专利名称：用于防止紫外线引起的皮肤细胞损伤的包含穗花杉双黄酮的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于防止紫外线引起的皮肤细胞损伤的包含穗花杉双黄酮的组合物。
背景技术：
核纤层蛋白是在细胞核中形成原纤维网络(fibrillar network)的蛋白质。核纤层蛋白根据蛋白质结构和基因表达模式分为A型和B型。核纤层蛋白A型在核膜内部形成纤层(lamina)。核纤层蛋白A型基因上的突变引起被称为核纤层蛋白病(Iaminopathy)的疾病。典型实例是Hutchison-Gilford早老综合征(HGPS)、非典型性维尔纳氏综合征和下颂末端发育不良症(mandibuloacral dysplasia，MAD)，也被称为早衰。早衰主要是由基因的第1拟4位的点突变引起的，由胸腺嘧啶代替胞嘧啶，产生一种在表达过程中不能被正确加工成蛋白质并在细胞核积聚的核纤层蛋白基因形式。早衰的代表性症状包括硬皮病皮肤、脱发、骨质缺损、牙齿形成延迟(delayed tooth formation)、生长迟缓和皮下脂肪丢失(loss of subcutaneous fat)。据报道在早衰患者中有细胞核的结构和功能异常。核畸变(nuclear aberration)是代表性实例。根据最新研究，在未患早衰的老年人中也观察到核畸变。在年龄为81-91岁之间的老年人中发生的核畸变与早衰患者的核畸变非常相似。并且，如在早衰患者中发现的，在老年人中发现DNA损伤标记磷酸化H2AX增加。因此，需要探索一种能够控制核畸变、缺陷核纤层蛋白A型的表达和磷酸化H2AX 的表达的用于抗老化的物质。
发明内容
技术问题本发明涉及用于防止由紫外线引起的皮肤细胞损伤或用于抗老化的组合物，其包含穗花杉双黄酮作为活性成分。技术方案本发明提供用于防止皮肤细胞损伤以防止由紫外线辐射引起的对皮肤细胞的核膜的损伤的组合物，其包含穗花杉双黄酮作为活性成分。本发明还提供用于防止皮肤细胞损伤以控制由紫外线辐射引起的缺陷核纤层蛋白A型的表达的组合物，其包含穗花杉双黄酮作为活性成分。本发明还提供用于防止皮肤细胞损伤以控制由紫外线辐射引起的磷酸化H2A组蛋白家族的成员X(H2AX)的表达的组合物，其包含穗花杉双黄酮作为活性成分。本发明还提供用于对抗由紫外线辐射引起的老化的组合物，其包含穗花杉双黄酮作为活性成分。本发明还提供用于防止由紫外线辐射引起的对皮肤细胞的损伤的化妆品组合物， 其包含穗花杉双黄酮作为活性成分。
本发明还提供用于防止由紫外线辐射引起的对皮肤细胞的损伤的药物组合物，其包含穗花杉双黄酮作为活性成分。在以下详细说明、附图和权利要求中会清楚其它特征和方面。
从以下所给出的特定示例性实施方案的描述并结合附图会清楚本发明的上述目的和其它目的、特征和优点，在所述附图中图1显示在19岁和39岁个体的细胞中，由紫外线B辐射引起的对细胞核的损伤；图2显示39岁个体的细胞核提取物中的早衰蛋白(progerin)( 一种核纤层蛋白突变体)和磷酸化H2AX的蛋白质印迹结果；并且图3比较在紫外线B处理组和穗花杉双黄酮处理组中，在39岁个体的细胞中由核纤层蛋白A型缺陷引起的核损伤和磷酸化H2AX表达的程度。
具体实施例方式从下文中所述的以下实施方案的说明并参考附图会清楚本发明的优点、特征和方面。但是，本发明可以以不同形式实施，而不应被解释为限于本文所述的实施方案。相反， 提供这些实施方案是为了使本发明详尽而完整，并将向本领域技术人员充分表达本发明的范围。本文所用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的，而并非意图限制示例性实施方案。除非上下文中另有明确说明，本文所用的单数形式“a”、“an”和“the”意图也包括复数形式。还应理解，当用于本说明书中时，术语“包含”和/或“包括”表示存在所述特征、 整数、步骤、操作、要素和/或组分，但不排除一种或多种其它特征、整数、步骤、操作、要素、 组分和/或它们的组合的存在或添加。下文中会参考附图详细地描述示例性实施方案。穗花杉双黄酮由化学式1表示本发明的发明人已发现用紫外线处理成纤维细胞导致缺陷核纤层蛋白A型的表达增加和核膜的结构畸变。并且，磷酸化H2A组蛋白家族的成员X(H2AX，NCBI参考序列 NP_002096. 1)的表达增加。他们还发现用穗花杉双黄酮处理降低了缺陷核纤层蛋白A型的表达，并且保持了核膜的结构。并且，经穗花杉双黄酮处理降低了 DNA损伤标记磷酸化H2AX 的表达。所述紫外线可以是紫外线A、紫外线B或紫外线C。本发明提供用于对抗由紫外线辐射引起的老化的组合物，其包含穗花杉双黄酮作为活性成分。本发明提供抗老化方法，其包括向个体给药有效量的穗花杉双黄酮。该抗老化方法可以包括向个体给药化妆品组合物或药物组合物形式的穗花杉双黄酮。本发明还提供用于防止由紫外线引起的对皮肤细胞的损伤的化妆品组合物或药物组合物，其包含穗花杉双黄酮作为活性成分。所述用于防止对皮肤细胞的损伤的药物组合物可以包含穗花杉双黄酮以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。可以按照本领域已知的方法将本发明的药物组合物制备成用于口服给药的制剂， 例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂等；或者用于肠胃外给药的制剂，例如局部用溶液剂、栓剂、无菌注射剂等。可以包含在本发明的药物组合物中的载体、 赋形剂或稀释剂可以是例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油。此外，常用的填充剂、增稠剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等可用作稀释剂或赋形剂。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等。可以通过将一种或多种赋形剂(例如淀粉、 碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等)添加到本发明的组合物中来制备固体制剂。除简单赋形剂外， 还可以添加润滑剂，例如硬脂酸镁或滑石。用于口服给药的液体制剂包括混悬剂、内部溶液剂(internal solution)、乳剂、糖浆剂等。除简单赋形剂(例如水或液体石蜡)外，它们还可以包含各种其它赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、香料、防腐剂等。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液剂、非水溶液剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。对于非水溶液剂或混悬剂， 可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、注射用酯如油酸乙酯等。作为栓剂的基质，可以使用wit印sol、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂脂(laurin butter)、甘油明胶等。可以取决于目的而将本发明的组合物口服给药或肠胃外(例如静脉内、皮下、腹内或局部)给药。可以取决于患者的情况、体重、年龄和性别、饮食、排泄率、疾病的严重性、 组合物类型、给药时间、给药方法、给药途径、给药期等而不同地确定给药剂量。基于冻干制剂的重量，每日给药剂量是100-300mg/kg，特别是100-200mg/kg。必要时，所述组合物可以一天给药一次或数次。现在会描述实施例和实验。以下实施例和实验仅用于说明的目的，而并非意图限制本发明的范围。实施例1.在19岁和39岁个体中，由紫外线B辐射引起的核纤层蛋白A型的表达将19岁或39岁个体的细胞以30，000个细胞/孔分布在装有培养基的4孔培养腔式载玻片(chamber slide)中，所述培养基是通过向106培养基中添加LSGS和100IU 青霉素G制备得到的。将细胞分成紫外线B未处理组和紫外线B处理组。第二天，用含有胎牛血清(FBS)的106培养基替换所述培养基。M小时后，用 PBS洗孔，然后仅对紫外线B处理组用200mJ/cm2的紫外线B照射。然后，再次用含有 FBS的106培养基处理，然后将细胞在37°C下培养6天。对处理后的细胞进行免疫荧光(IF) 染色。用含有ImM CaCl2和ImM MgCl2的PBS洗孔，然后将细胞在室温下在3. 5%低聚甲醛溶液中固定10分钟。将固定的细胞用PBS洗3次，每次10分钟，用0. 1% TritonX-IOO处理5分钟，然后用PBS洗3次，每次10分钟。使细胞与作为第一抗体的用含有0. 05%吐温 20的PBS(PBST)稀释至1 300的核纤层蛋白A型抗体(Santa Cruz)在4°C下反应过夜 (0/N)，然后将细胞用PBST洗3次，每次10分钟，然后与与FITC结合的第二抗体(1 400)在室温下反应1小时。然后，用PBST洗3次，每次10分钟，然后加入封固溶液并以盖玻片覆盖。将染色细胞用共聚焦激光扫描显微镜(Ziess)显像。结果显示在图1中。与19岁个体相比，在39岁个体的细胞中观察到更多的细胞核损伤。实施例2.在19岁和39岁个体中，由紫外线B辐射引起的突变体核纤层蛋白A型的表达，以及穗花杉双黄酮对其的抑制作用将19岁或39岁个体的细胞以100，000个细胞/孔分布在装有培养基的4孔培养腔式载玻片中，所述培养基是通过向106培养基中添加LSGS和100IU青霉素G制备得到的。将细胞分成紫外线B未处理阴性对照组、紫外线B处理组和紫外线B/穗花杉双黄酮处理组。第二天，用含有FBS的106培养基替换所述培养基。在紫外线B照射前先用5 μ M穗花杉双黄酮处理穗花杉双黄酮处理组。M小时后，用PBS洗孔，然后用IOOmJ/ cm2的紫外线B照射测试组。然后，再次用含有FBS的106培养基处理，然后将细胞在 37°C下培养6天。对处理后的细胞进行蛋白质印迹和免疫荧光染色。对于蛋白质印迹，将细胞用RIPA缓冲液(Sigma)溶解，并按照Lowry法定量蛋白质。使10 μ g的各蛋白质在 4-12% Nupage凝胶(Invitrogen)上流动，然后转移到NC膜上。将该膜用5% BSA封闭，并与核纤层蛋白A型突变体抗体，即分别用5% BSA稀释至1 300和1 200的早衰蛋白 (Abeam)和p-H2AX (Millipore)在4°C下反应过夜。第二天，将该膜用含有0. 05 %吐温20 的TBS (TBST)洗3次，每次10分钟，然后与HRP标记小鼠和兔第二抗体(1 1000)在室温下反应1小时。然后，用PBST洗3次，每次10分钟，然后用ECL和LAS3000检测谱带。结果显示在图2中。紫外线B辐射引起早衰蛋白(突变体核纤层蛋白A型)的增加，其通过用穗花杉双黄酮处理而得以减少。对于磷酸化H2AX也显示了相同的结果。微管蛋白用作蛋白质负荷(protein loading)对照。对于免疫荧光染色，用含有ImMCaCl2和ImMMgCl2的PBS洗孔，然后将细胞在室温下在3. 5%低聚甲醛溶液中固定10分钟。将固定的细胞用PBS洗3次，每次10分钟，用 0. 1 % TritonX-IOO处理5分钟，然后用PBS洗3次，每次10分钟。使细胞与作为第一抗体的用含有0. 05%吐温20的PBS(PBST)稀释至1 300的核纤层蛋白A型抗体(Santa Cruz) 或稀释至1 200的P-H2AX抗体(Millipore)在4°C下反应过夜，然后将细胞用PBST洗 3次，每次10分钟，然后与与FITC和罗丹明结合的第二抗体(1 400)在室温下反应1小时。然后，用PBST洗3次，每次10分钟，并用碘化丙啶(PI)将细胞核染色，然后加入封固溶液并以盖玻片覆盖。将染色细胞用共聚焦激光扫描显微镜(Ziess)显像。结果显示在图3中。在39岁个体的细胞中，紫外线B辐射导致核损伤增加和由核纤层蛋白A型缺陷引起的磷酸化H2AX的表达增加。用穗花杉双黄酮处理减少了磷酸化 H2AX的表达并维持了细胞核结构。现在会描述本发明的化妆品组合物或药物组合物的制备例。以下实施例仅用于说明的目的，而并非意图限制本发明的范围。制备例1.柔肤水(Softening lotion)(化妆水)如表1所述，按照常用方法制备柔肤水。表 权利要求
1.用于防止皮肤细胞损伤以防止由紫外线辐射引起的对皮肤细胞的核膜的损伤的组合物，其包含穗花杉双黄酮作为活性成分。
2.用于防止皮肤细胞损伤以控制由紫外线辐射引起的缺陷核纤层蛋白A型的表达的组合物，其包含穗花杉双黄酮作为活性成分。
3.用于防止皮肤细胞损伤以控制由紫外线辐射引起的磷酸化H2A组蛋白家族的成员X (H2AX)的表达的组合物，其包含穗花杉双黄酮作为活性成分。
4.用于对抗由紫外线辐射引起的老化的组合物，其包含穗花杉双黄酮作为活性成分。
5.用于防止由紫外线辐射引起的对皮肤细胞的损伤的化妆品组合物，其包含穗花杉双黄酮作为活性成分。
6.用于防止由紫外线辐射引起的对皮肤细胞的损伤的药物组合物，其包含穗花杉双黄酮作为活性成分。
全文摘要
本发明涉及用于防止紫外线引起的皮肤细胞损伤的包含穗花杉双黄酮的组合物。本发明提供用于防止由紫外线引起的皮肤细胞损伤或用于抗老化的组合物，其包含穗花杉双黄酮作为活性成分。通过控制由紫外线辐射引起的缺陷核纤层蛋白A型的表达、控制由紫外线辐射引起的磷酸化H2A组蛋白家族的成员X(H2AX)的表达或者防止核膜损伤，由此防止皮肤细胞损伤。因此，包含穗花杉双黄酮作为活性成分的组合物可以用作化妆品组合物或药物组合物。
文档编号A61Q19/08GK102342895SQ201110238460
公开日2012年2月8日 申请日期2011年7月22日 优先权日2010年7月23日
发明者曹濬喆, 朴录贤, 罗勇柱, 裵芝贤, 金志映 申请人:株式会社爱茉莉太平洋