一种治疗紫外线致表皮角朊细胞凋亡的药物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于含肽的医药配制品领域，具体是一种治疗紫外线致表皮角朊细胞凋亡 的药物。
【背景技术】
[0002] 皮肤分为表皮和真皮。表皮是皮肤的浅层结构，由复层扁平上皮构成。从基底层到 表面可分为五层，即基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层。基底层：位于表皮的最深层，借 基膜与深层的真皮相连。基底层是一层矮柱状上皮细胞。细胞较小、排列整齐，核呈卵圆形 胞质中常含有黑色素颗粒。矮柱状上皮细胞之间有黑色素细胞。黑色素细胞略呈圆形，有 树枝状突起，胞核较小，能产生黑色素颗粒。黑色素颗粒的多少与皮肤颜色的深浅有关。黑 色素颗粒能够吸收紫外线，使深层组织免受紫外线辐射的损害。基底层的细胞分裂比较活 跃，不断产生新细胞并向浅层推移，以补充衰老、脱落的角质细胞。因此，也称生发层。角质 层位于表皮的最浅层，由几层到几十层扁平无核角质细胞组成，细胞质内充满嗜酸性的角 蛋白，对酸、碱，摩擦等因素有较强的抵抗力。角质细胞由角朊细胞的增殖和分化而来。此 过程受机体精细调节，并伴随着一系列形态学和生化改变。角质层的表面细胞常呈小片脱 落，形成皮肩。
[0003] 人体皮肤从胚胎发育时起就是一个动力学过程，外胚层细胞通过不同的增殖，分 化和死亡，演变成皮肤，同时使皮肤分层，面积增大覆盖整个机体，随之表皮附属器也形成； 最后皮肤再成熟。再成熟的表皮角朊细胞是一个更新和修复较快的细胞群体，分为生发，分 化和角化细胞组织，此层不具有活性，是表皮细胞分化的终末产物。近年来紫外线（UV)引 起表皮细胞凋亡引起了人们的关注。已有试验证明皮肤角质形成细胞/角朊细胞（HaCaT) 随着紫外线计量的加大和时间延长，细胞的活力下降；凋亡率和死亡率升高。细胞凋亡常导 致皮肤充实度下降。但是到目前为止，降低角质形成细胞凋亡的有效治疗方法还很少。
【发明内容】
[0004] 本发明就是为了解决现有药物治疗表皮细胞凋亡的效果不能够满足临床需要的 问题，所提出的一种治疗紫外线致表皮角朊细胞凋亡的药物。
[0005] 本发明是按照以下技术方案实现的。
[0006] -种治疗紫外线致表皮角朊细胞凋亡的药物，其活性成分包括人重组表皮细胞生 长因子（EGF)与碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF)。
[0007] 重组表皮细胞生长因子的终浓度是90-110μg/ml，碱性成纤维细胞生长因子的终 浓度是 10-30μg/ml。
[0008] 本发明获得了如下的有益效果。
[0009] 本发明有效的解决了现有药物治疗表皮细胞凋亡的效果不能够满足临床需要的 问题。本发明可达到在紫外线引起角朊细胞（HaCaT)凋亡后，使用生物学治疗方式清除凋 亡、衰老的角质形成细胞，以提高角朊细胞增殖、分化的速率和效果，恢复皮肤损伤的目的， 具有广阔的应用前景和临床意义。
【附图说明】
[0010] 图1是本发明倒置光学显微镜观察〇Jm2紫外线照射后阴性对照组HaCaT细胞损 伤的形态变化图；
[0011] 图2是本发明倒置光学显微镜观察0Jm2紫外线照射后加EGF组HaCaT细胞损伤 的形态变化图；
[0012] 图3是本发明倒置光学显微镜观察0Jm2紫外线照射后加EGF和b-FGF组HaCaT 细胞损伤的形态变化图；
[0013] 图4是本发明倒置光学显微镜观察300Jm2紫外线照射后阴性对照组HaCaT细胞 损伤的形态变化图；
[0014] 图5是本发明倒置光学显微镜观察300Jm2紫外线照射后加EGF组HaCaT细胞损 伤的形态变化图；
[0015] 图6是本发明倒置光学显微镜观察300Jm2紫外线照射后加EGF和b-FGF组HaCaT 细胞损伤的形态变化图；
[0016] 图7是本发明倒置光学显微镜观察600Jm2紫外线照射后阴性对照组HaCaT细胞 损伤的形态变化图；
[0017] 图8是本发明倒置光学显微镜观察600Jm2紫外线照射后加EGF组HaCaT细胞损 伤的形态变化图；
[0018] 图9是本发明倒置光学显微镜观察600Jm2紫外线照射后加EGF和b-FGF组HaCaT 细胞损伤的形态变化图；
[0019] 图10是本发明倒置光学显微镜观察900Jm2紫外线照射后阴性对照组HaCaT细 胞损伤的形态变化图；
[0020] 图11是本发明倒置光学显微镜观察900Jm2紫外线照射后加EGF组HaCaT细胞 损伤的形态变化图；
[0021] 图12是本发明倒置光学显微镜观察900Jm2紫外线照射后加EGF和b-FGF组 HaCaT细胞损伤的形态变化图；
【具体实施方式】
[0022] 下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
[0023] 1.试剂
[0024] RPMI1640为GENMED公司的产品，其产品编号为GMS12049. 2A;
[0025] 人AB血浆购自北京红十字血液中心；
[0026] 注射用重组人重组表皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子为购自美国 ScienCell公司。重组人重组表皮细胞生长因子货号：105-04 ;重组人碱性成纤维细胞生长 因子货号：1〇4_02。
[0027] 2.实验方法
[0028] 2. 1本发明药物对紫外线致HaCaT细胞增殖的影响
[0029] (1)实验分组：阴性对照组（经紫外线照射，未加EGF和/或b-FGF);紫外线照射 加EGF(100μg/ml)组；紫外线照射加EGF(100μg/ml)和b-FGF(20μg/ml)组；
[0030] (2)将HaCaT细胞接种于6孔培养板中，接种细胞数为2X104个/孔，培养基为 RPMI1640 加 10% 人AB血浆。
[0031] (3)待细胞长至70%~80%铺满瓶底时，以PBS液（约3mL，下同）置换培养基，置 于中波紫外线灯下30cm处，紫外线按OJm2(未照射）、300Jm2、600Jm2、900Jm2照射HaCaT 细胞72h。
[0032] (4)照射完成后换培养基继续培养，按照实验分组加入各组所应加入的药物，继续 培养72h后以倒置光学显微镜观察细胞损伤的形态变化。
[0033] 图1-3为紫外线为OJm2时细胞损伤的形态变化图，其中图1为紫外线照射HaCaT 细胞72h，继续培养72h后倒置光学显微镜观察结果；图2为紫外线照射HaCaT细胞72h，加 入EFG100μg/ml继续培养72h后倒置光学显微镜观察结果；图3为紫外线照射HaCaT细 胞72h，加入EFG100μg/ml和b-FGF20μg/ml继续培养72h后倒置光学显微镜观察结果。
[0034] 图4-6为紫外线为300Jm2时细胞损伤的形态变化图，其中图4为紫外线照射 HaCaT细胞72h，继续培养72h后倒置光学显微镜观察结果；图5为紫外线照射HaCaT细 胞72h，加入EFG100μg/ml继续培养72h后倒置光学显微镜观察结果；图6为紫外线照射 HaCaT细胞72h，加入EFG100μg/ml和b-FGF20μg/ml继续培养72h后倒置光学显微镜 观察结果。
[0035] 图7-9为紫外线为600Jm2时细胞损伤的形态变化图，其中图7为紫外线照射 HaCaT细胞72h，继续培养72h后倒置光学显微镜观察结果；图8为紫外线照射HaCaT细 胞72h，加入EFG100μg/ml继续培养72h后倒置光学显微镜观察结果；图9为紫外线照射 HaCaT细胞72h，加入EFG100μg/ml和b-FGF20μg/ml继续培养72h后倒置光学显微镜 观察结果。
[0036] 图10-12为紫外线为900Jm2时细胞损伤的形态变化图，其中图10为紫外线照射 HaCaT细胞72h，继续培养72h后倒置光学显微镜观察结果；图11为紫外线照射HaCaT细 胞72h，加入EFG100μg/ml继续培养72h后倒置光学显微镜观察结果；图12为紫外线照 射HaCaT细胞72h，加入EFG100μg/ml和b-FGF20μg/ml继续培养72h后倒置光学显微 镜观察结果。
[0037] 结果表明本发明药物促进了紫外线照射后HaCaT细胞的增殖。细胞计数检测结果 表明：与阴性对照组相比，紫外线照射后加入本发明药物，HaCaT细胞的增殖率为43. 6%。
[0038] 2. 2本发明药物对紫外线致HaCaT细胞凋亡的影响
[0039] (1)将HaCaT细胞接种于6孔培养板中，接种细胞数为2X104个/孔，培养基为 RPMI1640加10 %人AB血浆。待细胞长至70 %~80 %铺满瓶底时，用消化液（0. 025胰 酶+0. 02%EDTA)在37°C下完全消化，稀释成单细胞悬液，吸取消化液于5mL离心管，4°C， 2000r/min离心lOmin;吸去上清液。
[0040] (2)用含10 %人AB血浆的RPMI1640培养基配成单个细胞悬液，以每孔IX104个 细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。
[0041] (3)实验分组：空白对照组（未经紫外线照射，未加EGF和/或b-FGF);阴性对照 组（经紫外线照射，未加EGF和/或b-FGF);紫外线照射加EGF(100μg/ml)组；紫外线照 射加b-FGF(20μg/ml)组；紫外线照射加EGF(100μg/ml)和b-FGF(20μg/ml)组；
[0042] (4)待细胞长至70 %~80 %铺满瓶底时，以PBS液（约3mL，下同）置换培养基，置 于中波紫外线灯下30cm处，紫外线按0Jm2(未照射）、300Jm2、600Jm2、900Jm2照射HaCaT 细胞72h。
[0043] (5)更换培养基后，按照实验分组加入各组所应加入的药物，继续培养72h后，每 孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH= 7. 4) 20ul，继续孵育4h。
[0044] (6)终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150ulDMS0,振荡lOmin，使结晶 物充分溶解。
[0045] (7)在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，波长为490nm，记录结果，以时间为 横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
[0046] 结果表明，本发明药物显著降低紫外线致HaCaT细胞凋亡率（见表1)。
[0047] 表1本发明药物（处理72h)对紫外线致HaCaT细胞凋亡的影响
[0048]
【主权项】
1. 一种治疗紫外线致表皮角朊细胞凋亡的药物，其特征在于：其活性成分包括人重组 表皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子。2. 根据权利要求1所述的一种治疗紫外线致表皮角朊细胞凋亡的药物，其特征在于： 重组表皮细胞生长因子的终浓度是90-110μg/ml，碱性成纤维细胞生长因子的终浓度是 10-30μg/ml〇
【专利摘要】本发明公开了一种治疗紫外线致表皮角朊细胞凋亡的药物，属于含肽的医药配制品领域。本发明所述药物的活性成分包括人重组表皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子。所述重组表皮细胞生长因子的终浓度是100μg/ml，碱性成纤维细胞生长因子的终浓度是20μg/ml。本发明有效的解决了现有药物治疗表皮细胞凋亡的效果不能够满足临床需要的问题。本发明药物可达到在紫外线引起角朊细胞凋亡后，使用生物学治疗方式清除凋亡、衰老的角朊细胞，以提高角朊细胞增殖、分化的速率和效果，恢复皮肤损伤的目的，具有广泛的应用前景和临床意义。
【IPC分类】A61K38/18, A61P17/00
【公开号】CN105396124
【申请号】CN201510851693
【发明人】刘 英
【申请人】吉林省宝沪生物科技有限公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年11月30日