专利名称：食品中脊髓灰质炎病毒实时荧光rt-pcr检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域。具体的说，本发明涉及贝类、蔬 果和水等食品中脊髓灰质炎病毒实时荧光PCR检测方法和试剂盒。
背景技术：
近年来，由于食用受病毒污染食品而引起的疾病爆发在全世界范围内多见报 道，其中源于肠道病毒而引发的疾病占到了 67%以上。
作为一种典型的致病性肠道病毒，脊髓灰质炎病毒野生株虽然已在全世界基本 消灭，但由于脊髓灰质炎病毒疫苗的广泛使用，其突变株在近几年引发了多起病毒爆发 事件。据世界卫生组织统计，2008年疫苗衍生脊髓灰质炎病毒感染病例升至80例，野生 型病毒感染病例近1800例。为了加强脊髓灰质炎病毒的监控，防止“病从口入”至关重要。
脊髓灰质炎病毒可在污水及食品中存活，而贝类是主要的病毒携带体。因此， 对贝类食品中脊髓灰质炎病毒的检测和监测至关重要。
脊髓灰质炎病毒(poliovirus，PV)是一种属于小RNA病毒科的肠道病毒，可引起小儿麻痹症。近几年很多国家在贝类及水体等食品中发现了脊髓灰质炎病毒野生型 或疫苗突变株的存在。为了防止脊髓灰质炎病毒通过粪-口途径传播，加强即食性食品 中脊髓灰质炎病毒的监控至关重要。由于脊髓灰质炎病毒主要在人类排泄物和污水中存 活，即食性水果和蔬菜等在施肥和灌溉中可能受含脊髓灰质炎病毒粪便和水的污染。
然而，目前在食品中脊髓灰质炎检测存在诸多难点。与人类排泄物相比，食品 中病毒含量低得多，干扰因子和抑制因子更加复杂，对检测方法带来了巨大挑战，因此 需要针对性和灵敏度更高的检测方法。近十多年来，各国研究者建立的如巢式RT-PCR、 普通RT-PCR、ELISA等技术多应用于粪便或污水等样品的检验，而对食品基质中脊髓灰 质炎病毒检测的报道较少。目前国内外还没有食品中脊髓灰质炎病毒实时荧光RT-PCR 检测方法的报道。
目前我国对进出口食品只进行常规的细菌检测，还没有相应方法对进出口食品 脊髓灰质炎病毒进行检测。也就是说，进出口食品脊髓灰质炎病毒检测仍处于空白状 态，这严重地制约着我国食品进出口贸易的发展，威胁着人民的身体健康。然而，目前 尚没有快速简便地检测和鉴定脊髓灰质炎病毒的检测技术。
综上所述，鉴于目前尚没有特异性好、灵敏度高的食品中脊髓灰质炎病毒实时 荧光RT-PCR检测方法。因此，本领域迫切需要开发特异性好、灵敏度高的食品中脊髓 灰质炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法。发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性好、灵敏度高、准确、简便的贝类、蔬果和水等食品中脊髓灰质炎病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。
本发明的另一目的在于提供贝类、蔬果和水等食品中脊髓灰质炎病毒实时荧光 RT-PCR检测试剂盒。
本发明的再一目的在于提供贝类、蔬果和水等食品中脊髓灰质炎病毒检测相关 引物和探针。
在本发明的第一方面，提供了一种聚合酶链式反应方法，它包括步骤在聚合 酶反应体系中进行聚合酶链式反应，所述的反应体系中含有扩增脊髓灰质炎病毒的特异 性引物对和脊髓灰质炎病毒特异性探针，并且所述引物扩增出的扩增产物具有脊髓灰质 炎病毒脊髓灰质炎病毒基因组2A区的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的扩增脊髓灰质炎病毒的特异性引物对选自下组
I型脊髓灰质炎病毒SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2 ；和/或
II型脊髓灰质炎病毒SEQ IDNO 3和SEQ ID NO 4 ；和/或
III 型脊髓灰质炎病毒SEQ ID NO: 5 禾Π SEQ ID NO 6。
在另一优选例中，所述的脊髓灰质炎病毒特异性探针是Taqman-MGB探针或 Taqman 探针。
在另一优选例中，所述的脊髓灰质炎病毒特异性探针具有选自下组的核苷酸序 列SEQIDNO 7、8 禾口 / 或 9。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤在聚合酶链式反应过程中或之后，检 测脊髓灰质炎病毒特异性探针发出的荧光信号。
在另一优选例中，所述的反应体系中含有来自食品的待检测的核酸样品。
在本发明的第二方面，提供了一种检测试剂盒，它含有以下试剂
(a)扩增脊髓灰质炎病毒的特异性引物对，并且所述引物扩增出的扩增产物具有 脊髓灰质炎病毒脊髓灰质炎病毒基因组2A区；
(b)脊髓灰质炎病毒特异性探针。
在另一优选例中，所述的扩增脊髓灰质炎病毒的特异性引物对选自下组
I型脊髓灰质炎病毒SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2 ；和/或
II型脊髓灰质炎病毒SEQ IDNO 3和SEQ ID NO 4 ；和/或
III 型脊髓灰质炎病毒SEQIDNO: 5 禾Π SEQ ID NO 6。
在另一优选例中，所述的脊髓灰质炎病毒特异性探针是Taqman-MGB探针或 Taqman 探针。
在另一优选例中，所述的脊髓灰质炎病毒特异性探针具有选自下组的核苷酸序 列SEQIDNO 7、8 禾口 / 或 9。
在另一优选例中，提供了一种用于检测食品中脊髓灰质炎病毒的检测试剂盒， 其含有
(a)针对脊髓灰质炎病毒三种血清型(I、II、III型)设计的三对POL特异性引 物，所述的POL特异性引物对特异性地扩增脊髓灰质炎病毒三种血清型基因组2A区的一 段序列；
(b)Taqman-MGB探针，所述的T^aqman-MGB探针与对应的POL特异性引物扩增产物特异性结合；
(c)任选的标准参照物；
在另一优选例中，所述的标准参照物是脊髓灰质炎病毒CDNA或含脊髓灰质炎 病毒扩增目的片段的质粒DNA ；
在另一优选例中，所述的POL特异性引物选自下组
权利要求
1.一种聚合酶链式反应方法，其特征在于，它包括步骤在聚合酶反应体系中进行 聚合酶链式反应，所述的反应体系中含有扩增脊髓灰质炎病毒的特异性引物对和脊髓灰 质炎病毒特异性探针，并且所述引物扩增出的扩增产物具有脊髓灰质炎病毒脊髓灰质炎 病毒基因组2A区的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的扩增脊髓灰质炎病毒的特异性引物 对包括I型脊髓灰质炎病毒SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2 ；和/或II型脊髓灰质炎病毒SEQ ID NO 3和SEQ IDNO 4 ；和/或III型脊髓灰质炎病毒SEQ ID NO: 5禾Π SEQ ID NO 6。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脊髓灰质炎病毒特异性探针是 Taqman-MGB 探针或 Taqman 探针。
4.如权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述的脊髓灰质炎病毒特异性探 针具有选自下组的核苷酸序列SEQ ID NO: 7、8和/或9。
5.如权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤在聚合 酶链式反应过程中或之后，检测脊髓灰质炎病毒特异性探针发出的荧光信号。
6.—种检测试剂盒，其特征在于，它含有以下试剂(a)扩增脊髓灰质炎病毒的特异性引物对，并且所述引物扩增出的扩增产物具有脊髓 灰质炎病毒脊髓灰质炎病毒基因组2A区；和(b)脊髓灰质炎病毒特异性探针。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的扩增脊髓灰质炎病毒的特异性引 物对选自下组I型脊髓灰质炎病毒SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2 ；和/或II型脊髓灰质炎病毒SEQ IDNO 3和SEQ ID NO 4 ；和/或III型脊髓灰质炎病毒SEQ ID NO: 5禾Π SEQ ID NO 6。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的脊髓灰质炎病毒特异性探针是 Taqman-MGB 探针或 Taqman 探针。
9.如权利要求6-8中任一所述的试剂盒，其特征在于，所述的脊髓灰质炎病毒特异性 探针具有选自下组的核苷酸序列SEQ ID NO: 7、8和/或9。
10.如权利要求6所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于检测在食品中是否存在脊 髓灰质炎病毒。
全文摘要
本发明涉及食品中脊髓灰质炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒。具体地，本发明公开了一种检测脊髓灰质炎病毒的方法，在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，所述的反应体系中含有扩增脊髓灰质炎病毒的特异性引物对和脊髓灰质炎病毒特异性探针。本发明还提供了相应的试剂盒。本发明可灵敏、简便地检测和鉴定脊髓灰质炎病毒。
文档编号C12Q1/68GK102021248SQ20091019539
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月9日 优先权日2009年9月9日
发明者卢钟山, 吕蓉, 张舒亚, 李想, 潘良文, 黄一 申请人:上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心