专利名称：红色荧光蛋白酵母细胞表达载体及构建方法
技术领域：
本发明属于基因生物工程领域，具体涉及一种红色荧蛋白酵母细胞表达载体及构建方法。
背景技术：
酵母是最常用的基因生物工程宿主细胞，这是酵母是单细胞低等真核生物细胞，不仅具有易培养、繁殖、生长条件要求不高等特点外，而且具有遗传背景清楚、基因结构、基因调控、代谢和蛋白质翻译后加工与哺乳动物细胞相似等特点。所以，用酵母细胞是常用生物工程细胞。在研究酵母细胞的生物代谢特点及外源性基因的表达过程中，最常用是用酵母绿色荧光蛋白(yEGFP)作为的检测信号，以观察酵母细胞生物代谢过程以及外源性基因是否在酵母细胞中是否表达。但是，细胞生物代谢相当复杂，外源性基因种类又很多，如果要研究两种或两种以上代谢物之间的关系，仅用一种检测信号难易实现，故需要有另外一种检测信号来弥补其不足。
发明内容
为了方便研究酵母细胞生物代谢研究，本发明提供了一种红色荧蛋白酵母细胞表达载体，可以有助于研究在酵母细胞的生物代谢和外源性基因的表达问题。本发明采用的技术方案是一种红色荧蛋白酵母细胞表达载体，是将SEQ ID No. I所示序列经BamH I和SalI双酶切后与PUC57载体相连得pUC57/yDSRed ;将酵母强启动子GPD插入到pYestrp2载体中得到pGPD ;然后再用BamH I和Not I对pUC57/yDsRed酶切，常规回收yDsRed目的片段，将目的片段插入到PGPD的相应酶切位点而获得；该载体命名为pGPD/yDsRed ;结构如图I。上述所说的酵母表达载体的构建方法，包括下列步骤I)合成如SEQ ID No. I所示的yDsRed序列，该序列中包括两端的各3个保护碱基，以及5'端的BamH I和3'端的Sal I和Not I酶切位点，2)将合成的上述yDsRed序列用BamH I和Sal I酶切，通过T4连接酶与pUC57相连，将其命名pUC57/yDsRed。3)以Invitrogen公司的pYestrp2载体为基本框架,通过PCR方法从酵母基因组扩增酵母强启动子GPD，并经Swa I和BamH I双酶切，将其插入到pYestrp2载体中，构建成GPD驱动的酵母表达载体，命名为pGPD ；4)用BamH I和Not I对pUC57/yDsRed酶切，常规回收yDsRed目的片段，将其插入到PGPD的相应酶切位点，构建成红色荧光蛋白酵母表达载体pGPD/yDsRed。本发明所述表达载体pGPD/yDsRed是一种含有酵母嗜好密码子的红色荧光蛋白(yDsRed)报告载体，该载体转入酵母细胞后，在酵母启动子的驱动下红色荧光蛋白可在酵母细胞中有效表达。因而可作为研究酵母生物学特点和酵母生物工程的理想工具。
图I本发明构建成红色荧光蛋白酵母表达载体pGPD/yDsRed结构示意图。图2yDsRed 在 W303 — IA 中的表达。
具体实施例方式文中所用到的质粒pUC57 :购自美国 GenScript 公司。pYestrp2 :购自美国 Invitrogen 公司。I、参考pDsRedl-Nl (Clontech公司产)的DsRedl基因序列，根据酵母嗜好的密码 子，在保证氨基酸序列不变的情况下，根据重叠延伸PCR设计方案，设计PCR引物，进行酵母密码子优化。将PCR引物拆分为18条单链寡核苷酸(如下所示)，由人工合成，重叠区平均碱基数为19bp，并在第一条引物的5'端增加BamH I和3个保护碱基和第十八条引物5'端增加Sal I、Not I酶切位点和3个保护碱基(酶切位点为方框部分)，利用重叠延伸PCR方法，人工合成含有全部酵母嗜好密码子的红色荧光蛋白(yDsRed)基因，在其的两端分别含有3个保护碱基、BamHI、Sal I和Not I酶切位点，全长序列704bp(SEQ ID No. I)。PCR扩增选用Pfu高温聚合酶。PCR反应条件为95°C预变性3min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸3min，35循环，循环结束后，72°C再延伸lOmin，然后进入4°C。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化。引物I (SEQ ID No. 2)5' -ACT 1GGATCC1ATGGCTTCTTCTGAAAATGTTATTACTGAATTCATGAGATTTAAAGTCAG-3'引物2 (SEQ ID No. 3):5' -TTCAATTTCAAATTCGTGACCGTTAACAGTACCTTCCATTCTGACTTTAAATCTCATGA-3'引物3 (SEQ ID No. 4):5' -TCACGAATTTGAAATTGAAGGTGAAGGTGAAGGTAGACCATACGAAGGTCATAATACCG-3'引物4 (SEQ ID No. 5):5' -GCAAATGGCAATGGACCACCTTTAGTGACTTTTAATTTAACGGTATTATGACCTTCGTA-3'引物5 (SEQ ID No. 6):5' -GTGGTCCATTGCCATTTGCCTGGGATATTTTATCCCCACAATTTCAATATGGTTCTAAA-3'引物6 (SEQ ID No. 7):5' -TCTTATAATCTGGGATATCAGCTGGATGTTTGACGTAAACTTTAGAACCATATTGAAAT-3'引物7 (SEQ ID No. 8):5' -GATATCCCAGATTATAAGAAATTGTCTTTCCCAGAAGGTTTTAAGTGGGAAAGAGTTAT-3'引物8 (SEQ ID No. 9):5' -GTCTTGGGTGACAGTAGCAACACCACCATCTTCGAAGTTCATAACTCTTTCCCACTTAA-3'引物9 (SEQ IDNo. 10):5' -TGCTACTGTCACCCAAGACTCTTCTTTACAAGATGGTTGTTTTATTTACAAGGTTAAAT-3'引物10 (SEQ ID No. 11)5' -TGCATAACTGGACCGTCGGATGGGAAGTTAACACCAATAAATTTAACCTTGTAAATAAA-3'
引物 11 (SEQ IDNo. 12)5' -CCGACGGTCCAGTTATGCAAAAAAAAACTATGGGTTGGGAAGCTTCTACTGAAAGATTG-3'引物12 (SEQ ID No. 13):5' -CCTTGTGAGTTTCACCTTTTAAAACACCATCTCTTGGGTACAATCTTTCAGTAGAAGCT-3'引物13 (SEQ ID No. 14):5' -AAAGGTGAAACTCACAAGGCCTTAAAATTAAAAGATGGTGGTCACTATTTAGTCGAATT-3'引物14 (SEQ ID No. 15):5' -TGGTAATTGGACTGGTTTCTTAGCCATGTAGATGGATTTAAATTCGACTAAATAGTGAC-3'引物15 (SEQ ID No. 16):5' -GAAACCAGTCCAATTACCAGGTTATTACTACGTTGATGCTAAATTGGACATCACTTCTC-3'引物16 (SEQ ID No. 17):5' -TTCAACAATGGTATAATCTTCGTTGTGAGAAGTGATGTCCAATTT-3'引物17 (SEQ ID No. 18):5' -AGATTATACCATTGTTGAACAATATGAAAGAACCGAAGGTAGACA-3'引物18 (SEQ ID No. 19):5' -ACT IgtcgacGCGGCCGC丨丨 CTACAAAAATAAATGATGTCTACCTTCGGTTCTTT-3'2、将合成的含有 BamH I、Sal I 和 Not I 的 yDsRed 和 pUC57 载体用 BamH I 和 SalI双切，用T4连接相连，将其命名pUC57/yDSRed。3、将pYestrp2用Swa I和BamH I双切，并用PCR方法从酵母基因组扩增酵母强启动子GPD，将其插入到pYestrp2载体的相应酶切位点，构建成GPD驱动的酵母表达载体，命名为pGH)；4、对pGPD和pUC57/yDsRed用BamH I和Not I双切，用DNA试剂盒回收载体和目的片段，并用T4连接酶相连接，连接产物转化于DH5 α，用营养琼脂/Amp平板筛选阳性克隆，转化子克隆质粒进行酶切鉴定，从而构建成pGPD/yDsRed酵母表达载体,其结构如图I。实施例yDsRed在酵母细胞中的表达验证。将载体pGPD/yDsRed用醋酸锂(LiAC)方法转染于W303-1A酵母细胞，用SD/trp-平板筛选出阳性克隆，挑取3mm左右克隆，置于SD/_trp培养液中扩大培养，于荧光显微镜下观察yDsRed的表达，发现在绿色光的激发下，许多酵母细胞发出耀眼的红光(图2)，说明yDsRed在酵母细胞中成功表达。
权利要求
1.一种红色荧蛋白酵母细胞表达载体，其特征在于该载体是将SEQ ID No. I所示序列经BamH I和Sal I双酶切后与pUC57载体相连得pUC57/yDSRed ;将酵母强启动子GPD插入到pYestrp2载体中得到pGPD ;然后再用BamH I和Not I对pUC57/yDsRed酶切，常规回收yDsRed目的片段，将目的片段插入到pGPD的相应酶切位点而获得；该载体命名为pGPD/yDsRedo
2.如权利要求I所说的酵母表达载体的构建方法，其特征在于包括下列步骤 1)合成如SEQID No. I所示的yDsRed序列， 2)将上述合成的yDsRed序列用BamHI和Sal I进行双酶切，然后与pUC57载体相连得到 pUC57/yDsRed ； 3)以pYestrp2载体为基本框架，通过PCR方法从酵母基因组扩增酵母强启动子GPD，并经Swa I和BamH I双酶切，将其插入到pYestrp2载体中，构建成GTO驱动的酵母表达载体 PGPD ； 4)用BamHI和Not I对pUC57/yDsRed酶切，常规回收yDsRed目的片段，将其插入到PGPD的相应酶切位点，构建成红色荧光蛋白酵母表达载体pGPD/yDsRed。
全文摘要
本发明涉及一种红色荧光蛋白酵母报告载体及其构建方法。所说的红色荧光蛋白酵母报告载体pGPD/yDsRed是将SEQ ID No.1所示序列经BamHI和SalI双酶切后与pUC57载体相连得pUC57/yDsRed；将酵母强启动子GPD插入到pYestrp2载体中得到pGPD；然后再用BamHI和NotI对pUC57/yDsRed酶切，常规回收yDsRed目的片段，将目的片段插入到pGPD的相应酶切位点而获得。该载体转入酵母细胞后，在酵母启动子的驱动下，红色荧光蛋白可以有效地在酵母细胞中表达，因而可作为研究酵母生物学特点和酵母生物工程的理想工具。
文档编号C12N15/66GK102634538SQ20121014091
公开日2012年8月15日 申请日期2012年5月7日 优先权日2012年5月7日
发明者李姗姗, 李湘鸣, 谢阳酶 申请人:扬州大学