一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法。
【背景技术】
[0002] 葡萄酒中含有丰富的多酚物质，如没食子酸，绿原酸，咖啡酸，阿魏酸和香豆酸等 等，这些酚酸赋予葡萄酒特有的感官特性和是构成葡萄酒"骨架成分"的重要活性物质，同 时也具有一定的抗氧化、捕捉自由基、预防癌症、抗衰老和防止紫外线损伤等生理功效，比 如阿魏酸也具有抑制血小板血栓素的生成，增强前列腺素活性，镇痛，缓解血管痉挛等作 用。多酚物质在葡萄酒的陈酿时期会发生各种化学反应是导致葡萄酒口感和色泽变化的一 个重要原因，对葡萄酒的风味产生了不可低估的作用，最终会影响葡萄酒的类型和品质。因 此，对葡萄酒多酚物质含量进行的检测和监控有一定的实际意义。
[0003] 由于葡萄酒中的成分很复杂，而且多酚物质含量比较低，因此，有必要对葡萄酒样 品进行前处理，现有技术的葡萄酒中多酚物质含量的测定采用如下技术方案：
[0004] 样品的前处理：AccuBond0DS-C18(500mg，6ml)固相萃取柱对样品进行前处理，使 用前要分别用6ml甲醇，6ml乙腈和10ml水预先活化。样品过柱后，依次用去离子水和5% 的甲醇淋洗柱子，采用洗脱速度为1. 5ml/min。
[0005] 本发明的是采用ProElutC18小柱，使用前只需用5ml乙腈和8ml二次去离子水 预先对其活化，样品过柱后，依次用二次去离子水、2-4%的乙腈水溶液对其进行淋洗，洗脱 速度达到了 1. 8-2.Oml/min，本发明的前处理方法采用较少的溶剂对萃取柱进行活化，且采 用比甲醇洗脱能力高的乙腈作为淋洗液，与现有技术相比，其具有更加节省溶剂和时间的 优点，同时提高样品的净化和富集率，也可以达到延长色谱系统和色谱柱寿命的作用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了解决上述的固相萃取柱活化需要较多的溶剂，而且样品净化 和富集率不高等技术问题而提供一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，该分析 方法是一种操作简单、可靠、准确，检测灵敏度高，并大大缩短了分析时间的多酚物质定性、 定量分析方法。
[0007] 本发明的技术方案
[0008] 一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，包括如下步骤：
[0009] (1)、精确吸取20-30ml的待测葡萄酒经过有机相针式过滤器过滤，然后采用固相 萃取小柱对葡萄酒进行前处理，得到待测葡萄酒样品；
[0010] 所述的有机相针式过滤器的材质为尼龙，过滤器孔径为〇. 22um-0. 45um;
[0011] 所述的固相萃取小柱对葡萄酒进行前处理的步骤如下：
[0012] 过滤后的待测葡萄酒经5-8min通过固相萃取小柱，待过滤后的待测葡萄酒全部 吸附，分别以8ml二次去离子水，5ml的体积百分比浓度为2-4%的乙腈水溶液冲洗固相萃 取小柱后，连续抽真空3-5min，用3-5ml纯乙腈溶剂洗脱，洗脱流速为1. 8-2.Oml/min，所得 的洗脱液在氮吹仪上于55°C下蒸发至近干后，用纯乙腈准确定容到1. 0-2.Oml，即得待测 葡萄酒样品；
[0013] 所述的固相萃取小柱为ProElutC18小柱；所述的体积百分比浓度为2-4%的乙 腈水溶液配制所用的水为二次去离子水；
[0014] (2)、利用安捷伦1260Infinity高效液相色谱仪，首先将高效液相色谱仪器调整 至工作状态，然后用按体积百分比计算，即乙腈：二次去离子为5-20% :80-95%的比例组成 的流动相反复冲洗色谱柱直至其基线稳定；
[0015] 然后，对步骤（1)所得的待测葡萄酒样品进行梯度洗脱分析，即得到待测葡萄酒 样品中多酚物质的高效液相色谱指纹图谱的保留时间和峰面积；
[0016] 所述的高效液相色谱仪的型号为1260Infinity，在HPLC分析中，采用二极管阵列 检测器采集波长，采集范围从190nm-210nm至390nm-410nm，检测波长为300nm-340nm，色谱 柱为AgilentHC-C18 柱子；
[0017] 所述的高效液相色谱仪的色谱条件设定如下：
[0018] 流动相为纯乙腈溶剂和体积百分比浓度为0. 1 % _0. 3 %的磷酸水溶液，体积百分 比浓度为〇. 1-0. 3%的磷酸水溶液配制所用的水为二次去离子水；
[0019] 洗脱时间为0_8min，体积百分比浓度从9% -12%变化至19% -21 %的乙腈流动 相；
[0020] 洗脱时间为8-10min，体积百分比浓度从19% -21%变化至94% -96%的乙腈流动 相；
[0021] 洗脱时间为10_13min，体积百分比浓度从94% -96%变化至89% -91 %的乙腈流 动相；
[0022] 流速为 1. 4-1. 6ml/min;
[0023] 色谱柱的温度为28-32°C;
[0024] 进样量为 5_15ul;
[0025] (3)、配制多酚物质的单一标准品溶液分别经过有机相针式过滤器过滤，而后用高 效液相色谱仪按与步骤（2)中的色谱条件相同的条件下进行分析，分别得到多酚物质的单 一标准品的高效液相色谱指纹图谱中的保留时间；
[0026] 所述的多酚物质的单一标准品溶液，分别为没食子酸的乙腈溶液、香豆酸的乙腈 溶液、绿原酸的乙腈溶液、咖啡酸的乙腈溶液、阿魏酸的乙腈溶液和槲皮素的乙腈溶液；
[0027] 与步骤（2)得到的待测葡萄酒中多酚物质高效液相色谱指纹图谱中的保留时间 进行对照，从而对待测葡萄酒中的多酚物质进行定性分析；
[0028] 或配制一系列浓度梯度的外混合多酚标准品溶液经过有机相针式过滤器过滤，而 后用高效液相色谱仪按步骤（2)中的色谱条件相同的条件下进行分析，得到一系列浓度梯 度的外混合标准溶液的高效液相色谱指纹图谱中的峰面积，以峰面积为横坐标，多酚物质 的浓度为纵坐标，得到标准多酚物质的浓度与峰面积的关系图，然后通过线性回归得到标 准多酚物质的浓度与峰面积的标准曲线方程；
[0029] 所述的一系列浓度梯度的外混合多酚标准品溶液，为没食子酸、香豆酸、绿原酸、 咖啡酸、阿魏酸和槲皮素的混合物的乙腈溶液；
[0030] 将步骤（2)中所得的待测葡萄酒样品的高效液相色谱指纹图谱中的不同峰面积 分别代入到上述的对应的不同的标准多酚物质的浓度与峰面积的标准曲线方程中，求出待 测葡萄酒样品中的不同的多酚物质的含量，从而实现对葡萄酒中的不同的多酚物质进行定 量分析。
[0031] 上述的一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，所述的多酚物质没食子 酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸，阿魏酸和槲皮素。
[0032] 本发明的有益效果
[0033] 本发明为一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，在高效液相色谱分析 法分析中，采用价格较便宜的AgilentHC-C18色谱柱，代替了价格昂贵的多酚专用色谱柱， 从而降低了对葡萄酒中多酚物质检测分析的费用。
[0034] 进一步，本发明为一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，采用固相萃 取柱对葡萄酒进行前处理，降低了样品基质的干扰，提高检测灵敏度，与传统的液液萃取方 法相比，固相萃取更加节省溶剂和时间，样品的净化和富集效率也更高。
[0035] 进一步，本发明为一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，采用外混合 多酚标准品法对葡萄酒中的多个酚类物质进行分析，得到的指纹图谱中含有6个特征峰并 对其进行指认，反映的信息量大，能更好的对葡萄酒中的多酚物质进行定性定量分析，并且 在常见浓度范围内有较好的线性关系和较高的回收率，达到控制和提高葡萄酒质量的目 的。
[0036] 进一步，本发明为一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，在仪器操作 上简单、仪器检测分析时间短，仅需12分钟，从而使整个分析流程所耗用的时间大为缩短， 为多酚物质定性定量检测提供了一种简便、快速、准确、更有效的方法。
【附图说明】
[0037] 图1、实施例1中的待测葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱指纹图；
[0038] 图2、实施例1中的待测葡萄酒与6种多酚物质的混合标准溶液的高效液相色谱指 纹图谱对照图；
[0039] 图3、实施例1中的待测葡萄酒不同浓度梯度的加标实验中多酚物质的高效液相 色谱指纹重现性对照图。
【具体实施方式】
[0040] 下面通过具体实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
[0041] 本发明采用的仪器装置和试剂：
[0042] 2ml液相自动进样瓶，50mm*0. 22um的有机相过滤膜，50mm*0. 22um的水相过滤膜， 0. 22um有机相尼龙针式滤器，购于上海安谱科学仪器有限公司；
[0043] ProElutC18固相萃取小柱，迪马科技有限公司；
[0044] HC-C18色谱柱，安捷伦仪器有限公司；
[0045] HPLC1260型高效液相色谱仪：安捷伦仪器有限公司；
[0046] 主要试剂：没食子酸、香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、槲皮素和绿原酸：SIGMA公司制造， 纯度：99%。
[0047] 检测后验证程序：考察了上述条件下的测定方法分析葡萄酒中多酚物质的可行 性。包括测定该方法的加标回收率和重现性。
[0048] 加标回收率的测定是从成品葡萄酒中，添加不同标准品浓度梯度的没食子酸、香 豆酸、阿魏酸、咖啡酸、槲皮素和绿原酸的混合溶液，对