ovR2E蛋白在HBV感染治疗中疗效的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及OVR2E蛋白在HBV感染治疗中疗效的应用。
【背景技术】
[0002]乙型肝炎病毒(hepatitis B virus)是引起人类急、慢性肝炎的DNA病毒，如今，HBV感染严重威胁人类健康，全世界每年约有一百多万人死于HBV感染引起的肝衰竭、肝硬化和肝癌。
[0003]目前，IFN-α是目前治疗慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者的一线药物之一，尽管近年长效IFN-α应用提高了药物疗效和依从性，然而不论是调整用量、选用不同分子亚型或是延长患者疗程，IFN-α治疗CHB应答率仍然只有30-50%，远期再活动比例仍高，因此如何提高IFN- α抑制HBV复制活性并改善其抗病毒治疗效果是当前紧迫的临床问题之一。
[0004]人IFN-a (human IFN-α，hlFN-α )通过与人 I 型干扰素受体(human type IInterferon receptor，简称hlFNAR)膜型亚基(包括hlFNARl和hIFNAR_2c)结合形成复合物传递细胞信号抑制乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)复制，因此影响配体与细胞膜型亚基复合物形成是改变hlFN- α抗病毒活性的潜在策略之一。
【发明内容】
[0005]针对以上技术问题，本发明公开了ovR2E(extracellular domain of ovine typeI interferon receptor，绵羊I型干扰素受体亚基2胞外区段)蛋白在HBV感染治疗中疗效的应用，发明人通过大量实验发现，ovR2E蛋白可与人IFN- α结合并增强配体抑制HBV复制活性，提高HBV感染治疗的疗效。
[0006]对此，本发明的技术方案为:
0VR2E蛋白在HBV感染治疗中疗效的应用，ovR2E蛋白与hlFN-α结合后，促进配体与hIFNA-2c结合，增强配体抑制HBV复制活性。
[0007]作为本发明的进一步改进，ovR2E蛋白直接与hlFN-α结合，增强hlFN-α对下游MxA基因启动子的激活作用。
[0008]作为本发明的进一步改进，ovR2E蛋白显著提高hlFN- α抑制HBV复制活性，促进配体对细胞内和上清HBVDNA水平的下调作用。
[0009]作为本发明的进一步改进，hR2a蛋白对配体抑制HBV复制作用具有负性调节作用。
[0010]作为本发明的进一步改进，ovR2E蛋白用于制备提高IFN-α治疗CHB疗效的合剂。
[0011]进一步的，0VR2E蛋白与hlFN-α结合用于制备提高IFN-α治疗CHB疗效的合剂。
[0012]IFN-a是目前治疗慢性乙型肝炎患者的一线药物之一，尽管近年长效IFN-α应用提高了药物疗效和依从性，然而不论是调整用量、选用不同分子亚型或是延长患者疗程，IFN- α治疗CHB应答率仍然只有30_50%，远期再活动比例仍高，因此如何提高IFN- α抑制HBV复制活性并改善其抗病毒治疗效果是当前紧迫的临床问题之一。我们的研究工作首次证明ovR2E蛋白可与hlFN- α结合并提高细胞干扰素刺激基因转录活性，上调配体抑制HBV复制水平，由于OvR2E蛋白能提高hlFN-α抑制HBV活性机制，因此可能未来与IFN-a制备成合剂，用于提高干扰素治疗CHB的疗效，我国有近9600万HBV感染患者，因此该应用前景具有较好的理论和现实意义。
[0013]本发明的有益效果为:ovR2E蛋白提高hlFN-α抑制HBV复制水平，hR2a蛋白对配体抑制HBV复制作用无增强调节作用，ovR2E蛋白可与IFN-α结合并增强配体抑制HBV复制活性，为未来ovR2E蛋白与IFN-a制备成合剂用于提高IFN-α治疗CHB的疗效奠定了基础，为CHB治疗提供了新途径。
【附图说明】
[0014]图1是本发明一种实施例蛋白表达和结合实验结果，其中:
A为pET-28a-ovR2E原核表达载体表达His-0VR2E蛋白的结果；其中1、2分别指细菌胞浆和上清采用western blot检测结果
B为采用pET-28a-hR2a原核表达载体表达His_hR2a蛋白的结果；其中1、2分别指细菌胞楽和上清采用western blot检测结果。
[0015]C为采用western blot检测确认融合蛋白和酶切后蛋白表达图。
[0016]D为32P_ovR2E蛋白与hlFN- α进行交联结合反应经SDS_ PAGE电泳图。
[0017]E为32P_hR2a蛋白与hlFN- α进行交联结合反应经SDS_ PAGE电泳图。
[0018]图2是ovR2E提高hlFN- α活性研究分析结果图；
其中，Α为不同表达方式获得hR2a蛋白与hlFN-α混合后对MxA基因启动子活性(荧光素酶活性相对定量)影响分析图；
B为不同表达方式获得的ovR2E蛋白与hlFN- α混合后对MxA基因启动子活性(荧光素酶活性相对定量)影响分析图；
C为ovR2E与hlFN- α混合后对细胞内HBV复制水平(定量采用qPCR检测后采用loglO值进行比较分析)影响分析图；
D为ovR2E与hlFN-α混合后对培养上清HBV复制水平(定量采用qPCR检测后采用loglO值进行比较分析)影响分析图；
E为ovR2E与hlFN- α不同比例混合后对MxA基因启动子活性影响分析图；
F为hR2a与hlFN- α不同比例混合后对MxA基因启动子活性影响分析图；
*，统计学分析组间比较P〈0.01。
[0019]图3为ovR2E蛋白提高hlFN-α抑制HBV复制的Southern blot分析图。
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
[0021]体外表达、纯化获得ovR2E蛋白并完成其与配体结合实验:
(1)构建绵羊ovR2E和shIFNAR-2a的原核表达载体和蛋白纯化研究:
采用trizol提取绵羊肺成纤维样细胞(细胞编号:She印L1)总RNA，RT-PCR扩增绵羊I 型干扰素受体亚基 2 胞外区段(extracellular domain of ovine type I interferonreceptor，简称ovR2E) mRNA，其扩增引物为:
ovR2ER: 5-AGACGCGGATCCTCGTATGTTGTGCCTGATCT-3ovR2EL: 5-CCGCTAGAATTCTTATGTAGCAGGTTCT GATGACT-3，
扩增的ovR2E基因片段为绵羊IFNAR2胞外主要活性区域(第27-246位氨基酸)(ProcNatl Acad Sci USA.2001; 98 (11): 6138-43)，氨基酸序列如下所示:
MLLSQNVSAIGPLNLYPMVHISLVFGISYVVPDLSDESCTLKMRFRNFQSILSWE