一种利用脊髓灰质炎减毒株生产的灭活疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制品制备领域，具体地，涉及一种利用脊髓灰质炎减毒株Sabin 株生产的灭活疫苗。
【背景技术】
[0002] 脊髓灰质炎病毒属于小RNA病毒科（Picornaviridae)肠道病毒属 (Enterovirus)，内含单股正链RNA基因，蛋白衣壳为二十面体立体对称结构，无包膜。脊髓 灰质炎病毒有3种血清型，分别为I、II和III型。脊髓灰质炎病毒颗粒包括实心结构病毒颗 粒和空心结构病毒颗粒，其中实心结构病毒颗粒能与机体细胞反应产生中和抗体。脊髓灰 质炎是由脊髓灰质炎病毒引起的具有很强传染力的疾病，主要感染五岁以下的儿童。1/200 的患者会产生不可逆的腿部瘫痪，更严重的会导致吞咽和说话的困难。有5% -10%的患者 因为呼吸肌麻痹导致死亡。目前尚无治疗脊灰的有效手段，脊髓灰质炎疫苗的接种是最有 效的预防该疾病发生和传染的方法。
[0003]目前上市的脊髓灰质炎病毒疫苗有减毒疫苗（0PV)和灭活疫苗（IPV)。0PV是多 数国家计划免疫中的主要疫苗品种之一。1985年至2003年有超过5. 5亿儿童在94个国家 已经接种了 0PV疫苗。虽然0PV免疫力强、作用时间长，免疫剂量少，免疫程序简单，为消除 脊灰发挥了重要作用，但0PV的接种引起的脊灰疫苗相关病例（VAPP)和脊髓灰质炎疫苗衍 生株（VDPV)威胁始终存在，甚至成为影响公众健康、社会稳定的问题。由于0PV是一种减 毒活疫苗，必然存在一定的安全问题。首先，减毒的脊灰病毒一旦毒力返祖，可直接导致脊 髓灰质炎相关疾病；其次，疫苗株经循环形成的衍生株也可引发相关病例；此外，极少部分 免疫缺陷的接种者使用减毒活疫苗后会成为衍生脊灰病毒的携带者，他们会长期排出病毒 导致疾病传播。相对而言，IPV的使用则可以彻底消除减毒活疫苗引起的病毒感染以及由 疫苗衍生脊灰病毒造成的疾病爆发风险。为了彻底消除脊灰，WHO制定了全球消除脊灰行 动计划，预计到2015年消除脊灰野病毒并在2018年认证全球无脊灰状态。在此过程中，将 逐步使用IPV和sIPV代替0PV。
[0004]IPV使用野毒株salk株作为生产原料，对生物安全等级要求严格，因此生产商的 数量十分有限；此外，由于IPV的价格相对高昂，主要用于发达国家的计划免疫和发展中国 家的私人市场。
[0005]WHO推荐发展中国家在消灭脊灰最后阶段使用一种由减毒株（Sabin株）生产的新 型灭活脊灰疫苗来代替0PV疫苗的使用，从而彻底消除因接种该疫苗导致的VDPV和VAPP 的发生。这在消灭脊灰的最后阶段并全面使用灭活疫苗的背景下，具有重要的补充意义： 使用减毒株生产的Sabin-IPV，较使用野毒株（Salk株）生产的IPV灭活疫苗，具有生产更 安全、成本更低廉的特点，更适合在发展中国家推广使用。目前，对脊灰野毒株Salk株的管 理极为严格，在中国境内不允许使用野毒株来生产IPV，选择利用生产0PV用的脊灰减毒株 Sabin株研制灭活疫苗，即Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（sIPV)，是全球消除脊灰的重要途 径。
[0006] 传统的sIPV疫苗纯化工艺通常包括超滤浓缩、离子交换层析、除菌过滤等步骤。 离子交换层析的分离方法在SIPV疫苗纯化工艺中成本比较高，且无法有效地将实心病毒 颗粒与空心病毒颗粒分离。此外，由于实心病毒能与机体细胞反应，诱导机体产生中和抗 体，并经大鼠体内免疫原性试验证实：实心病毒颗粒产生的中和抗体至少是空心病毒颗粒 的10倍。另外，sIPV生产使用的减毒株Sabin株与IPV生产使用的野毒株Salk株有本质 上的区别，比如病毒的基因序列、等电点、稳定性等均不相同，由于传统的生产工艺不适应 sIPV的生产导致疫苗产率较低。因此，亟待需要一种利用减毒株Sabin株生产脊髓灰质炎 灭活疫苗新的方法，能够有效分离脊髓灰质炎病毒液中的实心病毒颗粒与空心病毒颗粒， 而且有效地去除了杂质蛋白，大大提高了离心产物中实心病毒颗粒的含量，使利用该病毒 液制备得到的脊髓灰质炎灭活疫苗免疫原性良好、有效滴度高、杂质含量低、安全性和稳定 性尚。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种免疫原性良好、有效滴度高、杂质含量低、安全性和稳 定性高的脊髓灰质炎灭活疫苗。
[0008] 本发明提供的脊髓灰质炎病毒灭活疫苗是利用减毒株Sabin株制备得到。
[0009] 进一步地，本发明的灭活疫苗是将减毒株Sabin株I型、II型、III型的单价病毒 纯化液灭活后混合，添加保护剂制备得到。
[0010] 本发明的脊髓灰质炎病毒灭活疫苗中减毒株Sabin株I型、II型、III型的抗原含 量分别为 7-25DU、25-68DU、25-68DU。
[0011] 优选地，本发明的脊髓灰质炎病毒灭活疫苗中减毒株Sabin株I型、II型、III型 的抗原含量分别为12-18DU、36-54DU、36-54DU。
[0012] 更优选地，本发明的脊髓灰质炎病毒灭活疫苗中减毒株Sabin株I型、II型、III 型的抗原含量分别为15DU、4?U、45DU。
[0013] 上述减毒株Sabin株I型、II型、III型的单价病毒纯化液通过以下方法制备得 到：
[0014] (1)分别将Sabin株I型、II型、III型病毒液超滤浓缩；
[0015] (2)蔗糖密度梯度离心；
[0016] (3)收集合并离心液。
[0017] 其中，步骤（1)的病毒液超滤浓缩是通过以下方法实现的：
[0018] 1)澄清将病毒液经连续3级孔径为3-0. 8μm、0. 8-0. 65μm、0. 65-0. 22μm的滤 芯过滤或离心（包括连续流离心）转速为2000-500()rpm，离心时间为0. 5-4个小时，得到病 毒澄清液；
[0019] 2)浓缩病毒澄清液经切向流膜过滤或中空纤维过滤浓缩，浓缩倍数为50-200 倍，使用截留分子量为100万-500万。
[0020] 其中，步骤（2)的密度梯度离心方法为：
[0021] 依次从离心机边孔以50~lOOrpm依次栗入超离缓冲液，病毒超滤浓缩液，低 浓度蔗糖溶液，最后以50~150rpm栗入高浓度蔗糖溶液直至中孔流出液体离心转速为 28000~35000rpm，离心时间为：6~20小时，离心温度为2~8°C。
[0022] 超离缓冲液与病毒超滤浓缩液的体积比为1:5~1 :10 ;病毒超滤浓缩液与低浓度 蔗糖溶液的体积比为1 :1~2:1 ;高浓度蔗糖加入标准为只要离心机中空流出液体即可停 止加入高浓度蔗糖。
[0023] 其中，所述低浓度蔗糖质量百分比为25%~45%，高浓度蔗糖质量百分比为 55%~60%〇
[0024] 其中，超离缓冲液选自0. 1~0. 5M的PB、PBS和PBST中的一种。
[0025] 进一步地，步骤（2)的密度梯度离心方法中，纯化脊髓灰质炎病毒液时，当脊髓灰 质炎病毒液为Sabin株脊髓灰质炎病毒I、II时，超离缓冲液的pH值为：6. 0~7. 0 ;当脊髓 灰质炎病毒液为Sabin株脊髓灰质炎病毒III型时，超离心缓冲液的pH值为：6. 5~7. 5。
[0026] 本发明方法的步骤（3)中，根据不同性质的病毒颗粒沉降系数不同，导致其处于 不同糖度位置，进而分离不同的超离液，即收集并合并处于相同位置的离心液。其中超离液 1(含实心病毒）主要位于糖度54 %，超离液2 (含空心病毒和少量实心病毒）为50 %-54 % 的糖度位置。
[0027] 上述步骤（3)中，收集离心液后，还包括采用离子交换层析方法对离心液进行纯 化，具体为：使用DEAES印haroseFastFlow，分别检测I、II、III型病毒颗粒的260/280 或254/280值，收集流穿峰。离子交换的pH值根据病毒型别稳定性的差异，选择范围为 pH6. 5-7. 5。平衡缓冲液和样品的电导率控制在15-45ms/cm范围内。
[0028] 本发明通过对sIPV的传统纯化工艺进行了改进，将原有的离子交换层析工艺步 骤替换为密度梯度离心（或者连续流密度梯度离心）工艺，有效地将实心病毒颗粒与空心 病毒颗粒分离，不仅提高了单位剂量sIPV病毒液的免疫原性，而且大大降低了以此病毒液 制备得到的疫苗使用后的副反应，同时降低了