加入和不加入6种标准品的葡萄酒 样品进行HPLC分析，测定其回收率，重复6次。
[0049] 实施例1
[0050] 一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，包括如下步骤：
[0051](1)、精确吸取25ml的待测葡萄酒酒样经过0.22um有机相针式过滤器过滤后， 8min通过固相萃取小柱（先用5ml乙腈和8ml二次去离子水预先活化），待样品全部吸附， 分别以二次去离子水、体积百分比浓度为3%的乙腈水溶液冲洗固相萃取柱后，连续抽真空 4min，用4ml纯乙腈溶剂洗脱，洗脱流速为2.Oml/min，洗脱液在氮吹仪上于55°C下蒸发至 近干，用纯乙腈溶剂准确定容到1.5ml的待测葡萄酒样品；所述的乙腈水溶液配制所用的 水为二次去离子水；
[0052](2)、将安捷伦1260Infinity高效液相色谱仪器调整至工作状态，然后用按体积 百分比计算，即乙腈：二次去离子水为10% :90%组成的流动相反复冲洗AgilentHC-C18 色谱柱直至其基线稳定；
[0053] 所述的高效液相色谱仪的型号为安捷伦1260Infinity，在HPLC分析中，采用二极 管阵列检测器采集波长，采集范围从190nm至400nm，检测波长为320nm，色谱柱为Agilent HC-C18 柱子；
[0054](3)、采用以下色谱条件进行洗脱：
[0055] 色谱柱为美国安捷伦公司HC-HC18(4. 6mmX250mm，5ul);
[0056] 流动相为纯乙腈溶剂和体积百分比浓度为0. 1 %的磷酸水溶液，磷酸水溶液配制 所用的水为二次去离子水；
[0057] 洗脱时间为8min，体积百分比浓度从10%变化至20%的乙腈流动相；
[0058] 洗脱时间为lOmin，体积百分比浓度从20%变化至95%的乙腈流动相；
[0059] 洗脱时间为13min，体积百分比浓度从95%变化至90%的乙腈流动相；
[0060] 流速为 1. 5ml/min;
[0061] 色谱柱的温度为30 °C;
[0062] 进样量为10ul;
[0063](4)、重复步骤⑴至（3)得到待测葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱指纹图谱的 保留时间和峰面积，结果见图1 ;
[0064] (5)、将没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素分别与乙腈按固液配 制为lmg/L，经过0. 22um有机相针式过滤器过滤后，再重复步骤（2)至（3)分别得到没食子 酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素的高效液相色谱指纹图谱中的保留时间，与步 骤（4)中得到的待测葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱指纹图谱即图1中的各多酚物质的 保留时间进行对照，结果见图2,从而实现对待测葡萄酒中的没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖 啡酸、阿魏酸和槲皮素等多酚物质进行定性分析；
[0065](6)、根据多酚在葡萄酒中常见的浓度范围，配制6种多酚没食子酸、香豆酸、绿 原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素与乙腈按固液比得到原始混合标准溶液，使得没食子酸、香 豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素的浓度分别为120mg/L、525mg/L、260mg/L、80mg/L、 120mg/L和120mg/L，再将原始混合标准溶液与乙腈按不同体积比计算即原始混合标准溶 液：乙腈分别为1:0. 8 ; 1:0. 6 ; 1:0. 4 ; 1:0. 2和1:0. 05,得到6组不同浓度梯度的混合标准 溶液，后将6组不同浓度梯度的混合标准溶液按步骤2至3重复6遍，取平均值，以峰面积 为横坐标（x)与浓度为纵坐标（y)分别建立这6种多酚物质的浓度与峰面积的关系图，然 后通过线性回归得到6种多酚物质的浓度与峰面积的标准曲线方程；
[0066] 将步骤⑷中所得的待测葡萄酒样品的高效液相色谱指纹图谱中的6种多酚物质 峰面积代入到上述的标准曲线方程中，求出待测葡萄酒样品中的6种多酚物质的含量，从 而实现对葡萄酒中的6种多酚物质进行定量分析。
[0067] 步骤（5)中得到这6种多酚物质的保留时间和步骤（6)中得到的这6种多酚物质 的标准曲线线性回归方程的结果见表1 ;
【主权项】
1. 一种葡萄酒中多酪物质的高效液相色谱分析方法，其特征在于： (1 )、精确吸取20-30ml的待测葡萄酒经过有机相针式过滤器过滤，然后采用固相萃取 柱对过滤后的待测葡萄酒进行前处理，得到待测葡萄酒样品； 其中，固相萃取柱对过滤后的待测葡萄酒进行前处理的步骤如下： 过滤后的待测葡萄酒经5-8min通过固相萃取小柱，待过滤后的待测葡萄酒全部吸附， 分别W 8ml二次去离子水，5ml的体积百分比浓度为2-4%的己膳水溶液冲洗固相萃取小柱 后，连续抽真空3-5min，用3-5ml纯己膳洗脱，洗脱流速为1. 8-2. Oml/min，所得的洗脱液在 氮吹仪上于55°C下蒸发至近干后，用纯己膳溶剂准确定容到1. 0-2. 0ml，即得待测葡萄酒 样品； (2) 、利用安捷伦1260 Infinity高效液相色谱仪，首先将高效液相色谱仪器调整至工 作状态，然后用按体积百分比计算，即己膳；二次去离子为5-20% ;80-95%的比例组成的流 动相反复冲洗色谱柱直至其基线稳定； 然后，对步骤（1)所得的待测葡萄酒样品进行梯度洗脱分析，即得到待测葡萄酒样品中 多酪物质的高效液相色谱指纹图谱的保留时间和峰面积； 所述的高效液相色谱仪的色谱条件设定如下： 流动相为纯己膳溶剂和体积百分比浓度为0. 1%-〇. 3%的磯酸水溶液； 洗脱时间为〇-8min，体积百分比浓度从9%-12%变化至19%-21%的己膳流动相； 洗脱时间为8-lOmin，体积百分比浓度从19%-21%变化至94%-96%的己膳流动相； 洗脱时间为l〇-13min，体积百分比浓度从94%-96%变化至89%-91%的己膳流动相； 流速为 1. 4-1. 6ml/min ; 色谱柱的温度为28-32 °C ; 进样量为5-15ul ; (3) 、配制多酪物质的单一标准品溶液，分别经过有机相针式过滤器过滤，而后用高效 液相色谱仪按与步骤（2)中的色谱条件相同的条件下进行分析，分别得到多酪物质的单一 标准品的高效液相色谱指纹图谱中的保留时间； 所述的多酪物质的单一标准品溶液，分别为没食子酸的己膳溶液、香豆酸的己膳溶液、 绿原酸的己膳溶液、咖啡酸的己膳溶液、阿魏酸的己膳溶液和搬皮素的己膳溶液； 与步骤（2)得到的待测葡萄酒中多酪物质高效液相色谱指纹图谱中的保留时间进行对 照，从而对待测葡萄酒中的多酪物质进行定性分析； 或配制一系列浓度梯度的外混合多酪标准品溶液经过有机相针式过滤器过滤，而后用 高效液相色谱仪按步骤（2)中的色谱条件相同的条件下进行分析，得到一系列浓度梯度的 外混合标准溶液的高效液相色谱指纹图谱中的峰面积，W峰面积为横坐标，多酪物质的浓 度为纵坐标，得到不同的标准多酪物质的浓度与峰面积的关系图，然后通过线性回归得到 不同的标准多酪物质的浓度与峰面积的标准曲线方程； 所述的一系列浓度梯度的外混合多酪标准品溶液，为没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡 酸、阿魏酸和搬皮素的混合物的己膳溶液； 将步骤（2)中所得的待测葡萄酒样品的高效液相色谱指纹图谱中的不同峰面积分别 代入到上述的对应的不同的标准多酪物质的浓度与峰面积的标准曲线方程中，求出待测葡 萄酒样品中的不同的多酪物质的含量，从而实现对葡萄酒中的不同的多酪物质进行定量分 析。
2. 如权利要求1所述的一种葡萄酒中多酪物质的高效液相色谱分析方法，其特征在 于所述的安捷伦1260 Infinity高效液相色谱仪，在HPLC分析中，采用二极管阵列检测器 采集波长，采集范围从190nm-210nm至390nm-410nm，检测波长为300nm-340nm，色谱柱为 Agilent 肥-C18 柱子。
3. 如权利要求1所述的一种葡萄酒中多酪物质的高效液相色谱分析方法，其特征在于 所述的有机相针式过滤器的材质为巧龙，过滤器孔径为0. 22um-0. 45um。
4. 如权利要求1所述的一种葡萄酒中多酪物质的高效液相色谱分析方法，其特征在于 所述的固相萃取小柱为ProElut C18小柱。
5. 如权利要求1所述的一种葡萄酒中多酪物质的高效液相色谱分析方法，其特征在 于，其特征在于所述的体积百分比浓度为2-4%的己膳水溶液配制所用的水为二次去离子 水，体积百分比浓度为0. 1%-〇. 3%的磯酸水溶液配制所用的水为二次去离子水。
【专利摘要】本发明公开一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，即首先取待测葡萄酒经过滤、前处理得待测样品，利用HPLC对其进行洗脱得待测样品中多酚的HPLC指纹图谱；配制单一多酚标准品溶液和一系列浓度梯度的外混合多酚标准品溶液，经过滤后在相同色谱条件下进行分析，得单一多酚标准品的HPLC指纹图谱的保留时间与待测样品中多酚的HPLC指纹图谱的保留时间进行对照，对待测样品中多酚物质进行定性分析；根据得到的外混合多酚标准品溶液的指纹图谱的峰面积计算得到不同多酚含量标准曲线方程，将待测样品中多酚的HPLC指纹图谱的峰面积代入其中来对待测样品中多酚物质进行定量分析。该方法操作简单、准确，灵敏度高，分析时间短。
【IPC分类】G01N30-14, G01N30-02, G01N30-08
【公开号】CN104535668
【申请号】CN201410654479
【发明人】冯涛, 林文华, 李明明, 谢克林, 高林林, 邴芳玲, 刘轶
【申请人】上海应用技术学院
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年11月17日