滤浓缩(或富集)VLP制备物。如果期望，可使用标准技术例如电子显微镜观察VLP。重组VLP的特征
[0144]组装后，PapMV VLP各包含长螺旋状阵列的外壳蛋白亚基。野生型病毒包含超过1200个外壳蛋白亚基并且长度为约500nm。通过根据本发明之方法制备的重组PapMV VLP可具有类似的大小，或者可比野生型病毒更短或更长。在本发明的某些实施方案中，重组PapMV VLP包含至少40个外壳蛋白亚基。在一些实施方案中，重组PapMV VLP可包含约40至约1600个外壳蛋白亚基，但是，也考虑`了包含更多数目外壳蛋白的VLP。重组PapMV VLP通常宽约10至20nm并且长度在约40nm与几百nm之间。在某些实施方案中，重组PapMVVLP的制备物的平均长度在约40nm与`约600nm之间，例如，在约40nm与约500nm之间，在约40nm与约400nm之间或在约40nm与约300nm之间。
[0145]重组PapMV VLP是稳定的并且可容易地储存在室温下。当在更低温度下(例如，在约2°C与约8°C之间)储存时，重组PapMV VLP在至少几个月并且多至几年中是稳定的。
[0146]重组VLP的方法和用途
[0147]本发明提供了重组PapMV VLP的多种应用和用途。例如，重组PapMV VLP可用作佐剂以增强抗原的免疫原性，或者当与抗原融合时用作疫苗。在某些实施方案中，PapMV VLP可单独用于在对象中刺激先天免疫应答，并从而治疗或预防感染。因此，用于制备药物(包括疫苗和/或药物组合物)的重组PapMV VLP的用途也在本发明的范围中。
[0148]可用根据本发明的疫苗治疗或预防的疾病和病症的实例包括，例如传染病(例如病毒或细菌疾病)、变态反应、免疫疾病和癌症。
[0149]适合于与PapMV VLP—起使用或与重组PapMV外壳蛋白融合的抗原可以是与多种疾病或病症相关的抗原。多种这样的抗原在本领域中是已知的。基于例如VLP的期望最终用途(例如，其待对抗的疾病或病症和/或其待施用于的动物)，本领域技术人员可容易地选择适当的抗原。
[0150]例如，抗原可来源于能够在动物中引起疾病或病症(例如癌症、传染病、变态反应或自身免疫病)的物质(agent)，或者其可以是适用于诱导对抗药物、激素或毒素相关疾病或病症的免疫应答的抗原。抗原可来源于本领域已知的病原体，例如，细菌、病毒、原生动物、真菌、寄生动物或传染性颗粒(例如朊病毒)，或者其可以是肿瘤相关抗原、自身抗原或变应原。
[0151]在某些实施方案中，PapMV VLP与可商购疫苗组合使用以增强疫苗的效力。
[0152]可用的抗原包括病毒抗原，例如来源于以下家族的成员:腺病毒科(Adenoviradae);沙粒病毒科(Arenaviridae)(例如，Ippy 病毒和 Lassa 病毒)；双 RNA 病毒科(Birnaviridae);布尼亚病毒科(Bunyaviridae);杯状病毒科(Caliciviridae);冠状病毒科(Coronaviridae);丝状病毒科(Filoviridae);黄病毒科(Flaviviridae)(例如，黄热病病毒、登革热病毒和丙型肝炎病毒)；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviradae)(例如，乙型肝炎病毒)；疱疫病毒科(Herpesviradae)(例如，人单纯疱疫病毒I);正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，甲型、乙型和丙型流感病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如，腿腺炎病毒、麻疫病毒和呼吸道合胞病毒)^hRNA病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒和甲型肝炎病毒)；痘病毒科(Poxviridae);呼肠孤病毒科(Reoviridae);逆转录病毒科(Retroviradae)(例如，BLV-HTLV逆转录病毒、HIV_1、HIV_2、牛免疫缺陷病毒和猫免疫缺陷病毒)；弹状病毒科(Rhabodoviridae)(例如，狂犬病病毒)和披膜病毒科(Togaviridae)(例如，风疹病毒)。在一个实施方案中，重组PapMV CP包含来源于主要病毒病原体的一种或更多种抗原性肽，所述病毒病原体例如登革病毒、多种肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、多种流感病毒、西尼罗病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、狂犬病病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、ElB病毒(Epstein Barr virus, EBV)、多瘤病毒或SARS冠状病毒。
[0153]可用的抗原也可来源于非常规病毒或病毒样物质，例如库鲁病、克雅二氏症(CJD)、痒病(scrapie)、貂传染性脑病和慢性消耗性疾病的致病物质；或者来源于如本领域已知的传染性蛋白性颗粒，例如与疯牛病有关的朊病毒。
[0154]可用的细菌抗原包括例如，表面细菌抗原成分(superficial bacterialantigenic component)、蛋白性荚膜抗原或鞭毛成分，并且可得自于或来源于作为疾病原因的已知致病物质，所述疾病例如白喉、百日咳、破伤风、肺结核、细菌性肺炎、真菌性肺炎、霍乱、伤寒、瘟疫、志贺氏菌病、沙门氏菌病、军团病(Legionnaire’s disease)、莱姆病、麻风病、痕疾、钩虫病、盘尾丝虫病、血吸虫病、椎体虫病(trypamasomialsis)、利什曼病、贾弟虫病(giardia)、阿米巴病、丝虫病、包柔氏螺旋体病(borrelia)和毛线虫病。
[0155]可用的肿瘤相关抗原包括，例如，Her2(乳腺癌)；OT2(成神经细胞瘤)；EGF_R (恶性成胶质细胞瘤)；CEA(甲状腺髓样癌)；CD52(白血病)；人黑素瘤蛋白质gplOO ;人黑素瘤蛋白质melan-A/MART-1 ；NA17-A nt蛋白；p53蛋白；多种MAGE (黑素瘤相关抗原E)，包括 MAGE1、MAGE2、MAGE3 (HLA-A1 肽)和 MAGE4 ;多种酪氨酸酶(HLA-A2 肽);突变 ras ；p97黑素瘤抗原；与晚期癌症相关的Ras肽和p53肽；与宫颈癌相关的HPV16/18和E6/E7抗原；与乳腺癌相关的MUCl-KLH抗原；与结直肠癌相关的CEA(癌胚抗原)；与肺癌相关的DKK-1 (Dickkopf-1蛋白)和与前列腺癌相关的PSA抗原。
`[0156]可用的变应原包括，例如，来源于花粉、动物皮屑、草、霉、灰尘、抗生素、针刺昆虫毒液的变应原以及多种环境、药物和食物变应原。常见的树变应原包括来自棉白杨(cottonwood)、杨树(popular)、白腊木(ash)、桦树(birch)、枫树、橡树、榆树(elm)、山核桃(hickory)和美洲山核桃(pecan)树的花粉。常见的植物变应原包括来自黑麦、豚草、英国车前草(English plantain)、酸模(sorrel-dock)和藜(pigweed)的变应原，并且植物接触变应原包括来自毒栎、毒叶藤和荨麻的变应原。常见的草变应原包括梯牧草(Timothy)、约翰逊草(Johnson)、百慕大草(Bermuda)、牛毛草和兰草的那些变应原。常见的变应原也可得自于霉或真菌，例如交链格孢属(Alternaria)、镰刀菌属(Fusarium)、着色芽生菌属(Hormodendrum)、曲霉属(Aspergillus)、小多抱菌属(Micropolyspora)、毛霉菌属(Mucor)和嗜热放线菌(thermophilic actinomycetes)。表皮变应原可得自于室内或有机灰尘(通常来源是真菌)；得自于昆虫，例如室内螨虫(尘螨，dermatphagoidespterosinyssis);或者来自于动物来源，例如羽毛和猫狗皮屑。常见的食物变应原包括乳和奶酪(乳制品)、蛋、小麦、坚果(例如，花生)、海鲜(例如，贝)、豌豆、豆和麸质变应原。常见的昆虫变应原包括蜜蜂、大黄蜂、胡蜂和蚂蚁毒液，以及蟑螂盖(cockroach calyx)变应原。
[0157]在某些实施方案中，本发明提供了 PapMV VLP在对象中刺激先天免疫应答的用途。对象可以是人或非人动物。如本文所述，PapMV VLP可用于例如治疗或预防感染,包括慢性感染(还参照，2012年5月I日提交的国际专利申请N0.— “Papaya Mosaic VirusCompositions and Uses Thereof for Stimulation of the Innate Immune Response, ”,其通过引用整体并入本文)。
[0158]在某些实施方案中，本发明提供了 PapMV VLP刺激先天免疫应答并从而保护对象免于病原体的潜在感染的用途。根据本发明的某些实施方案，PapMV VLP通过鼻内或肺部途径施用并且在粘膜内和/或呼吸系统中引发保护性作用。在本发明的多个实施方案中，病原体是病毒病原体、细菌病原体或真菌病原体中的一种或更多种。
[0159]在一些实施方案中，向对象施用PapMV VLP作为保护免于病原体感染的预防性或预先性性(pre-emptive)措施。这样的途径可用于,例如免疫功能不全患者(例如，患AIDS的患者、化疗的患者或服用免疫抑制药的患者)中，在大流行或流行中以在开发/分配适当疫苗之前提供对群体的初始保护，以保护进入潜在感染区域的工作人员(例如救援人员、医生和护士)，以及在具有生物恐怖袭击的威胁或发生生物恐怖袭击的情况下。
[0160]在某些实施方案中，可以在竞赛环境下向非人动物施用PapMV VLP作为保护免于感染的预先性的措施，所述竞赛环境例如，赛马、狗展、猫展等。在某些实施方案中也考虑了在大流行/流行情况下向牲畜施用PapMV VLP。
[0161]在某些实施方案中，PapMV VLP可用于治疗感染，例如，病毒病原体、细菌病原体或真菌病原体的感染，包括慢性感染，例如HIV和HCV。在一些实施方案中，PapMV组合物可用于治疗粘膜表面的感染，例如肺、肠或泌尿生殖器系统中的粘膜表面的感染。
[0162]在某些实施方案中，PapMV VLP可通过肺途径施用于肺癌患者以刺激肺中先天免疫应答的抗肿瘤活性。
[0163]在某些实施方案中，PapMV VLP用作粘膜佐剂以刺激黏膜免疫应答并从而提高对肠、泌尿生殖道和其他粘膜表面(包括肺)的感染和疾病的保护。
[0164]药物组合物
[0165][155]在某些实施方案中，本发明提供了包含有效量PapMV VLP以及一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。如期望，组合物中可包含其他活性成分，例如，额外的免疫刺激化合物、标准治疗剂、疫苗等。
[0166][156]药物组合物可配制用于通过多种途径施用。例如，组合物可配制用于经口、局部(topical)、直肠、经鼻或胃肠外施用或者用于通过吸入或喷雾施用。本文中使用的术语胃肠外包括皮下注射、静脉内、肌内、鞘内、胸骨内注射或输注技术。向对象鼻内施用包括向对象之鼻道或鼻腔的黏膜施用组合物。
[0167][157]在一些实施方案中，药物组合物配制用于黏膜施用。黏膜施用可包括例如经口、鼻内、气溶胶、经直肠或阴道施用。黏膜施用的制剂可包括保留在黏膜部位的透皮器械、气溶胶、乳膏、洗剂或粉末。在某些实施方案中，药物组合物配制成用于鼻内或肺部施用。在一些实施方案中，药物组合物配制成用于经直肠或阴道施用。
[0168][158]配制成水性悬液的组合物可包含与一种或更多种合适赋形剂相混合的PapMV VLP,例如，与助悬剂、分散剂或润湿剂相混合，所述助悬剂例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基-P -环糊精、黄蓍胶和阿拉伯胶，所述分散剂或润湿剂例如有天然磷脂如卵磷脂，或环氧烧(alkylene oxide)与脂肪酸的缩合产物如硬脂酸聚氧乙烯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物如十七碳乙烯氧基鲸蜡醇，或环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的缩合产物，如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的缩合产物，如聚乙烯山梨醇酐单油酸酯。水性混悬剂还可包含一种或更多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)、一种或更多种着色剂、一种或更多种调味剂或者一种或更多种甜味剂(例如，蔗糖或糖精)。
[0169][159]在某些实施方案中，可通过将PapMV VLP悬浮于植物油(例如，花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如，液体石蜡)中将药物组合物配制成油性混悬剂。油性混悬剂可包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。这些组合物可通过添加抗氧化剂如抗坏血酸保存。
[0170][160] 在某些实施方案中，药物组合物可配制成可分散粉末或颗粒，其随后可通过添加水来用于制备水性悬液。这样的可分散粉末或颗粒提供与一种或更多种分散或润湿剂、助悬剂和/或防腐剂混合的PapMV VLP0合适的分散或润湿剂以及助悬剂已经通过上文提到的那些进行了示例。这些组合物中还可包含另外的赋形剂，例如着色剂。
[0171][161]在一些实施方案中，本发明的药物组合物可配制成水包油乳剂。油相可以是植物油如橄榄油或花生油或者矿物油如液体石腊，或者油相可以是这些油的混合物。这些组合物中包含的合适乳化剂包括天然树胶，例如阿拉伯胶或黄蓍胶；天然磷脂，例如大豆，卵磷脂；或由脂肪酸和己糖醇、酐衍生的酯或偏酯，例如山梨醇酐单油酸酯，以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。
[0172][162]在某些实施方案中，所述药物组合物可根据本领域中已知的方法并使用一种或更多种合适分散剂或润湿剂和/或助悬剂(例如上文提到的那些)配制成无菌可注射水性或油性悬液。所述无菌可注射制剂可以是非毒性的胃肠外可接受稀释剂或溶剂如1，3-丁二醇的溶液中的无菌可注射的溶液或悬液。可使用的可接受载剂和溶剂包括但不限于水、林格氏液、乳酸林格氏液和等渗氯化钠溶液。另一些实例包括无菌固定油(其通常用作溶剂或助悬介质)和各种温和固定油，包括例如合成甘油一酯或甘油二酯。在可注射剂的制备中还可使用脂肪酸，例如油酸。[0173][163]任选地，药物组合物可包含防腐剂(例如抗微生物剂)、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体和/或稳定剂，例如与合适缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)一起的碳水化合物(例如，山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖或葡聚糖)、蛋白质(例如，白蛋白或酪蛋白)或含蛋白质的试剂(例如，牛血清或脱脂乳)。可根据周知的参数调节组合物的PH和多种成分的确切浓度。
[0174][164]可通过例如将所需量的PapMV VLP引入到具有上文列举的多种其他成分的合适溶剂中之后无菌过滤来制备无菌组合物。通常，通过将多种无菌活性成分引入到包含基础分散介质和所需的其他成分(来自上文列举的那些)的无菌载剂中来制备分散体。对于制备无菌组合物的无菌粉末，一些示例的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术从之前的无菌过滤溶液产生活性成分和任何其他期望成分的粉末。
[0175][165]考虑在本发明的某些实施方案中使用设计用于肺部或鼻内递送治疗性产品的多种机械装置，包括但不限于雾化器、定量吸入器、粉末吸入器和鼻喷雾装置，其全部都是本领域技术人员熟悉的。
[0176][166]定量吸入器通常使用抛射剂气体并且在吸入的过程中需要驱动。干粉吸入器使用呼吸驱动的混合粉末。雾化器由溶液产生气溶胶，而定量吸入器、干粉吸入器等产生小颗粒气溶胶。
[0177][167]市售机械装置的一些特定实例包括ULTRAVENT?雾化器(Mailinckrodt, Inc., St.Louis, M0.)、ACORN雾化器(Marquest MedicalProducts, Englewood, Col0.)、MISTY-NEB? 雾化器(Allegiance, McGraw Park,111.) > AEROECL1PSE? 雾化器(Trudell Medical International, Canada)、Accuspray? 鼻喷雾装置(Becton Dickinson)、Mucosal Atomization 装置(MAD300)(Wolfe Tory Medical)、OptiNose 装置(OptiNose, Oslo, Norway)、Nektar DPI 系统(Nektar Therapeutics, Inc., San Carlos, Calif.)、AERx 肺部药物递送系统(AradigmCorporation,Hayward,Calif.) 、Spiros? 装置 (Dura Pharmaceuticals) 和 Respimat?装置(Boehringer Ingelheim)。
[0178][168]所有这些装置需要使用适于分散PapMV VLP的制剂。通常，如本领域技术人员将理解的，每一种制剂是所使用装置类型特异的，并且除了可用于治疗的常用稀释剂、佐剂和/或载体外可涉及使用合适的抛射剂材料。另外，考虑了使用脂质体、微囊或微球、包合络合物(inclusion complex)或其他类型的载体。
[0179][169]在本发明的某些实施方案中，药物组合物为鼻内施用的，因此组合物配制成鼻用凝胶、乳膏、糊剂或软膏剂，其提供与鼻粘膜表面更持久的接触。这些制剂的粘度通常为约10至约250，000厘泊(cp)，例如约2500至约100，000cp、或约5，000至50，OOOcp。这样的制剂可基于例如烷基纤维素和/或本领域中周知的其他高粘度的生物相容性载体。烷基纤维素的非限制性实例是甲基纤维素，其可以以合适的浓度被包含在内，例如每100ml载体约5mg至约1000mg,或每100ml载体约25mg至约mg。在某些实施方案中，包含PapMVVLP的载体可以浸入到可施加到鼻粘膜表面的合适的基底(例如织物材料，如纱布)中以允许PapMV VLP渗透进入粘膜。
[0180][170]在某些实施方案中，凝胶制剂还可包含渗透促进剂(穿透促进剂)。渗透促进剂包括但不限于亚砜，例如二甲基亚砜和癸基甲基亚砜；表面活性剂，例如月桂酸钠、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲溴化胺、苯扎氯铵、泊洛沙姆(231，182，184) ,Tween(20,40,60,80)和卵磷脂；1_取代的氮杂环庚-2-酮，尤其是1-正十二烷基氮杂环庚-2-酮；脂肪醇，例如月桂醇、肉豆蘧醇、油醇等；脂肪酸，例如月桂酸、油酸和戊酸；脂肪酸酯，例如肉豆蘧酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、丙酸甲酯和油酸乙酯；多元醇及其酯，例如丙二醇、乙二醇、甘油、丁二醇、聚乙二醇和聚乙二醇单月桂醇酯；酰胺及其他含氮化合物，例如尿素、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)、2_吡咯烷酮、1-甲基-2吡咯烷酮、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺、萜烯；烷酮(alkanone)和有机酸，尤其是水杨酸和水杨酸盐/酯、柠檬酸和琥珀酸。渗透促进剂的存在量可以是约0.1%至约30% w/w。凝胶组合物还可包含缓冲剂，例如，碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、盐酸、乳酸、酒石酸、无机碱和有机碱。如本领域技术人员已知的，根据所使用的缓冲剂的类型，缓冲剂的存在浓度可以为约I至约10重量百分比，例如，约2至约5重量百分比。但是，缓冲剂的浓度可以不同，在一些实施方案中，缓冲剂可以代替组合物中多至100%的水量。
[0181][171]在本发明的某些实施方案中，药物组合物被配制成经直肠或阴道施用，并且可作为栓剂存在，其可通过将活性成分与一种或更多种合适的无刺激性赋形剂或载体混合来制备。所述赋形剂或载体的非限制性实例包括可可豆脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐/酯，它们在室温下是固体，但是在体温下是液体，因此在直肠或阴道腔内融化并且释放出活性成分。本发明适合经阴道施用的制剂还包括含本领域中已知合适的载体的阴道栓(pessary)、塞(tampon)、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂。
[0182][172]本发明还包括包含与市售疫苗组合的PapMV VLP的药物组合物。
[0183][173]其他药物组合物和制备药物组合物的方法是本领域中已知的，并且描述在例如 “Remington:The Science and Practice of Pharmacy(原名 “RemingtonsPharmaceutical Sciences，，)；Gennaro, A., Lipp incott, Willi am s&ffilkins,Philadelphia, PA(2000)中。
[0184]试剂盒
`[0185][174]本发明另外地提供了包含用于制备VLP之体外方法的成分的试剂盒以及包含PapMV VLP的药物试剂盒。
[0186]制备重组VLP的试剂盒
[0187][175]本发明的某些实施方案提供了包含用于本文所述体外方法之成分的试剂盒。例如，试剂盒可包含编码PapMV外壳蛋白的质粒和/或编码ssRNA模板的质粒，或者试剂盒可包含经纯化的PapMV外壳蛋白和/或经纯化的ssRNA模板。
[0188][176]试剂盒还可任选地包含用于制备重组PapMV外壳蛋白或ssRNA或者用于组装反应或者用于纯化重组VLP的一种或更多种其他成分，例如培养基、聚合酶、限制酶、缓冲液、诱导物、核酸酶等。
[0189][177]试剂盒的各个成分包装在分开的容器中并且在某些实施方案中一些成分可以以干燥或冻干形式提供。试剂盒还可包含使用说明书。
[0190]药物试剂盒(pharmaceuticalkit)
[0191][178]本发明的某些实施方案提供了包含用作佐剂、免疫调节剂或疫苗之重组PapMV VLP的药物试剂盒。试剂盒的各个成分可包装在分开的容器中，并且与这些容器一起的可以是这样的形式的通知，其由调控药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机关开据，所述通知反映制造、使用或销售是经机关批准的。试剂盒可任选地包含指出重组PapMVVLP之使用方法或施用方案的说明或指示。
[0192][179]当试剂盒包含用作佐剂的重组PapMV VLP时，所述试剂盒还可包含与重组PapMV VLP组合使用的一种或更多种抗原。在某些实施方案中，抗原可以是疫苗形式，例如市售疫苗。
[0193][180]当作为溶液(例如水溶液或无菌水溶液)提供试剂盒的一种或更多种成分时，容器器具本身可以是吸入器、注射器、移液管、滴眼器(eye dropper)等其他这样的装置，从其中溶液可施用至对象或者施用至药物试剂盒的其他成分并且与其混合。
[0194][181]试剂盒的成分还可以以干燥或冻干形式提供，并且试剂盒可额外包含用于重构冻干成分的合适溶剂。不论容器的数量或种类为何，本发明的试剂盒还可包含辅助向患者施用所述组合物的工具。这样的工具可以是吸入器、鼻喷雾装置、雾化器、注射器、移液管、镊子、称量匙、滴眼器或类似的医学上批准的递送运载物。
[0195][182]为了更好的理解本文描述的本发明，给出了以下实施例。应理解的是这些实施例旨在描述本发明示例的实施方案，而不是旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
[0196]实施例1:制备包含ssRNA之PAPMV VLP的方法:概述
[0197][183]该实施例中描述的方法总结于图6所示的流程图中。由该方法产生的重组VLP (rVLP)为15nm宽、50至数千nm长的棒状纳米颗粒。rVLP的一般制备物具有15 X IOOnm的平均大小。可通过若个rVLP的大分子聚合的组装反应之后增加rVLP的大小，使得最终rVLP多至数千nm长。1.中间产物I的产生(重组外壳蛋白(rCP))
[0198][184]在可诱导启动子的控制下在转化有包含rCP基因之质粒DNA的宿主细胞中产生rCP。经转化的宿主细胞在培养基中生长。通过向培养基中添加生物化学诱导物来触发蛋白质表达。在诱导期结束时，收获细胞，悬浮于裂解缓冲液中，然后破碎。通过除去基因组DNA和膜来使细胞裂解物澄清。rCP通过离子-基质亲和树脂进行捕获，之后从内毒素和小aMW分子中纯化出来。最终中间产物I为通过过滤灭菌的蛋白质溶液。在2~8°C下储存的无菌产物稳定储存数年。
[0199]1.1宿主载体组合
[0200][185]宿主:使用大肠杆菌菌株DH5- a、BL21和BD792，以及酵母巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)GSl 15 菌株。
[0201][186]载体:pET24和PQE8tl质粒DNA与原核细胞一起使用，以及pPICZ a质粒DNA与酵母细胞一起使用。
[0202]1.2牛物质牛产(培养)
[0203][187]原核生物质在烧瓶和生物反应器二者中生产。
[0204][188]酵母生物质仅在烧瓶中生产。
[0205][189]数种类型的培养基用于培养生物质(使用甘油或葡萄糖作为唯一碳源的确定的培养基，以及，使用酵母提取物和胰蛋白胨作为碳源的较常见培养基)。
[0206]1.3重组基因表达的诱导[0207][190]采用多种量的IPTG(0.3至2mM)和多种孵育时间(3至24小时)在20。。、22°C、25°C、32°C或37°C下进行重组基因表达的诱导。在0.7~ImM IPTG在22~25°C下进行6~9小时时获得最佳的诱导。
[0208][191]在32°C下进行具有特定葡萄糖/甘油/乳糖比率的自动诱导培养基。
[0209]1.4生物质收获、浓缩和缓冲液更换
[0210][192]可通过离心来浓缩细胞。可将湿的生物质在低于_60°C下冷冻储存数个月。细胞破碎之前，将细胞悬浮于高渗中性裂解缓冲液(例如，IOmM Tris pH8.0,500mM NaCl)中。
[0211][193]细胞浓缩和缓冲液更换还可通过切向流过滤来进行。在缓冲液更换期间应使用高渗溶液以防止rCP体内组装至细菌RNA。细胞悬液可在低于_60°C下冷冻储存数个月或者在2~8°C下储存72小时。
[0212]1.5细朐破碎
[0213][194]使用French压碎机、匀浆机或超声器机械破碎细胞。
[0214]1.6细胞裂解物的液化和澄清
[0215][195]DNA酶处理用于使细菌基因组DNA片段化。使用多种类型的DNA酶，包括Benzonase?0
[0216][196]通过离 心或切向流过滤(300kDa至0.45 截留分子量(MWCO)膜)从细胞裂解物中除去大的细胞碎片和膜。
[0217][197]可通过切向流过滤(0至30kDa MWCO膜)除去低分子量污染物。
[0218]1.7离子基质亲和色谱法(IMAC)捕获和纯化
[0219][198]rCP包含6 XHis标签并且通过离子基质亲和色谱法进行捕获和纯化。低浓度咪唑用于降低在经澄清细胞提取物的IMAC上样期间的背景。可采用pH梯度或采用咪唑从IMAC柱中洗脱rCP。
[0220]1.8内毒素除去
[0221][199]可使用阴离子交换色谱法/过滤除去存在于rCP溶液中的污染内毒素。
[0222]1.9眯啤除去
[0223][200]可通过透析或切向流过滤(5至30kDa MWCO膜)除去存在于rCP溶液中的污染咪唑。
[0224]2.中间产物2的产生(ssRNA模板(SRT))
[0225][201]将PapMV的多突变基因组插入质粒DNA中。重组质粒用于转化细菌。经转化细菌在培养基中生长并且通过标准分子生物学技术从细胞培养物中捕获并纯化质粒DNA。
[0226][202]通过DNA限制酶在合成RNA转录本将结束的位置消化来使质粒DNA线性化。
[0227][203]使用RNA聚合酶进行SRT的转录。设计表达载体，使得源自RNA聚合酶启动子的转录本在DNA切割位点从DNA模板释放。体外产生SRT并纯化以除去DNA、蛋白质和游离核苷酸。最终中间产物2为通过过滤灭菌的RNA溶液。无菌产物在_60°C以下稳定储存数年。
[0228]2.1宿主载体组合
[0229][204]可使用允许质粒DNA复制的多种细菌宿主以及在选定细菌宿主中可复制的多种标准表达载体。表达载体应具有用于SRT转录的原核RNA聚合酶启动子。[0230]2.2质粒DNA产牛和钝化
[0231][205]本领域已知的多种质粒DNA提取和纯化方法可用于制备和纯化质粒DNA。
[0232]2.3质粒DNA线件化
[0233][206]选择用于使质粒DNA线性化的限制性核酸内切酶以满足以下条件:⑴限制酶必须不切割RNA聚合酶启动子与待存在于SRT中的最后的核苷酸之间的DNA序列；和
(ii)限制酶必须切割紧接在待存在于SRT中的最后的核苷酸之后的DNA序列。
[0234]3.3RNA模板的合成
[0235][207] SRT的5'端具有PapMV外壳蛋白成核信号，而其他核苷酸序列来源于多突变形式的PapMV5'端基因组。编码示例性ST序列的DNA序列在图7中提供[SEQ ID NO:5 和 6]。
[0236]3.4SRT 的钝化
[0237][208]可通过切向流过滤使用与SRT大小相关的MWCO膜从游离核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸中纯化全长SRT。例如，使用IOOkDa MWCO膜从游离核苷酸中纯化1500nt长SRT。
[0238]3.rVLP 的产生
[0239][209]通过使中间产物I和2组合来体外组装rVLP。在中性缓冲溶液中进行组装反应。使新组装的rVLP与低量RNA酶一起孵育，以除去从rVLP突出的任何RNA ;该操作促进了 rVLP的溶解性。之后从污染物和游离rC`P (未组装单体)中纯化平端化rVLP。最终产物为通过过滤灭菌的rVLP液体悬液。无菌产物在2~8°C下稳定储存数年。
[0240]3.1组装反应
[0241][210]组装反应方法在中性水性缓冲液中进行并且不需要任何其他特定的离子。其基于rCP的天然特性以在ssRNA上组装。
[0242][211]可使用多种蛋白质:RNA比率进行组装反应。1500nt长SRT的最佳比率为Img RNA15 ~30mg 蛋白质。
[0243][212]组装反应可在2至37°C的不同温度下进行一段时间，这取决于中间产物的浓度和溶液的温度。
[0244]3.2rVIP 平端化
[0245][213]可在标准条件下使用多种类型的核酸酶从rVLP除去突出的RNA。
[0246]3.3rVLP富集和钝化
[0247][214]可通过渗滤使用IOOkDa MWCO膜进行rVLP富集。
[0248][215]可通过渗滤使用10~IOOkDa MWCO膜除去污染的游离核苷酸。
[0249][216]可通过渗滤使用IOOkDa MWCO膜除去污染的核酸酶。
[0250]实施例2:制备包含ssRNA之PAPMV VLP的示例性方法
[0251]rCP的产生
[0252][217]DNA包含在诱导性启动子控制下的rCP基因。简要地，将包含6 XHis标签的PapMV CP克隆至pQE80载体(QIAGEN)中，其侧翼为限制酶NcoI和BamHI并且在T5启动子的控制下。大肠杆菌BD-792经质粒转化并且在标准培养基中生长。通过向培养基中添加IPTG (0.7~ImMIPTG在22~25°C下进行6~9小时)来触发蛋白质表达。
[0253][218]在诱导期结束，收获细胞，悬浮于裂解缓冲液(IOmM Tris pH8.0,500mMNaCl)中，然后使用French压碎机、匀浆机或超声器机械地破碎细胞。通过标准DNA酶处理除去基因组DNA并且通过离心或切向流过滤(300kDa至0.45 ii m MWCO膜)除去大的细胞碎片和膜来使细胞裂解物澄清。rCP采用离子-基质亲和树脂进行捕获并且使用标准程序采用咪唑进行洗脱。可采用250mM至IM咪唑洗脱PapMC外壳蛋白。还可使用pH梯度实现洗脱。随后，通过阴离子交换色谱法/过滤从内毒素中并且通过切向流过滤(0至30kDaMWCO膜)从小的低分子中纯化rCP。通过透析或切向流过滤(5至30kDa MWCO膜)除去存在于rCP溶液中的任何污染咪唑。通过过滤对最终rCP蛋白质溶液进行灭菌。SRT的产生
[0254][219]图 7A 中提供了编码 SRT 的 DNA 序列[SEQ ID NO:5]。SRT 基于 PapMV 的基因组并且具有5'端的PapMV外壳蛋白成核信号(图7A中的框)。其余核苷酸序列为多突变的，其中所有ATG密码子突变成TAA终止密码子。序列的开始16个核苷酸(图7A中的下划线)包含位于pBluescript表达载体的17转录起始位点并且存在于RNA转录本内。在图7A中下划线示出五聚体重复。整个转录本的长度为1522个核苷酸。图7B所示的较长SRT[SEQ ID NO:6]也成功地用于体外组装。
[0255][220]使用标准程序将对应于SRT的DNA插入包含原核RNA聚合酶启动子的DNA质粒中。重组质粒用于转化大肠杆菌细胞并且随后经转化细菌在标准培养基中生长。通过标准技术从细胞培养物中回收并纯化质粒DNA，之后通过采用限制酶MluI在紧接在SRT序列的最后核苷酸之后的DNA序列位点处切割使质粒DNA线性化。
[0256][221]使用RiboMAX?试剂盒(Promega，USA)根据制造商推荐方案采用17RNA聚合酶进行SRT的转录。设计表达载体，使得源自RNA聚合酶启动子的转录本在DNA切割位点从DNA模板释放。通过切向流过滤使用IOOkDa MWCO膜来纯化SRT以除去DNA、蛋白质和游离核苷酸。通过过滤对最终RNA溶液进行灭菌。
[0257]rVLP 的产生
[0258][222]通过将rCP与SRT组合来体外组装rVLP。在中性缓冲溶液(IOmM Tris-HClPH8)中进行组装反应。使用对于Img RNA而言15~30mg蛋白质的蛋白质:RNA比率进行组装反应。使新组装的rVLP与低量RNA酶(0.0001 u gRNA酶/ y gRNA) 一起孵育，以除去从rVLP突出的任何RNA。之后通过渗滤使用10~IOOkDa MWCO膜从污染物和游离rCP (未组装单体rCP)中纯化平端化rVLP。通过过滤对最终rVLP液体悬液进行灭菌。
[0259]实施例3:通过施用含有合成ssRNA的PAPMV VLP在小鼠中诱导抗病毒应答
[0260][223]已经证明聚肌酸-聚胞苷酸(多聚1:C，dsRNA，一种周知的toll样受体3 (TLR-3)配体)通过诱导促炎性细胞因子如IL-6、CXCLlO, JE、KC、mGCSF、CCL3、CCL5和TNF的分泌成为肺中先天免疫应答的诱导物(Stowell等,2009, Respir.Res.，10:43)。还已知TLR-7通过与配体如ssRNA和R837 (鸟苷类似物)结合激活先天免疫应答。
[0261][224]在提高PapMV VLP引发先天免疫应答和发生抗病毒应答的能力的尝试中，通过实施例2中描述的方法制备含聚1:C dsRNA或ssRNA的PapMV VLP。PapMV外壳蛋白在体外与聚 1:C (dsRNA ;InvivoGen，San Diego, CA)或 ssRNA 组装，产生含各自 RNA 的 VLP。ssRNA 用 Promega T7Ribomax Express 大规模 RNA 生产系统(Promega, Madison, WI)在体外制备。
[0262][225]用电子显微镜检查组装的VLP并且观察到与通过Tremblay等(2006，FEBSJ.，273:14-25)中描述的方法制备的VLP类似(见图8A:含ssRNA的PapMV VLP和图SB:含聚 1:C 的 PapMV VLP)。
[0263][226]评价两种VLP在诱导针对流感病毒攻击的保护中的效力。将Balb/C小鼠(每组 10 只)用 60 ii g 含 ssRNA 的 PapMV VLP ( “PapMV VLPssRNA”)、含聚 1:C 的 PapMVVLP ( “PapMV VLP聚1:C”)或等价量的RNA (即，3 y g聚1:C或ssRNA)处理。对照组小鼠用60 ii gPapMV外壳蛋白(CP)单体(不含RNA)或用对照缓冲液(IOmM Tris-HCl pH8)处理。以7天间隔用60 ii g PapMV VLP鼻内处理小鼠2次并且在最后处理后3天用200pfu流感病毒株WSN/33攻击。在接下来的14天中每天一次测量动物的体重、症状和存活。处死表现为重量减轻超过20%的动物。
[0264][227]结果表示在图9A~B中。用PapMV VLP ssRNA处理的小鼠表现出在处理组中最佳的表现。具体地，用PapMV VLP ssRNA处理的小鼠未损失任何显著量的体重(图A)并且表现出非常少(若有的话)的症状(图9B)。用PapMV VLP聚1:C或单独用多、聚1:C处理的组表现出对攻击的部分保护，与对照组相比有降低的重量减轻(图9A)和症状(图9B)。用PapMV CP单体处理未提供任何保护，在用单体处理的小鼠中观察的重量减轻的量(图9A)和症状(图9B)与在用PBS对照处理的小鼠中观察到的类似。随后PapMV VLP聚
1:C的分析表明这些VLP不像PapMV VLP ssRNA那样稳定，这可能是其表现较差的原因。
[0265]实施例4:通过施用PAPMV VLP#1在小鼠中诱导细胞因子
[0266] [228]为了说明肺内PAPMV VLP诱导的机理，以7天间隔采用60 ii g包含ssRNA的PapMV VLPU5 u gPamCSK4 (TLR-2 配体并且 I 型 IFN 的非诱导物)(Cedarlane，Burlington，ON)或采用对照缓冲液(10mM Tris HCl pH8)两次鼻内接种小鼠(每组5只)。在第二次处理后24小时进行支气管肺泡灌洗(BAL),并且用Luminex技术(Milliplex Mouse cytokinepremixed32-plex immunoassay kit ；Millipore)筛选细胞因子的存在。
[0267][229]通过用PapMV VLP或PamCSK4处理，诱导了两种主要的细胞因子白细胞介素-9(IL-9)和干扰素I诱导蛋白IOkDa(IP-1O)(图10A&B)。IL-9是由CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子，其促进T细胞增殖并抑制凋亡。IP-10作为IFN-Y分泌的结果出现并且在刺激部位T淋巴细胞、树突细胞、NK细胞和巨噬细胞的募集中具有重要作用。PamCSK4 (为已知的TLR-2配体和病原体相关分子模式(PAMP)分子)和PapMV VLP对两种细胞因子的诱导表明VLP也可以是PAMP。
[0268]实施例5:通过施用PAPMV VLP#2在小鼠中诱导细胞因子
[0269][230]进行与实施例4中的描述类似的实验，不同之处在于在处理后6小时进行BAL,并且处理是接种I次或以7天间隔接种2次。与之前一样，在实验中使用60y g含ssRNA的PapMV VLP。用Luminex (32细胞因子检测试剂盒)筛选处理后处理后早期产生的细胞因子。
[0270][231]结果表示在图1lA~R中，并且表明用PapMV VLP处理2次比处理一次在诱导小鼠中的细胞因子和趋化因子上更有效。此外，在处理后6比处理后24小时检测到更多种类的细胞因子和趋化因子(比较图11和图10)。
[0271][232]在用 PapMV VLP 处理的小鼠的 BAL 中发现 MIP-1 a、MIP-1 β、MIP-2、mKC、TNF-a和MCP-1非常丰富(图1lA~E和H)。这些细胞因子和趋化因子激活人粒细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)，其可导致急性中性粒细胞炎症。它们还诱导纤维母细胞和巨噬细胞合成和分泌其他促炎性细胞因子，例如TNF-a、IL-6和IL_1 a /旦(Maurer 和 von Stebut,2004, The International Journal of Biochemistry&CellBiology, 36:1882-1886)，这也表现为由 PapMV VLP 诱导(分别见图 8E、N、o 和 P)。MIP-1蛋白还可通过诱导针对传染性病原体如病毒(包括流感病毒)(Menten等，2002，Cytokine Growth Factor Reviews,13:455-481)和寄生生物(Aliberti 等，2000,VaturalImmunology, 1:83-87)的炎症应答来促进健康,这与之前实施例中所示结果一致。
[0272][233]还观察到IL-6响应于PapMV VLP施用的分泌(图11N)。有趣的是，在抵抗细菌肺炎球菌(Pneumococcus pneumoniae)的感染中表现为需要IL-6的分泌(van derPoll 等，1997，JInfect Dis.，176 (2):439-44)。
[0273][234]用PapMV VLP处理强烈地诱导了 IP_10(图111)。IP-10是趋化性趋化因子，其有利于炎症部位T细胞的募集，并且其还有利于自然杀伤细胞(NK细胞)的增殖和激活。
[0274][235]用PapMV VLP处理还诱导白细胞介素17(图11J)。与干扰素Y类似，IL-17是通过增加多种组织中趋化因子的产生从而向炎症部位募集单核细胞和中性粒细胞来发挥作用的细胞因子。IL-17由T辅助细胞产生，并且也是响应细胞外病原体入侵免疫系统的促炎性细胞因子。IL-17通过上调促炎性细胞因子和趋化因子如IL-6、粒细胞集落刺激因子、TNFa、IL-1、KC、MCP-1 和 MIP-2 来协调局部组织炎症(Z 印p 等，2011，Trends Immunol.Apr 12.[印刷前网络公开])，其也表现为被PapMV VLP处理诱导。
[0275][236] PapMV VLP 处理(图1lQ 和 R)还诱导了 G-CSF 和 GM-CSF,已知 G-CSF 和GM-CSF刺激干细胞产生粒细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞。单核细胞离开循环并且迁移进入组织，其在此处成熟为巨噬细胞。因此，G-CSF和GM-CSF是炎症级联反应的一部分，通过它们少量巨噬细胞的激活可迅速导致其数量增加，这是与感染战斗的重要过程(Metcalf, 2010, Nature Reviews Cancer, 20:425-434)。
[0276][237]如通过免疫细胞分泌的细胞因子和趋化因子谱所表现的，该实施例和实施例4中描述的结果表明用PapMV VLP处理小鼠诱导强烈的普遍的炎症应答。细胞因子和趋化因子的水平在处理后6小时最大，在处理后24小时显著降低。可能是炎性细胞因子和趋化因子诱导免疫细胞和粒细胞的迁移，因此导致所观察到的经接种动物的超过5天的抗病毒状态。诱导细胞因子还可导致I型IFN的分泌，还已知其继而提供抗流感活性。
[0277]实施例6:PAPMV VLP ssRNA 对 TLR-7 的激活
[0278][238]用 100 u gPapMV VLP ssRNA 或 IOOu IPBS 对 C57BL/6、TLR7 敲除(KO)、MYD88K0和IRF5/7K0小鼠(3~5只小鼠每组)进行静脉内免疫，在免疫后24小时分离脾细胞并且分析在树突细胞(DC)、⑶8+T细胞和B细胞中⑶86和⑶69的表达。用FACS分选细胞并且通过⑶69或⑶86特异性抗体的结合借助荧光强度评价⑶86和⑶69的水平。结果在图12中作为所分析样品对PBS样品的平均荧光强度(MFI)的比率表示。
[0279][239]简要地，这些结果表明抗原递呈细胞如DC和B细胞以及⑶8+T细胞被PapMVVLP ssRNA纳米颗粒激活。激活依赖于IRF5/7、Myd88和TLR-7，因为在敲除IRF5/7、Myd88或TLR7的小鼠中未激活。认为TLR-7通过VLP中包含的ssRNA触发。用PapMV外壳蛋白(单体或其他低分子量形式)进行的实验无法激活TLR-7。
[0280][240] IRF5/7是干 扰素响应因子，其通过TLR-7的刺激诱导并且导致产生干扰素a。Myd88分子是适配体分子，其负责转移由TLR-7触发的信号。提出的反应级联是:1)由VLP中的ssRNA触发TLR-7 ;和2)Myd88加入，之后诱导IRF5/7，其将导致干扰素a产生的增加。最后，干扰素a有助于PapMV VLP纳米颗粒的免疫调节作用。
[0281]实施例7:浆细胞样树突细胞参与PAPMV VLP免疫原性
[0282][241]用 100 u gPapMV VLP ssRNA 对 C57BL/6 小鼠(5 只每组)通过 1.v.进行免疫接种，免疫接种之前进行或不进行耗尽BST2+细胞的处理。为了耗尽，在用PapMV VLP ssRNA免疫接种前48小时和24小时用500 ii g抗-BST2抗体(mAb927)通过1.p.注射C57BL/6小鼠。在用PapMV VLP ssRNA进行免疫接种后24小时通过FACS分析分离的脾细胞中⑶69、MHC-1和⑶86的表达。
[0283][242]结果表示在图13中，并且表明BST2+细胞(主要为浆细胞样树突细胞)对于小鼠中PapMV VLP ssRNA纳米颗粒的免疫原性很重要。具体地，在BST2+细胞耗尽的小鼠中观察到B细胞、CD8+细胞和DC无激活，表明激活通过浆细胞样树突细胞进行。
[0284]实施例8 =PAPMV VLP#1对干扰素-a产生的刺激
[0285][243]用 100 u gPapMV VLP ssRNA 或 100 u IPBS 对两组 C57BL/6 小鼠以及 TLR-7K0和MYD88K0小鼠(4只小鼠每组)通过1.v.进行免疫接种。一组C57BL/6小鼠首先如实施例7中所述用抗-BST2抗体进行处理。在免疫接种后6、12、24和48小时(图14A)或免疫接种后 6 小时(图 14B)通过 ELISA (VeriKine? Mouse Interferon Alpha ELISAKit ；PBLInterferonSource)监测血清和脾中IFN-a的产生。
[0286][244]结果表示在图14中，并且表明PapMV VLP ssRNA纳米颗粒对IFN-a的产生的刺激依赖于MYD88、TLR7和BST2+细胞。
[0287]实施例9 =PAPMV VLP#2对干扰素-a产生的刺激
[0288][245]用 100 u `gapMV VLP ssRNA 或 100 u IPBS 对 C57BL/6 和 IFNAR KO 小鼠(3 只小鼠每组)通过1.v.进行免疫接种。通过流式细胞术评价在免疫接种后24小时从小鼠的脾分离的B淋巴细胞和树突细胞中⑶86、MHC-1和⑶69的表达。
[0289][246]结果表示在图15A和B中，并且表明I型IFN受体是PapMV VLP ssRNA纳米颗粒激活小鼠免疫细胞所必需的。敲除了 I型IFN受体(IFNAR K0)的小鼠未表现出PapMVVLP ssRNA纳米颗粒对免疫细胞的激活。
[0290][247]通过间接ELISA测量与PapMV VLP ssRNA涂覆平板结合的总IgG，分析在用100 u gPapMV VLP ssRNA 进行免疫接种后第 4、8、12、20 和 30 天的 C57BL/6 和 IFNAR KO 小鼠(9只小鼠每组)血清中针对PapMV VLP ssRNA的抗体的水平。
[0291][248]结果表示在图15C中，并且表明I型IFN信号转导的缺失导致针对PapMVVLP ssRNA纳米颗粒的抗体应答显著延迟。
[0292]实施例10:用PAPMV VLP预处理帮助控制慢性感染
[0293][249]LCMV是慢性感染(例如HCV感染)的相关动物模型。LCMV的克隆13变体建立了小鼠中的持续性感染。与HCV感染类似，LCMV感染主要受CTL控制，并且CTL应答疲耗尽与ro-1表达相关。
[0294][250]用 100 u gPapMV VLP ssRNA、100 u gR837 (市售 TLR-7 配体)或 100 y IPBS 通过1.V.处理C57BL/6和TLR7敲除(KO)小鼠(3~6只小鼠每组)，6小时之后用2 X IO6PFULCMV克隆13感染(1.v.)。在第5、11、15、25和45天采集血液样品以通过LCMV焦点形成测定(focus-forming assay)评估病毒滴度。在感染后15天或45天处死小鼠以通过FACS测定脾中的免疫应答，并且如之前描述(Lacasse等，2008，J.Virology, 82:785-794)用大鼠抗LCMV-NP单克隆Ab (VL-4)在MC57成纤维细胞上通过LCMV焦点形成测定测定脾、肝、肾和脑中的病毒滴度。
[0295][251] C57BL/6小鼠的血液中LCMV克隆13的病毒动力学描述在图16中，并且表明用PapMV VLP ssRNA纳米颗粒预处理控制LCMV诱导的慢性感染。
[0296][252]感染后第15天C57BL/6和TLR7K0小鼠脾、肾、肝和脑中的病毒滴度表示在图17中，表明用PapMVVLP ssRNA纳米颗粒预处理比市售TLR7配体(R837)更有效并且以TLR7依赖的方式降低了不同器官中的病毒载量。认为PapMV VLP ssRNA纳米颗粒中的TLR-7配体是ssRNA成分，其占分子的约5%。因此，尽管向小鼠每种施用了 100iig，PapMVVLP ssRNA纳米颗粒在降低小鼠中的LCMV病毒载量方面比R837有效20倍。
[0297][253]图18显示出在用LCMV克隆13感染之前施用PapMV VLP ssRNA纳米颗粒使GP33特异性⑶8+T细胞的功能提高。对于NP396特异性⑶8+T细胞得到了类似结果。具体地，图14F表明通过用PapMV VLP ssRNA纳米颗粒预处理，GP33特异性CD8+T淋巴细胞中表达的I3D-1的量显著降低。I3D-1是免疫耗竭的指示剂，其表达是LCMV克隆13感染的特征。用PapMV VLP ssRNA纳米颗粒预处理小鼠导致I3D-1水平保持在如未感染小鼠中的一样低，表明在这些小鼠中免疫系统未耗竭，这是这些小鼠能够抗感染的原因。
[0298][254]图19显示出感染后第45天C57BL/6小鼠的脾、肾、肝和脑中的病毒滴度。该结果表明因用PapMV VLP ssRNA纳米颗粒预处理造成的病毒载量的降低在处理后数周依然明显。
[0299]实施例11 =PAPMV VLP在体外激活人单核细胞
[0300][255]通过 Ficoll 梯度分离人 PBMC 并且用 100 u g/ml PapMV VLP ssRNA 或 PBS处理。在处理后18小时，通过流式细胞术分析⑶14+⑶Ilb+细胞群(单核细胞)的⑶86表达。
[0301][256]结果表示在图20中，表明人单核细胞也被PapMV VLP ssRNA纳米颗粒激活。这些结果代表三个独立实验。
[0302]实施例12 =PAPMV VLP对抗细菌应答的诱导
[0303][257]通过鼻内途径用单独缓冲液(IOmM Tris pH8)或用60 y g PapMV VLP ssRNA以7天间隔处理小鼠(10只小鼠每组)两次。在处理后第3天，用220CFU(集落形成单位)的毒性肺炎链球菌菌株感染小鼠。
[0304][258]在4天中每12小时密切监测存活率。结果表示在图21中。用PapMV VLPssRNA纳米颗粒处理的组中的全部小鼠在感染中存活。用缓冲液处理的组表现出70%存活率。
[0305][259]尽管在本实施例中使用的肺炎链球菌的剂量是亚致死剂量，但是数据强烈表明用PapMV纳米颗粒预处理将通过诱导肺内的先天免疫应答来提供对细菌感染的保护。本实施例和之前的实施例表明，由PapMV纳米颗粒赋予的保护是非特异性的，因为其有效针对病毒和细菌的感染。
[0306]实施例13 =PAPMV VLP治疗LCMV慢性感染
[0307][260]将C57BL/6小鼠(3只小鼠每组)在第0天用2 X IO6个PFU LCMV克隆13通过1.v.进行感染，并且在第1、2、3、4和5天(A组)或仅在第6和第7天(B组)用100 u gPapMV VLP ssRNA或100 u IPBS每天一次通过1.v.进行处理。在感染后第5、10和15采集血样并且在第15天处死小鼠以通过LCMV焦点形成测定来测定血、脾、肾和脑中的病
毒滴度。
[0308][261]在动物血液中发现的病毒滴度表示在图22中。尽管在第15天，用PapMVVLP ssRNA纳米颗粒处理的小鼠表现出与对照相同的滴度，观察到在第10天在两组小鼠中病毒滴度显著降低(A组动物中降低接近于1glO)。该结果强烈表明通过调节处理方案，在用PapMV VLP ssRNA纳米颗粒处理的小鼠中将可实现病毒载量的进一步降低。例如，可增加处理次数。在第I至5或6和7天提供处理表现为LCMV滴度降低，可能的是增加第6和7天后的处理次数将进一步降低病毒载量。可替换的或另外的，可增加PapMV VLP的施用量，例如增加为200iig每剂量。
[0309][262]在动物多种器官中发现的病毒滴度表示在图23中。尽管在第6天和第7天(B组)处理的动物脑中病毒载量表现为显著降低，但是经处理小鼠其他器官中病毒载量未表现为显著降低。这最可能是由于在第15天测量滴度，其给予感染足够时间以在处理后“反弹”。预期随后到第6天和第7天的处理将导致病毒载量更显著的降低。
[0310]实施例14:用PAPMV VLP多次处理延长保护期
[0311][263]已经显示出通过PapMV VLP处理诱导的保护用于持续约5天时间。为了研究如果用多剂量PapMV VLP进行处理是否可提供更长的保护期，以I周间隔经60 y g包含ssRNA的PapMV VLP鼻内接种小鼠I次(I X)、2次(2 X)、5次(5 X)或10次(10 X)。最后处理后3天，用流感WSN/33病毒(约ILD5tl)对小鼠进行攻击。
[0312][264]小鼠的重量减轻表示在图24中。还注意到动物未受到多次处理的影响，并且与对照动物一样在处理期间体重正常增加。
[0313][265]这些结果表明多`次处理可使由PapMV VLP纳米颗粒诱导的保护期延长至超过10周。结果还表明用PapMV VLP多次处理不使动物的先天免疫耗竭。最后，如已知的，PapMV VLP的抗体在第一次处理后7天出现并随着加强处理而增加，这些结果表明PapMVVLP触发先天免疫应答的能力不受抗体产生的影响。
[0314]实施例15 =PAPMV VLP对中性粒细胞募集的诱导
[0315][266]根据实施例3的方案对小鼠2次滴注含ssRNA的PapMV VLP,并且在第二次处理后6小时进行支气管肺泡灌洗(BAL)。结果表示在图25中。图25B中圆圈内的是发现进入用PapMV VLP处理的小鼠的BAL中的中性粒细胞。与对照组相比,处理的小鼠中观察到了 3倍的中性粒细胞。
[0316][267]中性粒细胞代表第一道防线。该实施例表明在用PapMV VLP处理的小鼠中中性粒细胞迅速募集，仅在处理后6小时。已知中性粒细胞在控制肺内细菌和病毒的感染中具有关键作用，因此很可能在PapMV处理小鼠中观察到的保护中具有重要作用。
[0317]实施例16:包含ssRNA的PAPMV VLP对黏膜免疫应答的诱导
[0318][268]通过以14天间隔两次滴注20 ii g PapMV VLP ssRNA和2 ii g三价灭活流感疫苗(TIV)处理Balb/C小鼠(10只每组)。在第0、14和28天取血。根据同一方案，另一组小鼠通过s.c.途径进行免疫接种的动物作为对照。在第15天用ILD5tl的流感WSN/33病毒攻击小鼠，在14天时间中跟踪重量减轻。[0319][269]用TIV的抗体通过ELISA测量经免疫接种的动物血液中的IgG滴度，结果表示在图26中。在使用相同途径进行免疫接种时，与单独用TIV进行免疫接种的组相比，向TIV中添加PapMV VLP使总IgG和IgG2a应答显著增加。有趣的是，对于动物血液中IgG和IgG2a的产生，s.c.途径比1.n.途径更有效。
[0320][270]用TIV的抗体通过ELISA在经免疫接种的动物的支气管肺泡灌洗(BAL)和粪便中测量抗体滴度，结果表示在图27中。从这些结果，很显然仅1.n.处理触发BAL中IgA的产生。与单独滴注TIV相比，向TIV中添加PapMV VLP使肺中IgA的量显著增加。与单独用TIV的组相比，在用PapMV VLP和TIV处理的动物中还观察到BAL中显著提高的总IgG。从得自在鼻内用PapMV VLP处理并且通过1.n.施用TIV的小鼠的BAL中总IgG的量与得自用所述组合皮下处理的小鼠的无显著差异。最后，有趣的是注意到在用所述组合鼻内处理的小鼠的肠中也观察到了黏膜免疫应答，如在该器官中出现针对TIV的IgA所表明的(图27C)。
[0321][271]用流感病毒攻击之后小鼠的重量减轻表示在图28中。所述攻击表明通过鼻内途径进行免疫接种在保护小鼠对抗异源亚型菌株中比通过s.c.途径更强且有效。在用PapMV VLP和TIV的组合通过1.n.途径进行免疫接种的组中，小鼠体重增加并且不表现出任何症状。通过s.c.施用所述组合仅提供局部保护。但是，通过s.c.施用3iigTIV和30 u gPapMV VLP可取得完全的保护。用单独TIV (通过任何途径)、单独PapMV VLP或对照缓冲液进行免疫接种的全部其他组不能保护，表现出疾病症状并且体重有显著量减轻。[0322][272]该实验的结果表明PapMV VLP可作为黏膜佐剂。佐剂触发黏膜免疫应答的能力对于有效预防或治疗通过黏膜进入身体的微生物引起的感染和疾病(包括流感、结核和幽门螺杆菌感染)很重要。经免疫接种的动物的粪便中IgG的存在表明用PapMV VLP作为佐剂通过1.n.接种疫苗可用于抵御肠内细菌或病毒的感染。另外，由于通过PapMV VLP触发的黏膜免疫应答是普遍性的，所以用PapMV VLP作为佐剂通过1.n.接种疫苗还可潜在地用于抵御阴道黏膜内细菌或病毒的感染(例如，HIV-1)。
[0323][273]尽管在这个实验中未在单独用PapMV VLP 1.n.处理的小鼠中看到保护，但是这与之前实施例中的结果一致，其表明通过PapMV VLP诱导的非特异性保护仅持续约5天时间。在该实验中，在第二次滴注VLP后14天进行攻击。
[0324]实施例17:PAPMV VLP 对 TLR-2 和 CD14 的激活
[0325][274]如在之前实施例中证明的，在细菌宿主细胞中制备的PapMV VLP和用ssRNA通过体外自组装制备的PapMV VLP 二者都能够刺激固有免疫应答。但是，通过两种不同方法制备的VLP激活不同的TLR。如上文所示，用ssRNA通过体外自组装制备的PapMV VLP激活TLR-7。相比之下,如先前描述(Tremblay等,2006, ibid.)通过在大肠杆菌细胞中表达PapMV外壳蛋白和自组装制备的PapMV VLP激活TLR-2和CD14。
[0326][275]简言之,用100 ii g PapMV VLP (根据Tremblay等制备)或已知的TLR配体(获自金黄色葡萄球菌(LTA)的100 u g脂磷壁酸:TLR2和⑶14配体；1 y gPam3SCK4:TLR2配体；或10 ii g鞭毛蛋白:TLR5配体)和抗CD14、抗TLR2或抗TLR5抗体处理THPl-XBlue?-CD14 细胞(InvivoGen，San Diego, CA)。THPl-XBlue?-CD14 细胞具有多个TLR(包括TLR2、4、5)，并且被改造为在TLR与配体结合时产生蓝色。结合之后，细胞变为蓝色并且可用分管光度计容易地评价结合的强度。在将细胞在37°C下孵育24小时后进行测量。
[0327][276]结果表示在图29中。针对CD14，TLR2或TLR5的抗体(Ac)阻止各自TLR或⑶14的结合，并且揭示了每一种测试分子产生的相互作用。在使用抗TLR2抗体与PapMVVLP 一起时观察到光密度显著降低，在使用抗CD14抗体时观察到强烈降低。在该实验中，当使用Pam3CSK4(已知的TLR2配体)时，TLR2的抗体不能像预期的那样产生较高地降低。这很可能是在试验中Pam3CSK4的使用量过高。
[0328][277]用在细菌中组装的PapMV VLP观察到的TLR激活的差异可由于在从细菌中分离之后对VLP进行的去污剂处理的结果。该处理可影响PapMV VLP的表面，例如暴露出疏水残基并导致VLP成为TLR2的配体。与存在于核内体中的TLR7不同，TLR2和⑶14 二者暴露于免疫细胞表面。
[0329]实施例18:包含ssRNA之PAPMV VLP的佐剂活性
[0330][278]来自HlNl大流感病毒菌株A/加利福尼亚/7/2009的核蛋白(NP)在大肠杆菌中表达为His标签蛋白并且采用镍亲和柱进行纯化。使NP抗原(IOyg)与实施例2所述制备的10、30、60或90 ii gPapMV VLP相混合并用于接种Balb/C小鼠(每组10只)。接种后21天，采集血液样品并通过ELISA使用GST-NP抗原进行分析，以评估体液应答。
[0331][279]结果示于图30中，并且表明使用10 U gNP和10 U gPapMV VLP的组合足以使针对NP的体液应答饱和。
[0332][280]在单独的实验中，以14天间隔采用包含仅IOii gNP(来自HlNl菌株A/加利福尼亚/7/2009)或者其与作为佐剂的PapMV VLP (10、30、60或90 y g)相混合的制剂s.c.免疫Balb/C小鼠(每组10只)3次。采用异源亚型流感株H1N1WSN/33 (约ILD5tl)在最后免疫后14天攻击小鼠。对于攻击后14天跟踪症状。每天对重量减轻和症状进行计分。
[0333][281]结果示于图31中并且示出了佐剂化的制剂所免疫的小鼠显示对流感攻击的最佳保护。经NP (IOii g)+90 ii gPapMV接种的组显示出最低症状和最低重量减轻。针对流感异源亚型株所观察到的保护明显地表明采用PapMV佐剂针诱导了对高度保守蛋白质NP的CTL应答，针对感染提供了较好的保护。图30所示NP的抗体不太可能中和感染，因为NP发现于病毒的内部，所以表明CTL应答参与在受攻击小鼠中所观察到的保护。当与PapMVVLP佐剂相混合时针对NP的IgG2a同种型的存在表明诱导了 Thi应答，这与触发CTL应答—致。
[0334][282]所以该结果表明使用包含ssRNA的PapMV VLP作为佐剂增强了抗体诱导和CTL应答二者。
[0335]实施例19:包含ssRNA的PAPMV VLP和PAPMV SM VLP的佐剂活性
[0336][283]该实施例比较了通过根据本发明之方法所制备PapMV VLP与通过Tremblay等(2006，同上)所述方法所制备PapMV VLP (PapMV sm)的佐剂活性。两种类型的VLP在电子显微镜下具有相同外观。
[0337][284]简要地，通过皮下途径经单独的或者用30 U gPapMV sm或根据实施例2所述方法制备之PapMV VLP佐剂化的市售三价灭活流感疫苗(TIV) (2009-2010)免疫Balb/C小鼠(10只/组)。注射后14天从小鼠中采集血液并且通过标准方案获得血清。使用血清进行针对TIV和总IgG或IgG2a滴度的ELISA。
[0338][285]结果示于图32中并且表明单次注射后，根据实施例2所示方法制备的PapMVVLP导致总IgG或IgG2a滴度显著地高于采用单独TIV所观察到的。根据实施例2所示方法制备的PapMV VLP所获得的滴度还优于在接受用PapMV sm佐剂化TIV的组中所观察到的那些。
[0339][286]该结果明显表明，通过根据本发明之方法制备的PapMV VLP能够提供比PapMV sm更强的佐剂作用，即使它们的结构类似也是如此。
[0340][287]仅注射PapMV VLP (没有TIV)的实验还表明针对VLP的IgG2应答对于根据实施例2所述方法制备的VLP而言比对于PapMV sm而言更强。
[0341][288]本说明书中参照的全部专利、出版物(包括公开的专利申请)和数据库条目的公开内容通过引用整体清楚并入本文，其程度如同每一这些单独专利、出版物和数据库条目清楚并且单独提到通过引用并入本文。
[0342][289]尽管参照某些特定实施方案描述了本发明，但是不脱离本发明的精神和范围对本发明进行的各种修改对于本领域技术人员将是显而易见的。对于本领域技术人员将是显而易见的所有这些修 改旨在包含在所附权利要求的范围内。
【权利要求】
1.一种用于制备病毒样颗粒(VLP)的体外方法，其包括以下步骤: a)在约6.0至约9.0的pH下和约2°C至约37°C的温度下，将蛋白质:RNA比按重量计为约1:1至50:1的重组马铃薯X病毒外壳蛋白与ssRNA组合足以允许VLP组装的时间； b)用核酸酶处理所述VLP以移除从所述颗粒中突出的任何RNA;以及 c)将所述VLP与其他处理成分分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组马铃薯X病毒外壳蛋白是重组番木瓜花叶病毒(PapMV)外壳蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述重组马铃薯X病毒外壳蛋白是经遗传修饰的外壳蛋白。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述重组外壳蛋白与一种或更多种抗原肽融合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述重组病毒外壳蛋白主要为低分子量种类的形式。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述蛋白质:RNA比按重量计为约5:1 至 50:1。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述蛋白质:RNA比按重量计为约10:1 至 50:1。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述pH为约pH6.5至pH8.5。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述pH为约pH7.0至pH8.5。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述温度为约5°C至约37°C。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述温度为约10°C至约37°C。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述温度为约20°C至约37°C。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述重组外壳蛋白在大肠杆菌(E.coli)中产生。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述ssRNA是合成的ssRNA、天然ssRNA、经修饰的天然ssRNA或天然ssRNA的片段。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述ssRNA的长度为约50个核苷酸至约5000个核苷酸。
16.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述ssRNA的长度为约1000个核苷酸至约3000个核苷酸。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述ssRNA是合成的ssRNA。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述合成的ssRNA不包含任何AUG密码子。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述合成的ssRNA包含对应于SEQID NO:5第17至54位核苷酸的序列。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述合成的ssRNA包含对应于SEQID NO:5或6所示核酸序列的序列或其片段。
21.通过根据权利要求1至20中任一项所述的方法制备的病毒样颗粒(VLP)。
22.番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)，其包含重组PapMV外壳蛋白和ssRNA，其中所述ssRNA的长度为约50个核苷酸至约5000个核苷酸并且包含对应于SEQ ID NO:5或6所示核酸序列的序列或其片段。
23.根据权利要求22所述的PapMVVLP，其中所述ssRNA的长度为约1000至约3000个核苷酸。
24.根据权利要求22或23所述的PapMV，其中所述ssRNA包含对应于SEQID NO:5第17至54位核苷酸的序列。
25.根据权利要求22或23所述的PapMV，其中所述ssRNA包含对应于SEQID NO:5所示核酸序列的序列。
26.药物组合物，其包含根据权利要求21至25中任一项所述的VLP以及可药用载体或稀释剂。
27.根据权利要求26所述的药物组合物，其还包含一种或更多种抗原。
28.根据权利要求21至25中任一项所述的VLP，其用作佐剂以在有此需要的对象中增强对抗原的免疫应答。
29.根据权利要求28所述的VLP，其中所述免疫应答是体液免疫应答或CTL免疫应答。
30.根据权利要求28所述的VLP，其中所述免疫应答是黏膜免疫应答。
31.根据权利要求21至25中任一项所述的VLP，其用于在对象中刺激先天免疫应答并从而预防所述对象中的微生物感染或降低其严重程度。
32.根据权利要求21至25中任一项所述的VLP，其与一种或更多种抗原组合用作疫苗。
33.根据权利要求1至25中任一项所述的VLP在制备药物中的用途。
34.根据权利要求33所述的用途，其中所述药物是用于在对象中增强对抗原的免疫应答的佐剂。
35.根据权利要求34所述的用途，其中所述免疫应答是体液免疫应答或CTL免疫应答。
36.根据权利要求34所述的用途，其中所述免疫应答是黏膜免疫应答。
37.根据权利要求33所述的用途，其中所述药物用于在对象中刺激先天免疫应答并从而预防所述对象中的微生物感染或降低其严重程度。
38.根据权利要求33所述的用途，其中所述药物与一种或更多种抗原组合用作疫苗。
39.一种在对象中增强对抗原的免疫应答的方法，其包括向所述对象施用包含根据权利要求21至25中任一项所述之VLP的佐剂。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述免疫应答是体液免疫应答或CTL免疫应答。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述免疫应答是黏膜免疫应答。
42.一种在对象中刺激先天免疫应答并从而预防所述对象中的微生物感染或降低其严重程度的方法，其包括向所述对象施用根据权利要求21至25中任一项所述的VLP。
43.一种在对象中刺激免疫应答的方法，其包括向所述对象施用与一种或更多种抗原相组合的根据权利要求21至25中任一项所述的VLP。
44.一种用于制备番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)的体外方法，其包括以下步骤: a)在pH为约6.5至约8.5的缓冲溶液中和约22°C至约37°C的温度下，将蛋白质:RNA比按重量计为约5:1至40:1的重组PapMV外壳蛋白与ssRNA组合足以允许VLP组装的时间，其中所述重组PapMV主要为低于20-mer的低分子量种类的形式；b)用核酸酶处理所述VLP以移除从所述颗粒中突出的任何RNA;以及c)将所述VLP与其他处理成分`分离。
【文档编号】C12N7/00GK103687942SQ201280022947
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年5月1日 优先权日:2011年5月13日
【发明者】德尼·勒克莱尔, 皮埃尔·萨瓦尔 申请人:弗利亚生物技术公司