专利名称：紫外线损伤减轻用组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种紫外线损伤减轻用组合物，其包含选自由D-谷氨酸、L-谷氨酸、 D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸与它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物；和一种由紫外线暴露所导致的皮肤病及皮肤的美容状态的改善方法，其包括投与选自由D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸与它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物的步骤；和一种包括投与前述化合物的步骤的、治疗和/或预防白内障的方法。
背景技术：
紫外线可分为长于约320nm的长波长区域紫外线(UV-A)、约320nm 约^Onm的中波长区域紫外线(UV-B)、短于约^Onm的短波长区域紫外线(UV-C)。其中，由于UV-C被臭氧层吸收，所以到达地面上的太阳光中不合有UV-C。UV-A不被臭氧层吸收，占到达地面上的紫外线的大部分。此外，虽然部分UV-B被臭氧层吸收，但以UV-A的1000分之1的光量即会引起皮肤损伤。因此，UV-A及UV-B均是很重要的皮肤损伤的主要原因。根据非专利文献1，则与紫外线相关的疾病可列举出皱纹、红斑、着色性干皮病、慢性光化性皮炎、扁平上皮癌、基底细胞癌、恶性黑素瘤、鲍温病(Bowen disease)、日光性角化病、光敏症、牛痘样水疱病及光接触性皮炎；根据非专利文献2，则可列举出日光性皮炎、慢性光化性皮炎、光化性角化病、光化性唇炎、结节性类弹性纤维病Pavre-Racouchot disease)、光敏症、光接触性皮炎、伯洛克皮炎(berlock dermatitis)、光敏性药疹、多形性日光疹、牛痘样水疱病、日光性荨麻疹、慢性光敏性皮炎、着色性干皮病、雀斑、吓啉症、糙皮病、哈特纳普病(Hartnup disease)、日光性角化病、皮肌炎、扁平苔癣、毛囊角化病(Darier' s disease)、毛发红糠疹、酒渣鼻、异位性皮炎、黄褐斑、单纯疱疹及红斑狼疮等。现有技术文献非专利文献非专利文献1 皮膚疾患最新們治療2005-2006 (南江堂)非专利文献2 標準皮膚科学第7版(医学書院)
发明内容
发明要解决的问题以往由紫外线导致的皮肤损伤的预防剂和/或治疗剂已知有像用于阻碍紫外线的皮肤吸收的氧化钛那样的紫外线散射剂、像对甲氧基肉桂酸-2-乙基己酯那样的紫外线吸收剂、或用于除去由紫外线所产生的游离自由基的抗氧化剂。然而，紫外线散射剂、紫外线吸收剂对在室外的防晒有效，但不适于日常使用。此外，抗氧化剂在稳定性及安全性方面存在问题。进而，针对紫外线所引起的皮肤损伤的治疗剂仅知对症药。因此，需要开发能够日常使用的、稳定且安全的紫外线损伤的预防剂和/或治疗剂，以及含有其的药物、化妆品禾口食品。
用于解决问题的方案本发明提供一种紫外线损伤减轻用组合物，其包含选自由D-谷氨酸、L-谷氨酸、 D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸与它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物。本发明的紫外线损伤减轻用组合物可以被应用为皮肤外用剂。在本发明的紫外线损伤减轻用组合物中，前述皮肤外用剂可以被用作化妆品。在本发明的紫外线损伤减轻用组合物中，前述化妆品可以为抗皱剂。在本发明的紫外线损伤减轻用组合物中，前述化妆品可以为防晒剂。在本发明的紫外线损伤减轻用组合物中，前述皮肤外用剂可以被用作皮肤病用药物。前述皮肤病可选自由红斑、日光性皮炎、慢性光化性皮炎、光化性角化病、光化性唇炎、结节性类弹性纤维病、光敏症、光接触性皮炎、伯洛克皮炎、光敏性药疹、多形性日光疹、牛痘样水疱病、日光性荨麻疹、慢性光敏性皮炎、着色性干皮病、雀斑、P卜啉症、糙皮病、 哈特纳普病、日光性角化病、皮肌炎、扁平苔癣、毛囊角化病、毛发红糠疹、酒渣鼻、异位性皮炎、黄褐斑、单纯疱疹、红斑狼疮、扁平上皮癌、基底细胞癌及鲍温病所组成的组。在本发明的紫外线损伤减轻用组合物中，前述皮肤病用药物可以为皮肤病用治疗剂。在本发明的紫外线损伤减轻用组合物中，前述皮肤病用药物可以为皮肤病用预防剂。本发明的紫外线损伤减轻用组合物可以被用作食品。本发明的紫外线损伤减轻用组合物可以被用作白内障用药物。在本发明的紫外线损伤减轻用组合物中，前述白内障用药物可以为白内障用治疗剂或白内障用预防剂。本发明的紫外线损伤减轻用组合物可以应用为滴眼剂。前述白内障可以为老年性白内障。本发明可以提供一种治疗和/或预防由紫外线暴露所导致的皮肤病的方法，其包括投与含有选自由D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸与它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物的组合物的步骤。前述皮肤病可选自由红斑、日光性皮炎、慢性光化性皮炎、光化性角化病、光化性唇炎、结节性类弹性纤维病、光敏症、光接触性皮炎、伯洛克皮炎、光敏性药疹、多形性日光疹、牛痘样水疱病、曰光性荨麻疹、慢性光敏性皮炎、着色性干皮病、雀斑、卟啉症、糙皮病、哈特纳普病、日光性角化病、皮肌炎、扁平苔癣、毛囊角化病、毛发红糠疹、酒渣鼻、异位性皮炎、黄褐斑、单纯疱疹、红斑狼疮、扁平上皮癌、基底细胞癌及鲍温病所组成组。本发明可以提供一种皮肤美容状态的改善方法，其包括投与含有选自由D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸与它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上化合物的组合物的步骤。前述皮肤美容状态的改善方法中，前述含有选自由D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸与它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物的组合物可以为化妆品组合物或食品组合物。本发明的皮肤美容状态的改善方法中，皮肤美容状态的改善可以为抑制皱纹和/
4或防晒，但不限于这些情况。本发明提供一种治疗和/或预防白内障的方法，其包括投与含有选自由D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸与它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上化合物的组合物的步骤。本发明的治疗和/或预防白内障的方法中，前述白内障用药物可以为滴眼剂。本发明的治疗和/或预防白内障的方法中，前述白内障可以为老年性白内障。本说明书中，“盐”是指在不损害D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸的紫外线损伤的减轻效果的条件下，包括金属盐、胺盐等在内的任意的盐。 前述金属盐可以包括碱金属盐、碱土金属盐等。前述胺盐可以包括三乙胺盐、苄胺盐等。本说明书中，“它们的衍生物”是指在不损害D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、 D-半胱氨酸及L-半胱氨酸的紫外线损伤的减轻效果的条件下，D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸，或它们的氨基，或它们的羧基，或它们的侧链与任意的原子团以共价键连接而成的化合物。前述任意的原子团包括像N-苯基乙酰基、4，4’_ 二甲氧基三苯甲基(DMT)等这样的保护基，像蛋白质、肽、糖、脂质、核酸等这样的生物体高分子， 像聚苯乙烯、聚乙烯、聚乙烯基化合物(polyvinyl)、聚酯等这样的合成高分子，像酯基等这样的官能团，但不限于这些原子团。前述酯基可以包括例如甲酯、乙酯等脂肪族酯，或芳香族酯。氨基酸中存在作为光学异构体的L-体和D-体，天然的蛋白质为L-氨基酸以肽键键合而成的蛋白质，由于除了细菌的细胞壁等例外情况以外仅L-氨基酸被利用，因此认为以人类为首的哺乳类中仅存在L-氨基酸并且仅利用L-氨基酸。按照(木野内忠稔等，蛋白質核酸酵素，50 :453-46(K2005)，> 一二 >新生化学[上]第2版 ρρ132-147(1993)廣川書店，〃一 "一·生化学原書22版ρρ21-30 (1991)丸善)，一直以来，学术上也好产业上也好，作为氨基酸主要仅使用L-氨基酸。作为例外地使用D-氨基酸的例子，有作为使细菌产生的抗生物质的原料来使用的情况；以及为了节省从在化学合成氨基酸时等量获得的L-氨基酸与D-氨基酸混合物中仅分离提取L-氨基酸的成本，而直接以DL-氨基酸混合物的形式使用D-氨基酸的食品添加物的例子。然而，一直以来并没有在产业中使用游离的D-氨基酸或单独的D-氨基酸本身作为具有生理活性的物质的例子。近年来，据报道显示在人体内D-丝氨酸、D-天冬氨酸具有生理作用，明确了在哺乳类的体内也存在D-氨基酸而发挥生理作用，例如明确了在人体内也存在D-丝氨酸消旋酶等，但由于被报道的在人体内有生理作用的D-丝氨酸和L-丝氨酸、D-天冬氨酸和L-天冬氨酸显示完全不同的生理作用，因此明确了应该将D-氨基酸作为与L-氨基酸不同的物质对待，一直以来所熟知的关于氨基酸的见解可理解为关于L-氨基酸的见解。到目前为止还不知道如以下的实施例所示L-脯氨酸不具有减轻紫外线损伤的效果，而D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸具有减轻紫外线损伤的效果。因此本发明的含有选自由D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸等组成的组中的1种或2种以上化合物的紫外线损伤减轻用组合物为新发明。近年来，有报道显示，使ddY小鼠两周内自由摄入IOmM的D-氨基酸水溶液， 然后测定各器官中的D-氨基酸浓度，结果松果体中，D-氨基酸浓度相对于1个作为分泌器官的松果体为3-lOOOpmol ；脑组织中，D氨基酸浓度相对于1克湿重量为 2-500nmol (Morikawa, Α.等，Amino Acids, 32 13-20 (2007)) 基于此，算出以下说明的本发明的组合物中所含有的L-谷氨酸或D-谷氨酸、D-脯氨酸、L-半胱氨酸或D-半胱氨酸的一日摄入量的下限。如以下的实施例所示，本发明的L-谷氨酸及D-谷氨酸以单一物质在0. 1 100 μ M的浓度范围内对培养的人角质形成细胞(Keratinocytes)及成纤维细胞具有减轻紫外线损伤的效果。因此，包括本发明的药物组合物、抗皱剂及防晒剂、化妆品组合物、食品组合物在内的本发明的组合物中所含的L-谷氨酸和/或D-谷氨酸的量只要满足能够使该浓度范围的L-谷氨酸和/或D-谷氨酸的单一物质送达至生物体皮肤组织的角质形成细胞或成纤维细胞这样的条件，则何种含量均可。本发明的组合物为外用剂时L-谷氨酸和/或 D-谷氨酸的含量只要在本发明的组合物总量中占0. 000015重量％至10重量％或能够配合的最大重量浓度的范围即可。即，前述组合物为外用剂时L-谷氨酸和/或D-谷氨酸的含量优选0. 00003重量％ 0. 3重量％，最优选0. 0003重量％ 0. 03重量％。本发明的组合物为内服剂时L-谷氨酸和/或D-谷氨酸的含量只要在0. 00001重量％ 100重量％的范围即可。本发明的组合物为内服剂时L-谷氨酸和/或D-谷氨酸的含量优选0. 00002重量％ 80重量％，最优选0. 0002重量％ 60重量％。另外，本发明的组合物中所含的D-谷氨酸的一日摄入量的下限只要每Ikg体重为O.Olng即可，优选为0. lng，更优选为lng。本发明的组合物中所含的L-谷氨酸的一日摄入量的下限是少于临床药的投与量(每Ikg体重为80mg以上)的量，只要每Ikg体重为0. Img即可，优选为lmg，更优选为10mg。如以下的实施例所示，本发明的D-脯氨酸以单一物质在0.01 IyM的浓度范围内对培养的人成纤维细胞具有减轻紫外线损伤的效果。因此，本发明的药物组合物、抗皱剂及防晒剂、化妆品组合物和食品组合物中所含的D-脯氨酸的量只要满足能够使该浓度范围的D-脯氨酸单一物质送达至生物体皮肤组织的成纤维细胞这样的条件，则何种含量均可。本发明的组合物为外用剂时D-脯氨酸的含量只要在本发明的组合物总量中占 0. 000015重量％至50重量％或者能够配合的最大重量浓度的范围即可。即，前述组合物为外用剂时D-脯氨酸的含量优选0. 00003重量％ 30重量％，最优选0. 0003重量％ 3重量％。本发明的组合物为内服剂时D-脯氨酸的含量只要在0.00001重量％ 100重量％ 的范围即可。本发明的组合物为内服剂时D-脯氨酸的含量优选0.00002重量％ 80重量％，最优选0. 0002重量％ 60重量％。另外，本发明的组合物中所含的D-脯氨酸的一日摄入量的下限只要每Ikg体重为0. Olng即可，优选为0. lng，更优选为lng。如以下的实施例所示，本发明的L-半胱氨酸及D-半胱氨酸以单一物质在0. 1 100 μ M的浓度范围内对培养的人角质形成细胞及成纤维细胞具有减轻紫外线损伤的效果。 因此，包括本发明的药物组合物、抗皱剂及防晒剂、化妆品组合物和食品组合物在内的本发明的组合物中所含的L-半胱氨酸和/或D-半胱氨酸的量只要满足能够使该浓度的L-半胱氨酸和/或D-半胱氨酸的单一物质送达至生物体皮肤组织的角质形成细胞或成纤维细胞这样的条件，则何种含量均可。本发明的组合物为外用剂时L-半胱氨酸和/或D-半胱氨酸的含量只要在本发明的组合物总量中占0. 000015重量％至10重量％或能够配合的最大重量浓度的范围即可。即，前述组合物为外用剂时L-半胱氨酸和/或D-半胱氨酸的含量优选0. 00003重量％ 0. 3重量％，最优选0. 0003重量％ 0. 03重量％。本发明的组合物为内服剂时L-半胱氨酸和/或D-半胱氨酸的含量只要在0. 00001重量％ 100重量％的范围即可。本发明的组合物为内服剂时L-半胱氨酸和/或D-半胱氨酸的含量优选 0. 00002重量％ 80重量％，最优选0. 0002重量％ 60重量％。另外，本发明的组合物中所含的D-半胱氨酸的一日摄入量的下限只要每Ikg体重为0. Olng即可，优选为0. lng，更优选为lng。本发明的组合物中所含的L-半胱氨酸的一日摄入量的下限是少于临床药的投与量(每Ikg体重为;3mg以上)的量，只要每Ikg体重为0. Olmg即可，优选为0. Img,更优选为Img0本发明的药物组合物除了含有选自由D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸的单一物质，D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸的盐，能够在生物体内通过药物代谢酶等放出D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸的衍生物所组成的组中的1种或2种以上的化合物，还可以在不损害 D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸的紫外线损伤的减轻效果的条件下含有1种或2种以上的药学上允许的添加物。前述添加物包括稀释剂及膨胀剂、粘合剂及粘接剂、润滑剂、助流剂、增塑剂、崩解剂、载体溶剂、缓冲剂、着色材料、香料、甜味剂、 防腐剂及稳定化剂、吸附剂、本领域技术人员所已知的其他药物添加剂，但不限于这些添加物。本发明的抗皱剂和/或防晒剂还可仅使用D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸的单一物质，D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸的盐和/或能够在生物体内通过药物代谢酶等放出D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸的衍生物作为有效成分进行制备，但通常可以在不损害本发明的效果的范围内根据需要适当配合含有准药物(quasi drug)的化妆品、药物等皮肤外用剂等中使用的其他成分。作为前述其他成分(任意配合成分)，可列举出例如油分、表面活性剂、粉末、着色材料、水、醇类、增稠剂、螯合剂、硅酮类、抗氧化剂、紫外线吸收剂、保湿剂、 香料、各种药效成分、防腐剂、PH调节剂、中和剂等。本发明的皮肤外用剂及化妆品组合物只要是例如软膏、乳霜、乳液、化妆水、面膜、 浴用剂等现有皮肤外用剂及化妆品组合物中所用者即可，其剂型不限。本发明的化妆品组合物可以在不损害D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸的紫外线损伤的减轻效果的条件下根据需要适当配合含有准药物的化妆品、药物等皮肤外用剂等中使用的其他成分。作为前述其他成分(任意配合成分)，例如可列举出油分、表面活性剂、粉末、着色材料、水、醇类、增稠剂、螯合剂、硅酮类、抗氧化剂、紫外线吸收剂、保湿剂、香料、各种药效成分、防腐剂、PH调节剂、中和剂等。本发明的食品组合物除了含有D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及 L-半胱氨酸的单一物质，D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸的盐和/或能够在生物体内通过药物代谢酶等放出D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸的衍生物，还可以在不损害D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸的紫外线损伤的减轻效果的条件下含有调料、着色材料、保存料等作为食品所允许的成分。本发明的食品组合物只要是例如清凉饮料、橡皮糖、糖果(candy)、清凉果片等现有食品组合物中所用者即可，但不限于这样的例示。
紫外线暴露被认为不仅是皮肤病而且是眼疾病特别是白内障的原因之一。已知长时间紫外线暴露会使小鼠的晶状体的前部皮质产生白浊，实验中可制作白内障模型(前里多佳美及K岩田修造，《水晶体受的生化学的機構》，318-323页，岩田修造編、乂 rM力&葵出版、東京(1986))。此外，认为老年性白内障的原因之一为紫外线(藤永豊、“白内障眼科 MOOK N No. 17”，10頁，三島濟一 6編、金原出版、東京(1982))，Zigman等根据马尼拉、坦帕及罗切斯特的免疫学调查，显示紫外线的照射量与白内障的发生率相关，紫外线为白内障的危险因子(Zigman, S.等，Invest. Ophthalmol. Visual Sci. 18 :462-467 (1979))。因此， 根据这些见解和以下的实施例，具有减轻紫外线损伤的效果的D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸对白内障的预防或治疗有效。
图1为表示正常人表皮角化细胞的D-谷氨酸处理的效果的图。图2为表示正常人真皮成纤维细胞的紫外线照射后的D-脯氨酸处理的效果的图。图3为表示正常人真皮成纤维细胞的紫外线照射前的D-脯氨酸处理的效果的图。图4为表示正常人真皮成纤维细胞的紫外线照射前的D-脯氨酸处理及谷氨酸处理的效果的图。图5为表示正常人表皮角化细胞的半胱氨酸处理的效果的图。图6为表示XP细胞中的L-谷氨酸及D-谷氨酸处理的效果的图。图7为表示XP细胞中的L-脯氨酸及D-脯氨酸处理的效果的图。图8为表示XP细胞中的L-半胱氨酸及D-半胱氨酸处理的效果的图。
具体实施例方式以下说明的本发明的实施例仅以例示为目的，并不限定本发明的技术范围。本发明的技术范围仅限于专利权利要求的记载。实施例1D-谷氨酸的紫外线损伤减轻效果细胞细胞使用市售的人新生儿表皮角化细胞(Cryo NHEK-Neo，三光纯药)。前述细胞按照2X IO5个/mL的方式播种至市售的被I型胶原蛋白包被的35mm直径的培养皿(C0L1， AGC TECHNO GLASS CO. ,LTD.)中，使用市售的无血清培养基(Defined Keratinocyte-SFM， Gibco公司，以下称为“普通培养基1”。)进行培养。每两天更换培养基，在37°C、5% (X)2 及饱和水蒸气气氛下对前述细胞培养5至7天，直至铺满(confluent)为止。研究在紫外线照射前添加谷氨酸的处理(以下称为“前处理”。)的效果时，在照射M小时前，更换为添加了 0. 1至100 μ M的L-谷氨酸或D-谷氨酸的培养基。紫外线照射在UV-B照射前将培养基置换为PBSlmL。UV-B照射如下实施使用自制的紫外线曝光装置(紫外线荧光灯，东芝医疗用品TOREX FL20S-E-30/DMR，2根)，在除去了培养皿盖的状态下，从该培养皿的40cm上方以75J/cm2照射^Onm至320nm的紫外线。紫外线量使用 UV RADIOMETER UVR-3036/S (株式会社 T0PC0N)进行测定。
将经紫外线照射处理过的细胞返回至普通培养基1中，在37°C、5% CO2及饱和水蒸气气氛下培养21小时。研究在紫外线照射后添加谷氨酸的处理(以下称为“后处理”。) 的效果时，向该培养21小时的培养基中添加0. 1至100 μ M的L-谷氨酸或D-谷氨酸。细胞损伤的定量之后， 向培养基中添力口 alamarBlue(商标，Biosource, Biosource · International)使其最终浓度达到10 %，3小时后，按照Ahmed S. A.等 (J. Immunol. Method. 170,211-224(1994))及制造者的指示书，以激发波长M4nm、荧光波长590nm测定上清的荧光强度。结果图1示出了调查D-谷氨酸对由UV-B 75mJ/cm2的紫外线照射所导致的角质形成细胞的细胞损伤的效果的实验结果。各实验条件的误差棒表示在同一条件下重复8次的实验结果的测定值的标准偏差。此外，星号O表示Bonferroni检验下P不足的情况。UV 非照射的情况下，alamarBlue (商标)的荧光强度约为22000，由UV-B照射引起细胞损伤时，荧光强度降低至5000至7000。然而，添加D-谷氨酸时，荧光强度增加，细胞损伤减轻。 该细胞损伤的减轻效果与在UV照射之前或之后实施D-谷氨酸处理无关，若提高D-谷氨酸的浓度，则减轻效果也变大。通过L-谷氨酸的添加，并未看到细胞损伤的减轻效果(未图示)。由以上结果可知，D-谷氨酸浓度依赖性地减轻角质形成细胞的由UV-B所导致的细胞损伤。实施例2D-脯氨酸的紫外线损伤减轻效果细胞细胞使用市售的人新生儿真皮成纤维细胞(Cryo NHDF-Neo，三光纯药)。前述细胞按照2 X IO5个/mL的方式播种至市售的35mm直径的培养皿(BD FALCON 353001，日本 Becton · Dickinson)中，使用向市售的细胞培养用培养基(D_MEM(lg/L葡萄糖)，和光纯药)中添加了 10%胎牛血清的培养基(以下称为“普通培养基2”。)进行培养。在37°C、 5% CO2及饱和水蒸气气氛下对前述细胞培养约M小时。之后，将用于培养前述细胞的培养基更换为添加有IX 10_3%作为谷胱甘肽的生物合成抑制剂的BSO (L-buthionine-(S, R)-sulfoximine，和光纯药)的BSO培养基ImL，在 37°C,5% CO2及饱和水蒸气气氛下培养约M小时。前述BSO培养基如下制备将乙醇中溶解有0. 2% BSO的保存用原液用前述普通培养基2稀释200倍。研究在紫外线照射前添加脯氨酸的处理(以下称为“前处理”。)的效果时，在照射M小时前，更换为添加有0. 1 μ M的L-脯氨酸或D-脯氨酸的培养基。紫外线照射用培养基将氯化铁(II)按照2Χ10_3%的方式溶解至蒸馏水中，用含有钙离子、镁离子的磷酸缓冲液PBS(+)按照稀释200倍(终浓度1X10_5%)的方式稀释该溶解液，将如此制作的培养基(以下称为“紫外线照射用培养基”。)预先加热至37°C后再使用。紫外线照射在UV-A照射前将培养基置换为前述紫外线照射用培养基lmL。UV-A照射如下实施使用紫外线均勻曝光装置UVE-502S+EL-160(三永电机制作所)，在除去培养皿盖的状态下，从该培养皿的大约20cm上方，以15J/cm2及22. 5J/cm2照射320nm至400nm的紫外线。紫外线量使用UV RADIOMETER UVR-3036/S(株式会社T0PC0N)进行测定。在紫外线照射后添加脯氨酸的处理紫外线照射处理后，返回至前述普通培养基2中，在37 °C、5 % (X)2及饱和水蒸气气氛下培养21小时。研究在紫外线照射后添加脯氨酸的处理(以下称为“后处理”。)的效果时，向该培养21小时的培养基中添加0. 01至1000 μ M的L-脯氨酸或D-脯氨酸。后处理时的细胞损伤的定量之后，荧光强度按照实施例1中说明的方法进行测定。后处理的结果图2示出了 D-脯氨酸对由UV-A 15J/cm2及22. 5J/cm2的紫外线照射所导致的成纤维细胞的损伤的效果的实验结果。各实验条件的误差棒表示在同一条件下重复4次的实验结果的测定值的标准偏差。另外，星号O表示Bonferroni检验下ρ不足5%的情况。UV 非照射的情况下，alamarBlue (商标)的荧光强度约为12000，由UV_A 15J/cm2的照射引起细胞损伤时，荧光强度降低至约5000。另外，由UV-A 22.5J/cm2的照射引起细胞损伤时，荧光强度降低至约3000。然而，添加D-脯氨酸时，荧光强度增加，细胞损伤减轻。表1示出了调查L-脯氨酸及D-脯氨酸对由UV-A 12. 5J/cm2及15J/cm2的紫外线照射所导致的成纤维细胞的损伤的效果的实验结果。各实验条件的误差棒表示在同一条件下重复4次至6次的实验结果的测定值的标准偏差。此处，星号O 1为Bonferroni检验下与对照相比的P不足0.1%、与L-脯氨酸相比的ρ为0.1%的情况。另外，星号02表示 Bonferroni检验下与对照相比的ρ不足0. 1%、与L-脯氨酸相比的ρ不足5%的情况。UV 非照射的情况下，alamarBlue (商标)的荧光强度为约12000，由UV-A 12. 5J/cm2及UV-A 15J/cm2的照射引起细胞损伤时，荧光强度降低至约2500及约1000。通过L-脯氨酸的添加，细胞损伤基本没有减轻。然而，添加D-脯氨酸时，荧光强度增加，细胞损伤减轻。表 1
荧光强度紫外线照射量(J/cm2)对照D-脯氨酸(0.1//M)L-脯氨酸(0.1尨M)012380 ± 2112270 士 6812211 土 7712.52503 土 W94615 土 1218 *12877 土 M4151018 ± 892365 土 648*21552 士 320平均值士标准差；N = 4-6 与对照相比的P < 0. 001，与L-脯氨酸相比的 P < 0. 001Bonferroni检验”与对照相比的P < 0. 001，与L-脯氨酸相比的P < 0. 05前处理时的细胞损伤的定量细胞损伤性通过如下进行定量用0. 25%胰蛋白酶-EDTA(GIBCO)进行5分钟处理后剥离细胞，然后进行离心、洗涤，通过0.2%台盼蓝(trypan blue)染色(GIB CO)来确认生死，从而进行定量。前处理的结果图3示出了调查D-脯氨酸对由22. 5J/cm2的紫外线照射所导致的成纤维细胞的损伤的效果的实验结果。各实验条件的误差棒表示在同一条件下重复4次的实验结果的测定值的标准偏差。另外，星号O表示Bonferroni检验下ρ不足的情况。UV非照射的情况下，活细胞率为约95%，由UV-A 22. 5J/cm2的照射引起细胞损伤时，活细胞率降低至约30%。然而，添加D-脯氨酸时，活细胞率增加至约50%，细胞死亡减轻。由以上结果可知，细胞损伤的减轻效果与在UV照射之前或之后实施D-脯氨酸处理无关。此外，显示出D-脯氨酸浓度依赖性地减轻成纤维细胞的由UV-A所导致的细胞损伤。实施例3D-脯氨酸及D-谷氨酸的紫外线损伤减轻效果的比较方法细胞使用市售的人新生儿真皮成纤维细胞(Cryo NHDF-Neo，三光纯药)，与实施例 2中说明的方法同样地进行培养。研究在紫外线照射前添加D-脯氨酸或D-谷氨酸的处理的效果时，在照射M小时前更换为添加有0. 1 μ M的D-脯氨酸或者1 μ M的L-谷氨酸或 D-谷氨酸的培养基。将未添加这些氨基酸的培养基直接进行紫外线照射的情况作为对照。 UV-A的紫外线照射5J/cm2)和利用alamarBlue (商标)的细胞损伤的定量与实施例2 中说明的方法同样地实施。结果图4示出了调查D-脯氨酸、L-谷氨酸或D-谷氨酸对由UV-A22. 5J/cm2的紫外线照射所导致的成纤维细胞的损伤的效果的实验结果。各实验条件的误差棒表示在同一条件下重复4次的实验结果的测定值的标准偏差。另外，星号O表示Bonferroni/Durm检验下P不足的情况。对照的荧光强度为约1100。另外，添加了 D-脯氨酸、L-谷氨酸或D-谷氨酸时的荧光强度为约1750、约1100或约1700。由以上结果显示，D-脯氨酸及D-谷氨酸在统计学上显著地减轻正常人真皮成纤维细胞的由UV-A所导致的细胞损伤。然而，并未看出L-谷氨酸具有细胞损伤的减轻效果。此外还显示，与D-谷氨酸相比，D-脯氨酸以10分之1的浓度即能减轻紫外线损伤。实施例4L-半胱氨酸及D-半胱氨酸的紫外线损伤减轻效果细胞细胞使用市售的人新生儿表皮角化细胞(Cryo NHEK-Neo，三光纯药)。前述细胞按照IX IO5个/mL的方式播种至市售的被I型胶原蛋白包被的35mm直径的培养皿(C0L 1， AGC TECHNO GLASS CO.，LTD.)中。向市售的无血清培养基(Defined Keratinocyte-SFM, Gibco公司，以下称为“普通培养基3”。)中添加增殖添加剂(Defined Keratinocyte-SFM Growth Supplement, Gibco公司)及抗生物质(PSF 青霉素、链霉素及两性霉素 B(Fimgiz0ne)),在37°C、5% CO2及饱和水蒸气气氛下对前述细胞培养3天。之后，用添加有100 μ M的D-丙氨酸、D-丝氨酸、D-羟基脯氨酸、D-天冬氨酸、D-半胱氨酸或L-半胱氨酸的2mL的普通培养基3培养2天。作为对照，向普通培养基3中添加PBS来代替D-氨基酸。紫外线照射在UV-B照射前将培养基置换为PBSlmL。UV-B照射如下实施使用自制的紫外线曝光装置(紫外线荧光灯，东芝医疗用品TOREX FL20S-E-30/DMR，2根)，在除去培养皿盖的状态下，从该培养皿的40em上方以25J/cm2照射^Onm至320nm的紫外线。紫外线量使用 UV RADIOMETER UVR-3036/S (株式会社 T0PC0N)进行测定。使用添加有100 μ M的D-丙氨酸、D-丝氨酸、D-羟基脯氨酸、D-天冬氨酸、D-半胱氨酸或L-半胱氨酸的900 μ L的普通培养基3，在37°C、5% CO2及饱和水蒸气气氛下对经紫外线照射处理过的细胞培养M小时。细胞损伤的定量之后，荧光强度按照实施例1中说明的方法进行测定。结果图5示出了调查半胱氨酸对由UV-B 25mJ/cm2的紫外线照射所导致的角质形成细胞的细胞损伤的效果的实验结果。各实验条件的误差棒表示在同一条件下重复4次的实验结果的测定值的标准偏差。此外，星号O表示学生t检验下ρ不足的情况。发生由UV-B照射所导致的细胞损伤后的alamarBlue (商标)的荧光强度，在添加有D-丙氨酸时为约570，在未添加D-丙氨酸时为约550。添加有D-丝氨酸时的荧光强度为约490，未添加D-丝氨酸时的荧光强度为约500。添加有D-羟基脯氨酸时的荧光强度为约550，未添加D-羟基脯氨酸时的荧光强度为约550。添加有D-天冬氨酸时的荧光强度为约600，未添加D-天冬氨酸时的荧光强度为约600。添加有D-半胱氨酸时的荧光强度为约700，未添加D-半胱氨酸时的荧光强度为约600。添加有L-半胱氨酸时的荧光强度为约700，未添加 L-半胱氨酸时的荧光强度为约600。由以上结果显示，半胱氨酸的L-体及D-体这两者在统计学上均显著地减轻细胞损伤。实施例5XP细胞中的紫外线损伤减轻效果方法使用从日本健康科学基金会(JAPAN HEALTH SCIENCESF0UNDATI0N)获取的来源于着色性干皮病(A群)患者的人真皮成纤维细胞(XP30S(SVT)，以下称为“XP细胞”。)，与实施例3中说明的方法同样地进行培养。0. 1 μ M的L-谷氨酸或D-谷氨酸、脯氨酸及半胱氨酸的前处理和细胞损伤的定量按照实施例3中说明的方法进行。此外，UV-A照射如下实施使用紫外线均勻曝光装置UVE-502S+EL-160(三永电机制作所)，在除去培养皿盖的状态下，从该培养皿的约20cm上方以lj/cm2照射320nm至400nm的紫外线。紫外线量使用 UV RADIOMETER UVR-3036/S (株式会社 T0PC0N)进行测定。L-谷氨酸及D-谷氨酸的结果图6示出了调查L-谷氨酸及D-谷氨酸对由紫外线照射所导致的成纤维细胞的损伤的效果的实验结果。各实验条件的误差棒表示在同一条件下重复2次的实验结果的测定值的标准偏差。荧光强度在紫外线非照射并且氨基酸非添加的条件(以下称为“紫外线非照射条件”。)下为约690，在紫外线照射并且氨基酸非添加的条件(以下称为“阴性对照”。)下为约630。添加有0. 1 μ M的L-谷氨酸或D-谷氨酸时的荧光强度为约658或约675。由以上结果显示，L-谷氨酸及D-谷氨酸均减轻XP细胞的由UV-A所导致的细胞损伤。L-脯氨酸及D-脯氨酸的结果图7示出了调查L-脯氨酸及D-脯氨酸对由紫外线照射所导致的成纤维细胞的损伤的效果的实验结果。各实验条件的误差棒表示在同一条件下重复2次的实验结果的测定值的标准偏差。荧光强度在紫外线非照射条件下为约690，在阴性对照下为约630。添加了 0. ΙμΜ 的L-脯氨酸或D-脯氨酸时的荧光强度为约583或约664。由以上结果显示，D-脯氨酸减轻XP细胞的由UV-A所导致的细胞损伤。L-半胱氨酸及D-半胱氨酸的结果图8示出了调查L-半胱氨酸及D-半胱氨酸对由紫外线照射所导致的成纤维细胞的损伤的效果的实验结果。各实验条件的误差棒表示在同一条件下重复2次的实验结果的测定值的标准偏差。荧光强度在紫外线非照射条件下为约690，在阴性对照下为约630。添加了 0. 1 μ M 的L-半胱氨酸或D-半胱氨酸时的荧光强度为约688或约638。由以上结果显示，L-半胱氨酸及D-半胱氨酸均减轻XP细胞的由UV-A所导致的细胞损伤。以下示出基于本发明的含有选自由D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸或L-半胱氨酸等组成的组中的1种或2种以上化合物的乳液制剂、贴剂、片剂、软胶囊、颗粒、饮料、糖果、饼干、味噌、法式色拉调味汁、蛋黄酱、法式面包、酱油、酸奶、撒在饭上的粉状食品、调料 纳豆的佐料汁、纳豆、醪醋、乳霜、身体用乳霜、凝胶剂、剥离型面膜O^eel-off mask)、浸渗型面膜、乳液、化妆水及气雾剂的配方例。这些配方例以例示为目的而被列举， 意不在于限定本发明的范围。配方例1(乳液制剂)
1权利要求
1.一种紫外线损伤减轻用组合物，其特征在于，其包含选自由D-谷氨酸、L-谷氨酸、 D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸与它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，其被应用为皮肤外用剂。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，其被用作化妆品。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，其为抗皱剂。
5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，其为防晒剂。
6.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，其被用作皮肤病用药物。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述皮肤病选自由红斑、日光性皮炎、 慢性光化性皮炎、光化性角化病、光化性唇炎、结节性类弹性纤维病、光敏症、光接触性皮炎、伯洛克皮炎、光敏性药疹、多形性日光疹、牛痘样水疱病、日光性荨麻疹、慢性光敏性皮炎、着色性干皮病、雀斑、吓啉症、糙皮病、哈特纳普病、日光性角化病、皮肌炎、扁平苔癣、毛囊角化病、毛发红糠疹、酒渣鼻、异位性皮炎、黄褐斑、单纯疱疹、红斑狼疮、扁平上皮癌、基底细胞癌及鲍温病所组成的组。
8.根据权利要求6或7所述的组合物，其特征在于，所述皮肤病用药物为皮肤病用治疗剂。
9.根据权利要求6或7所述的组合物，其特征在于，所述皮肤病用药物为皮肤病用预防剂。
10.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，其被用作食品。
11.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，其被用作白内障用药物。
12.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述白内障用药物为白内障用治疗剂或白内障用预防剂。
13.根据权利要求11或12所述的组合物，其特征在于，其被应用为滴眼剂。
全文摘要
开发能够日常使用的、稳定且安全的紫外线损伤减轻用组合物以及含有其的药物、化妆品及食品组合物。本发明提供一种紫外线损伤减轻用组合物，其包含选自由D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-脯氨酸、D-半胱氨酸及L-半胱氨酸与它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物。前述组合物可被用作皮肤外用剂、化妆品组合物、抗皱剂、防晒剂、用于治疗和/或预防皮肤病的药物组合物、食品组合物、白内障的预防或治疗用药物组合物。
文档编号A61K8/44GK102365086SQ20108001413
公开日2012年2月29日 申请日期2010年3月30日 优先权日2009年3月30日
发明者三田真史, 东条洋介, 岛田正一郎, 松本华代, 水本智惠子, 芦田丰 申请人:株式会社资生堂