专利名称：梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，尤其是涉及一种梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
梅毒(Syphilis)是一种由梅毒螺旋体(Treponema pallidum, TP)引起的性传播疾病，其病原体是梅毒螺旋体，属螺旋体科。梅毒螺旋体主要通过性接触、输血、创口或者胎盘等途径传播。梅毒螺旋体从感染区附近的淋巴结进入血液播散全身，使机体几乎所有的组织及器官受累，临床表现为全身性的，可分为不同临床阶段，包括一期、二期、三期和潜伏期。世界卫生组织(WHO)曾乐观地预言([1]WH0. Global prevalence andincidence of selected curable sexually transmitted infections:Overview andestimates [J] · Geneva: WHO, WH0/HIV/AIDS, 2001:1-30.):“ 由于有高灵敏度检测方法和高效的治疗方案，梅毒是一种能够通过公共卫生措施得到成功控制的性传播性疾病”。遗憾的是，由于至今仍然缺乏高灵敏的检测方法和高效的治疗方案，梅毒依然是严重危害人类健康的全世界范围的公共卫生问题。中国疾病控制中心的官方数据显示2010年我国梅毒(Syphilis)的发病数为375309例，比2009年同期增长24. 50%。报告发病数仅次于病毒性肝炎和肺结核居第三位，居于性传播疾病首位(中国疾控中心http://www.chinacdc. net. cn)。近年来,有关梅毒与艾滋病之间存在着互相促进的研究结果([2]Buchacz, K. , Klausner, J. D. , Kerndt, P. R. , et al. McElroy, P. D. and Schwendemann, J. HIVincidence among men diagnosed with early syphilis in Atlanta, San Francisco, andLos Angeles, 2004to 2005[J] · Jaids-J Acq Tmm Def,2008, 47(2):234-240. [3]Ghanem, K.G. , Erbelding, E. J. , Wiener, Z. S. , et al. Serological response to syphilis treatmentin HIV-positive and HIV-negative patients attending sexually transmitteddiseases clinics [J]. Sex Transm Infect, 2007，83 (2) :97_101.),使得梅毒的控制越发困难而且重要。无疑，人们对梅毒的防控过于乐观，对梅毒的认识远远不够。尽管青霉素成功应用于治疗各期梅毒已经有50年历史，但治疗失败可见于任何一种被推荐的治疗方案。林丽蓉等([4]林丽蓉，杨波，潘锡涛，等.潜在的血源传播患者梅毒血清学检测方法的选择[J].中华医院感染学杂志，2010，. 20(10): 1491-1494)在对健康体检者、门诊患者和潜在血源传播患者梅毒血清学调查中均发现，这些人群存在一定比例的梅毒感染率，推测本地区人群梅毒的检出率应该在2. 59%以上。显然，梅毒感染者已经较广泛地存在于普通人群中。梅毒正以过去500年任何国家和地区都未曾有过的速度在中国传播，由于存在隐性感染以及无法统计的私人诊所患者患病率，目前看到的梅毒发病率或许只是梅毒现状的冰山一角([5]Lin, L. R. , Fu, Z. G. , Dan, B. , Jing, et al. Developmentof a colloidal gold—immunochromatography assay to detect immunoglobulin Gantibodies to Treponema pallidum with TPNl7and TPN47[J]. Diagn Micr InfecDis, 2010，68(3) : 193-200. [6]Tucker JD, C. X. , Peeling RW. Syphilis and socialupheaval in china[J]. N Engl J Med, 2010, 362(18):1658-1661. [7]Chen, Z. Q. , Zhang, G.C. , Gong, X. D. , Lin, C. , Gao, X. , Liang, G. J. , Chen, X. S. , and Cohen, M. S. Syphilis inchina:Results of a national surveillance programme[J]. Lancet, 2007, 369:132-138.[8]Li-Rong Lin,Man-Li Tong,Zuo-Gen Fu,et al. Evaluation of a colloidalgold—immunochromatography assay in the detection of Treponema Pallidm specifcIgM antibody in syphilis serofast reaction patients:a serologic marker for therelapse and infection of syphilis[J]. Diagnostic Microbiology and InfectiousDisease. 2011, 70:10-16)。实验室检查是诊断梅毒必不可少的方法，也是判断疗效和复发的重要依据，包括暗视野显微镜检查和血清学试验。梅毒螺旋体感染早期，梅毒抗体还未产生或含量较低时，暗视野显微镜查找螺旋体成为最早的实验室诊断方法，但敏感度较低，且易受肛门周围非致病螺旋体的影响而产生假阳性。梅毒螺旋体尚不能进行体外培养，梅毒诊断与流行病学调查主要依赖于血清学试验，包括特异性抗体和反应素检测两大类型。反应素检测对早期梅毒检测灵敏度不高，而且生物假阳性率较高，是主要用于疗效观察的一项血清学指标([9]林丽蓉，但冰，付左根，等.潜在血源传播患者梅毒血清学TRUST/TPPA与IgM抗体联合检测.中国皮肤性病学杂志.2010，152(05):446-448)。梅毒特异性抗体检测的敏感性和特异性均较反应素高。但是，梅毒特异性抗体检测仍然存在着灵敏度不足的缺陷，尤其是早期梅毒患者抗体滴度较低。如果能建立一种方法能灵敏、特异和快速检测到梅毒患者各类组织、体液中存在梅毒螺旋体，能证明梅毒螺旋体存在，那么这些棘手问题将迎刃而解。兔睾丸是梅毒螺旋体易感器官，少量梅毒螺旋体即可导致兔睾丸炎，因此，兔感染试验被视为梅毒螺旋体检测的最灵敏的方法。然而，兔感染试验操作繁琐，观察时间要求3个月，甚至更长时间才能得到结果，临床可操作性差。PCR扩增技术以梅毒螺旋体特异性的基因片段做为扩增模板，通过指数扩增实现了病原体的快速检测，具有高效、灵敏和特异等优势。从理论上分析，通过优化、改良PCR扩增技术，其检测的灵敏度和特异性可以媲美兔感染试验，而检测时间仅仅需要2个小时([10]HAYP E, CLARKE JR,TAYL0R-R0BINS0N D, et al. Detection of treponemal DNA in the csf of patientswith syphilis and hiv infection using the polymerase chain reaction [J].Genitourin Med, 1990，66 (6) : 428-32)，有望成为解决这些棘手问题的最佳方法。.尽管国内外有些企业研发出梅毒PCR检测试剂，但尚未有进入临床应用的有注册文号PCR检测试剂，而仅仅停留在科研应用。更严重的是，目前的PCR检测试剂在研发过程中由于未经严格的比对试验，无一例外的存在灵敏度和特异性严重不足，其准确性不高，是目前梅毒PCR技术在临床中应用的瓶颈。
flaA 鞭毛基因(flagellar filament outer layer protein gene)编码鞭毛鞘蛋白，该基因拥有闻保守基因序列，仅在螺旋体中存在，有研究将此基因作为祀基因，检测标本中梅毒螺旋体 DNA([11] Isaacs R D, Radolf J. Expression in escherichia coli ofthe 37_kilodalton endoflagellar sheath protein of treponema pallidum by useof the polymerase chain reaction and a t7expression system[J]. Infection andimmunity, 1990, 58 (7) : 2025-2034.)。flaA鞭毛基因在梅毒早期快速诊断、疗效判断、疗程选择、神经梅毒确诊、胎传梅毒诊断，以及献血员、孕产妇、婚前体检、手术患者和输血前筛查等领域发挥重大作用，有着目前常用的血清学检测不可比拟的优势，将逐渐替代这些方法或作为这些方法的验证试验，具有广阔的应用前景和重要的社会、经济价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒及其制备方法。
所述梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒设有DNA提取试剂瓶、耐热DNA聚合酶瓶、PCR反应液瓶、标准品瓶、质控品瓶和包装盒；所述DNA提取试剂瓶、耐热DNA聚合酶瓶、PCR反应液瓶、标准品瓶和质控品瓶设在包装盒内；所述DNA提取试剂瓶设有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、无水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第I清洗缓冲液瓶、洗脱液瓶、第2清洗缓冲液瓶和含收集管的离心柱；所述标准品瓶设有6个含fla-A基因的标准品质粒瓶；所述质控品瓶设有阴性质控品瓶和阳性质控品瓶。所述耐热DNA聚合酶瓶可采用Tag酶瓶。所述阴性质控品为不含梅毒螺旋体DNA的样品，阳性质控品为含梅毒螺旋体DNA的样品。所述6个含fla-A基因的标准品质粒的浓度可分别为I. O X 102copies/mL、I. OX IO3Cop ies/mL、I. OX 104copi es/mL、I. 0X105cop ies/mL、I. OXlO6Cop ies/mL 和l.OX 107copies/mL,共 6 个浓度。所述PCR反应液的成份含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和fla_A基因引物、探针组成的混合物。所述耐热DNA聚合酶(Tag酶)具有3’ 一 5’ DNA聚合酶活性、5’ 一 3’ DNA外切核酸酶活性和可耐受高温的聚合酶；所述耐热DNA聚合酶(Tag酶)最好是半衰期>45min的高温聚合酶。所述梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤I)靶基因筛选，具体方法如下从基因库(GENBANK)中筛选梅毒螺旋体fla_A基因，fla_A基因探针和引物的设计米用 PCR 引物探针设计软件 primer premier 5.0、Oligo 6· O、TM Utility vl. 3> ClustalX等设计软件辅助完成，然后通过Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)进行同源性比对以保证其特异性，合成的引物和探针用TE(10mM Tri-HCl, pH5. 0,0. ImM TA)溶解，使用ND-1000UV-VIS波长紫外/可见光扫描分光光度计进行浓度测定后，保存；2) fla-A基因标准品质粒的构建，具体方法如下以硅胶膜-离心柱法提取梅毒螺旋体Nichols株DNA作为模板，采用步骤I)中的fla-A基因的引物，进行PCR扩增，具体过程如下将扩增产物经过回收及纯化后，在微量离心管中配制DNA溶液，后加入5 μ L等量的Solution I，16°C反应30min，与pMD18_T载体连接将连接产物转化至DH5a中，冰中放置30min，42°C加热45s后，再在冰中放置lmin，力口入LB培养基，37°C震荡培养60min后，在含有X_Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落，挑选白色菌落，进行增殖培养，提取质粒并对其进行PCR，Xab I和Sal I双酶切及测序鉴定后，将构建好的质粒进行单酶切线性化处理，再用紫外分光光度计定量并_20°C保存作为FQ-PCR的标准品；
3) fla-A基因检测试剂标准曲线制作，其具体方法如下包含fla-A基因的阳性克隆大肠杆菌在含Amp LB肉汤增菌，提取质粒，取10 μ L质粒用双蒸水稀释100倍,260nm, 280nm比色，纯度=A26(I/A28(I,浓度=A260X 50 X 2 X 100 X IO-6X 6. 02 X IO23/(2806 X 324. 5 X 2) copies/mL,根据质粒浓度，进行梯度稀释，以每个浓度标准品作模板进行荧光定量反应，确定线性范围；4)制备PCR反应液，其具体方法如下采用PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、fla-A基因引物、探针的混合物共同组成PCR反应液；5)制备耐热DNA聚合酶，其具体方法如下大肠杆菌用异丙基硫代_β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，诱导后的菌悬液IOOml 经 5000r/min, 4°C离心 5min,以 IOml 缓冲液 I 重悬菌液，4°C，5000r/min,离心 5min,细菌沉淀再悬于5ml缓冲液I中，加入溶菌酶(Lys)使浓度达5mg/ml，37°C水浴20min ;力口入5ml缓冲液II，75°C水浴45min,4°C, 15000r/min离心IOmin ;上清加入硫酸铵使达30%,4°C,1500r/min离心lOmin，沉淀溶于Iml缓冲液III中，并对缓冲液III在4°C条件下透析，每6h换液I次共4次，离心除去不溶物后，-20°C冻存；6)建立样品处理方法，其具体方法如下使用梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂检测梅毒螺旋体的样本，采用硅胶膜-离心柱法提取模板DNA ；7)制备质控品，其具体方法如下制备阴性质控品选择经过临床确认为阴性的临床标本；制备阳性质控品选择经过临床确认为阳性的临床标本经稀释获得阳性质控品；8)制备梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒，将DNA提取试剂、耐热DNA聚合酶、PCR反应液、标准品和质控品共同组成梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒。在步骤I)中，所述fla-A基因探针和引物的序列如表I所示；表I
靶基因序列名称引物/探针序列_
I:游I 物.IS1-CGTGGAAGGATTTCCGAAAGGAGCr1TTTGA-S'
fh A I、·;游iJ I秒丄! F列 5'-CCCTGtAG ACCCAΓCCGACCC；TC；-3,
_光探计 11·列 S'-FAM-AAGACAAAGGGTATGCCAC-BHQ I -3'所述ND-1000UV-VIS波长紫外/可见光扫描分光光度计可采用Nanedrop，美国产品，所述浓度测定的终浓度可为50μΜ。在步骤2)中，所述紫外分光光度计可采用752型紫外分光光度计。在步骤3)中，所述梯度稀释可选 I. OX 102copies/mL、I. OX 103copies/mL、l.OX 104copies/mL>l.OX 105copies/mL>l.OX 106copies/mL>l.OX 107copies/mL 6 个浓度作标准品。 在步骤4)中，所述PCR缓冲液为pH=5. (TlO. O之间的稳定缓冲时，最适ρΗ=7· 0 9· O ;引物的浓度为25ρπι01/μ L，荧光探针的浓度为20pmol/yL, dNTPs的浓度为2mmol/L ;续离子的浓度为15 20mmol/L。在步骤5)中，所述缓冲液 I 可为 50mmol/L tris-HCl, 50mmoI /T, Glucose, lmmol/LEDTA, pH8. 0 ;所述缓冲液 II可为 5mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L KCl, lmmol/L EDTA, lmmol/LPMSF, 0. 5%Tween 20,0. 5%NP 40 ;所述缓冲液III可为 50ml mol/L Tris-HCl, lOmmol/LKCl,lmmol/L DTT, 0. 5%PMSF, 50% 甘油。在步骤6)中，所述样本可包括组织、全血、分泌物等临床标本；所述分泌物可包括皮肤、生殖器溃疡、糜烂部分等的分泌物。在步骤8)中，耐热DNA聚合酶的用量可为8 10U/反应。flaA鞭毛基因(flagellar filament outer layer protein gene)编码鞭毛鞘蛋 白，该基因拥有闻保守基因序列，仅在螺旋体中存在，有研究将此基因作为祀基因，检测标本中梅毒螺旋体DNA。flaA鞭毛基因在梅毒早期快速诊断、疗效判断、疗程选择、神经梅毒确诊、胎传梅毒诊断，以及献血员、孕产妇、婚前体检、手术患者和输血前筛查等领域发挥重大作用，有着目前常用的血清学检测不可比拟的优势，将逐渐替代这些方法或作为这些方法的验证试验，具有广阔的应用前景和重要的社会、经济价值。
图I为本发明所述梅毒螺旋体f I a-A基因FQ-PCR检测试剂盒的组装示意图。在图I中，I 6分别为6个含fla-A基因的标准品质粒瓶(标准品的6个浓度分别为 I. O X 102copies/mL、I. O X 103copies/mL、l.OX 104copies/mL、l.OX 105copies/mL、
I.OX 106copies/mL和I. 0X 107copies/mL) ；7为PCR反应液瓶；8为含收集管的离心柱；9为阴性质控品瓶；10为阳性质控品瓶；11为Tag酶瓶；12为蛋白酶K瓶；13为裂解液瓶；14为无水乙醇瓶；15为抑制物去除液瓶；16为第I清洗缓冲液瓶；17为洗脱液瓶；18为第2清洗缓冲液；19为外包装盒。图2为标准品检测结果。在图2中。横坐标代表标准品浓度copies/mL，纵坐标代表阈值循环数;标记·:标准品 Slope -3. 533205，intercept 45. 18945，R2 0. 999687。图3为本发明建立的梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测方法进行标本检测的扩增曲线。在图3中，横坐标为循环数，纵坐标为较正后的荧光强度；其中I 3为梅毒螺旋体阳性扩增曲线，4 5为梅毒螺旋体阴性扩增曲线，6为阈值线。
具体实施例方式以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。参见图I，本发明所述梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒实施例设有6个含fla-A基因的标准品质粒瓶(标准品的6个浓度分别为I. O X 102copies/mL,
I.OX IO3Cop ies/mL、I. OX 104copi es/mL、I. 0X105cop ies/mL、I. OXlO6Cop ies/mL 和1.0X107copies/mL) I 6、PCR反应液瓶7、含收集管的离心柱8、阴性质控品瓶9、阳性质控品瓶10、Tag酶瓶11、蛋白酶K瓶12、裂解液瓶13、无水乙醇瓶14、抑制物去除液瓶15、第I清洗缓冲液瓶16、洗脱液瓶17、第2清洗缓冲液18和外包装盒19。所述6个含fla_A基因的标准品质粒瓶I 6、PCR反应液瓶7、含收集管的离心柱8、阴性质控品瓶9、阳性质控品瓶10、Tag酶瓶11、蛋白酶K瓶12、裂解液瓶13、无水乙醇瓶14、抑制物去除液瓶15、第I清洗缓冲液瓶16、洗脱液瓶17和第2清洗缓冲液18均布在外包装盒19内。其中PCR反应液的成份含有PCR缓冲液、MgCl2, dNTPs、fla-A基因的引物探针混合物。其中所述耐热DNA聚合酶(Tag酶)具有3’ 一 5’ DNA聚合酶活性，5’ 一 3’ DNA外切核酸酶活性和可耐受高温度的聚合酶。所述的耐热聚合酶最好是95半衰期>45min的高温聚合酶。质控品包含阴性质控品和阳性质控品，阴性质控品为不含梅毒螺旋体DNA的样品，阳性质控品为含梅毒螺旋体DNA的样品。所述梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试 剂盒的制备方法，包括以下步骤I)靶基因筛选从GENBANK中筛选梅毒螺旋体高特异性、高灵敏度的fla_A基因。fla_A基因的引物、突光探针的设计米用 primer premier 5. 0、01igo 6. 0、TM Utility vl. 3、Clustal X等设计软件辅助完成，然后通过BLAST进行同源性比对以保证其特异性。合成的引物和探针用TE (IOmMTri-HCl，pH5. 0,0. ImM TA)溶解，使用ND-1000UV-VIS波长紫外/可见光扫描分光光度计(Nanedrop，美国)进行浓度测定，并将终浓度调成50 μ M，-20°C保存。2) fla-A基因标准品质粒的构建以硅胶膜-离心柱法提取梅毒螺旋体Nichols株DNA作为模板，采用步骤I)中的fla-A基因的引物，进行PCR扩增。过程如下将扩增产物经过回收及纯化后，在微量离心管中配制DNA溶液，后加入5 μ L等量的Solution I，16°C反应30min，与pMD18_T载体连接将连接产物转化至DH5 α中，冰中放置30min，42°C加热45s后，再在冰中放置Imin，加入LB培养基，37°C震荡培养60min后，在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落，挑选白色菌落，进行增殖培养，提取质粒并对其进行PCR扩增，Xab I和Sal I双酶切及测序鉴定后，将构建好的质粒进行单酶切线性化处理，再用752型紫外分光光度计定量并-20°C保存作为FQ-PCR的标准品。3) fla-A基因检测试剂标准曲线制作包含fla-A基因的阳性克隆大肠杆菌在含Amp LB肉汤增菌，提取质粒，取10 μ L质粒用双蒸水稀释100倍,260nm, 280nm比色，纯度=A26(I/A28(I,浓度=A260 X 50 X 2 X 100 X IO-6 X 6. 02 X IO23/(2806 X 324. 5 X 2) copies/mL,根据质粒浓度，进行一定比例梯度稀释，选 I. O X 102copies/mL、l.OX 103copies/mL、l.OX 104copies/mL、l.OX 105copies/mL、l.OX 106copies/mL、l.OX 107copies/mL 6 个浓度作标准品，分别以每个浓度标准品作模板进行荧光定量反应，确定线性范围。4) PCR反应液制备PCR缓冲液、MgCl2, dNTPs、fla-A基因引物探针混合物共同组成PCR反应液。5)耐热DNA聚合酶的制备大肠杆菌用异丙基硫代_β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，诱导后的菌悬液菌悬液 IOOml 经 5000r/min, 4°C 离心 5min,以 IOml 缓冲液 I (50mmol/Ltris-HCl, SOmmoI /LGlucose, lmmol/L EDTA, ρΗ8· 0)重悬菌液，4°C，5000r/min,离心 5min,细菌沉淀再悬于5ml缓冲液I中，加入溶菌酶(Lys)使浓度达5mg/ml，37°C水浴20min ;加入5ml缓冲液II (5mmol/L Tris2HCl,50mmol/L KCl,lmmol/L EDTA,lmmol/L PMSF,0. 5%Tween20,0. 5%NP40)，75°C水浴 45min,4°C,15000r/min 离心 IOmin ;上清加入硫酸铵使达 30%,4°C, 1500r/min 离心 lOmin。沉淀溶于 Iml 缓冲液III (50ml mol/L Tris-HCl, lOmmol/L KCl, lmmol/LDTT, 0. 5%PMSF，50%甘油)中，并对缓冲液III在4°C条件下透析，每6h换液I次共4次，离心除去不溶物后，-20°C冻存。6)样品处理方法的建立
使用梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂检测梅毒螺旋体的样本主要包括组织、全血、分泌物(皮肤、生殖器溃疡、糜烂部分的分泌物)等临床标本。采用硅胶膜-离心柱法提取模板DNA。7)质控品制备阴性质控品制备选择经过临床确认为阴性的临床标本。阳性质控品制备选择经过临床确认为阳性的临床标本经稀释获得阳性质控品8)制备梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒DNA提取试剂、耐热DNA聚合酶(Tag酶)、PCR反应液、标准品和质控品共同组成梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒。以下给出采用梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒检测患者的临床标本I.标本处理I. I分泌物(皮肤、生殖器溃疡、糜烂部分的分泌物)加入ImL灭菌生理盐水，充分震荡摇勻，挤干棉拭子；吸取全部液体转至I. 5mL离心管中，12，OOOrpm离心5min ;去上清，沉淀加灭菌生理盐水ImL混勻，12，OOOrpm离心5min ;去上清,沉淀备用。I. 2硬下疳及皮损部位组织标本用适量灭菌生理盐水清洗送检组织沾带的血液；取约50mg组织，加ImL灭菌生理盐水用匀浆器研磨成组织匀浆，转移至I. 5mL离心管中，12, OOOrpm离心5min ;去上清,沉淀加灭菌生理盐水ImL混勻，12, OOOrpm离心5min ;去上清，沉淀备用。I. 3全血肝素抗凝静脉血5mL，加等量的生理盐水悬浮细胞。将细胞悬液小心加在与血液等量的淋巴细胞分离液上，室温中，水平离心500g 20min。吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加I 2倍量Hanks液(洗涤液)，混匀后离心200 Xg lOmin，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。用同样洗涤液洗涤细胞2次，每次离心500Xg lOmin，洗去残留的淋巴细胞分离液，沉淀备用。2.质控品处理取出阴性质控品，8，OOOrpm离心数秒，100 μ L质控品加入等量DNA浓缩液充分混勻；去上清，沉淀加灭菌生理盐水ImL混勻，12，OOOrpm离心5min ;去上清,沉
淀备用。3. DNA提取(娃胶膜_离心柱法)用200 μ L的生理盐水悬浮沉淀，加入50 μ L的蛋白酶K，再加入200 μ L的裂解液，盖紧管盖，漩涡振荡15s以充分混匀，37°C温育20min ；加入200 μ L无水乙醇，漩涡振荡15s以充分混匀；将混合液全部吸至离心柱，室温下12，OOOrpm离心lmin，将离心柱装至新的收集管；将500 μ L的清洗缓冲液I加入离心柱，室温下12，OOOrpm离心lmin，将离心柱装至新的收集管；将500 μ L的清洗缓冲液II加入离心柱，室温下12，OOOrpm离心lmin，将离心柱装至新的收集管；将离心柱_收集管于室温下最大转速离心3min ;将离心柱取出，放置于新的I. 5mL离心管。打开离心柱盖子,60°C放置2min (使用干式恒温器，不能使用水浴锅)；在离心柱的膜的正上方小心加入60°C预热的洗脱液50μ L,盖紧管盖,室温静置Imin后，12，OOOrpm离心lmin。离心管内即为核酸溶液,建议立即使用，如需保存，置于-20°C。4.标准品处理8，OOOrpm离心数秒，备用。5. PCR扩增在PCR反应管中加入2μ L处理后的样品(包括样本、质控品、标准品)40μ L的PCR反应液和3μ L的Taq酶，8，OOOrpm离心数秒，放入PCR仪器样品槽进行扩增；95°C IOmin; 95 °C 15s, 55 °C 2min，72°C 30s (共 10 个循环)；95°C 15s, 50 °C 20s,72°C 20s (共40个循环)。6.根据标准品检测的标准曲线(见图2)，计算得到各待测标本中的梅毒DNA的量(copies/mL)。所述的荧光定量PCR反应可使用的仪器包括ABI实对PCR系统(例如7000,7300，7500，7900 等)；BioRad 实时 PCR 检测系统、Roche 的 iCycler 等。以下给出梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒的性能检定I)精密度试验对同一样本每天进行I批次检测，每批重复检测2次，共进行20天。收集20天的有效数据，进行重复性评价。2)分析灵敏度以 2000copies/mL、1000copies/mL、500copies/mL、250copies/mL4个浓度样品每天重复8次检测，连续做3次，95%检出阳性的最低浓度值为分析灵敏度。3)特异性临床常见泌尿生殖道感染患者分泌物标本150例，其中淋病50例、支原体感染50例、尖锐湿疣50例，分别进行DNA提取，荧光定量PCR检测，同时做梅毒患者和正常人生殖道拭子为阳性和阴性对照，评价方法的特异性。4)线性范围根据标准曲线的线性，维持相关系数在O. 97以上，判断方法的线性范围。5)试剂稳定性用两个浓度水平临床样本，每个浓度水平样本重复测定至少6次，计算平均值。新配制及稳定期末工作液应在同次运行中测定，将仪器带来的不精密度减到最小。测定新配制的试剂工作液和稳定期末试剂工作液两组平均值之间的一致性。以下给出具体实施例。实施例II)靶基因筛选参考文献，从GENBANK中筛选梅毒螺旋体高特异性、高灵敏度的f Ia_A基因。fla-A基因引物、突光探针的设计采用primer premier 5. 0、01igo 6. 0、TM Utility vl. 3、Clustal X等设计软件辅助完成，然后通过BLAST进行同源性比对以保证其特异性。合成的引物和探针用 TEdOmM Tri-HCl, ρΗ5· 0,0. ImM TA)溶解，使用 ND-1000UV-VIS 波长紫外 /可见光扫描分光光度计(Nanedrop，美国)进行浓度测定，并将终浓度调成50 μ M，-20°C保存。2) fla-A基因标准品质粒的构建 以硅胶膜-离心柱法提取梅毒螺旋体Nichols株DNA作为模板，采用步骤I)中的fla-A基因的引物，进行PCR扩增。过程如下将扩增产物经过回收及纯化后，在微量离心管中配制DNA溶液，后加入5 μ L等量的Solution I，16°C反应30min，与pMD18_T载体连接将连接产物转化至DH5 α中，冰中放置30min，42°C加热45s后，再在冰中放置Imin，加入LB培养基，37°C震荡培养60min后，在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落，挑选白色菌落，进行增殖培养，提取质粒并对其进行PCR、Xab I和Sal I双酶切及测序鉴定后，将构建好的质粒进行单酶切线性化处理，再用752型紫外分光光度计定量并_20°C保存作为FQ-PCR的标准品。3) fla-A基因检测试剂标准曲线制作包含fla-A基因的阳性克隆大肠杆菌在含Amp LB肉汤增菌，提取质粒，取10 μ L质粒用双蒸水稀释100倍,260nm, 280nm比色，纯度=A26(I/A28(I,浓度=A260 X 50 X 2 X 100 X IO-6 X 6. 02 X IO23/(2806 X 324. 5 X 2) copies/mL,根据质粒浓度，进行一定比例梯度稀释，选 I. O X 102copies/mL、l.OX 103copies/mL、l.OX 104copies/mL、l.OX 105copies/mL、l.OX 106copies/m L、l.OX 107copies/mL 6 个浓度作标准品，分别以每个浓度标准品作模板进行荧光定量反应，确定线性范围。4) PCR反应液制备PCR缓冲液、MgCl2, dNTPs、fla-A基因引物探针混合物共同组成PCR反应液。5)耐热DNA聚合酶的制备大肠杆菌用异丙基硫代_β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，诱导后的菌悬液菌悬液 IOOml 经 5000r/min, 4°C 离心 5min,以 IOml 缓冲液 I (50mmol/Ltris-HCl, SOmmoI /LGlucose, lmmol/L EDTA, ρΗ8· 0)重悬菌液，4°C，5000r/min,离心 5min,细菌沉淀再悬于5ml缓冲液I中，加入溶菌酶(Lys)使浓度达5mg/ml，37°C水浴20min ;加入5ml缓冲液
II(5mmol/L Tris-HCl,50mmol/L KCl,lmmol/L EDTA,lmmol/L PMSF,0. 5%Tween20,0. 5%NP40)，75°C水浴 45min,4°C,15000r/min 离心 IOmin ;上清加入硫酸铵使达 30%,4°C, 1500r/min 离心 IOrnin0 沉淀溶于 Iml 缓冲液III (50ml mol/LTris-HCl, 10mmol/L KCl, lmmol/LDTT, 0. 5%PMSF，50%甘油)中，并对缓冲液III在4°C条件下透析，每6h换液I次共4次，离心除去不溶物后，_20°C冻存。6)样品处理方法的建立使用梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂检测梅毒螺旋体的样本主要包括组织、全血、分泌物(皮肤、生殖器溃疡、糜烂部分的分泌物)等临床标本。采用硅胶膜-离心柱法提取模板DNA。7)质控品制备阴性质控品制备选择经过临床确认为阴性的临床标本。阳性质控品制备选择经过临床确认为阳性的临床标本经稀释获得阳性质控品8)制备梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒DNA提取试剂、耐热DNA聚合酶(Tag酶)、PCR反应液、标准品和质控品共同组成梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒。9)标本处理生殖泌尿道分泌物棉拭子加入ImL灭菌生理盐水，充分震荡摇勻，挤干棉拭子；吸取全部液体转至1.5mL离心管中，12，000印111离心51^11 ;去上清，沉淀加灭菌生理盐水ImL混勻，12, OOOrpm离心5min ;去上清,沉淀备用。10)质控品处理取出阴性质控品，8，OOOrpm离心数秒，100 μ L质控品加入等量DNA浓缩液充分混匀；去上清，沉淀加灭菌生理盐水ImL混匀，12，OOOrpm离心5min ;去上清，沉淀备用。IDDNA提取(硅胶膜-离心柱法):用200 μ L的生理盐水悬浮沉淀，加入50 μ L的蛋白酶K，再加入200 μ L的裂解液，盖紧管盖，漩涡振荡15s以充分混匀，37°C温育20min ；加入200 μ L无水乙醇，漩涡振荡15s以充分混匀；将混合液全部吸至离心柱，室温下12，OOOrpm离心lmin，将离心柱装至新的收集管；将500 μ L的清洗缓冲液I加入离心柱，室温下12，OOOrpm离心lmin，将离心柱装至新的收集管；将500 μ L的清洗缓冲液II加入离心柱，室温下12，OOOrpm离心lmin，将离心柱装至新的收集管；将离心柱_收集管于室温下最大转速离心3min ;将离心柱取出，放置于新的I. 5mL离心管。打开离心柱盖子,60°C放置2min (使用干式恒温器，不能使用水浴锅)；在离心柱的膜的正上方小心加入60°C预热的洗脱液50 μ L,盖紧管盖,室温静置Imin后，12，OOOrpm离心lmin。离心管内即为核酸溶液,建议立即使用，如需保存，置于-20°C。12)标准品处理8，OOOrpm离心数秒，备用。13) PCR扩增在PCR反应管中加入2μ L处理后的样品(包括样本、质控品、标准品)40 μ L的PCR反应液和3 μ L的Taq酶，8，OOOrpm离心数秒，放入PCR仪器样品槽进行扩增；95°C IOmin; 95 °C 15s, 55 °C 2min，72°C 30s (共 10 个循环)；95°C 15s, 50 °C 20s,72°C 20s (共40个循环)。14)根据标准品检测的标准曲线，计算得到各待测标本中的梅毒DNA的量(copies/mL)实施例2与实施例I相似，其区别在于待检标本为硬下疳及皮损部位组织标本，标本用适量灭菌生理盐水清洗送检组织沾带的血液；取约50mg组织，加ImL灭菌生理盐水用匀浆器研磨成组织勻衆，转移至I. 5mL离心管中，12，OOOrpm离心5min ;去上清,沉淀加灭菌生理盐水ImL混匀，12，OOOrpm离心5min ;去上清，沉淀的DNA提取和PCR扩增同实施例I。实施例3与实施例I相似，其区别在于待检标本为全血，肝素抗凝静脉血5mL，加等量的生理盐水悬浮细胞。将细胞悬液小心加在与血液等量的淋巴细胞分离液上，室温中，水平离心500g20min。吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加I 2倍量Hanks液(洗涤液)，混匀后离心200 Xg lOmin，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板,去上清液。用同样洗涤液洗涤细胞2次，每次离心500Xgl0min，洗去残留的淋巴细胞分离液，沉淀的DNA提取和PCR扩增同实施例I。实施例4性能验证试验按实施例I的方案制备梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒，然后进行性能验证。I)精密度试验对同一样本每天进行I批次检测,每批重复检测2次，共进行20天。收集20天的有效数据，进行重复性评价。2)分析灵敏度以 2000copies/mL、1000copies/mL、500copies/mL、250copies/mL4个浓度样品每天重复8次检测，连续做三次，95%检出阳性的最低浓度值为分析灵敏度。
3)特异性临床常见泌尿生殖道感染患者分泌物标本150例，其中淋病50例、支原体感染50例、尖锐湿疣50例，分别进行DNA提取，荧光定量PCR检测，同时做梅毒患者和正常人生殖道拭子为阳性和阴性对照，评价方法的特异性。4)线性范围根据标准曲线的线性，维持相关系数在O. 97以上，判断方法的线性范围。5)试剂稳定性用两个浓度水平临床样本，每个浓 度水平样本重复测定至少6次，计算平均值。新配制及稳定期末工作液应在同次运行中测定，将仪器带来的不精密度减到最小。测定新配制的试剂工作液和稳定期末试剂工作液两组平均值之间的一致性。
权利要求
1.梅毒螺旋体fIa-A基因FQ-PCR检测试剂盒，其特征在于所述梅毒螺旋体f Ia-A基因FQ-PCR检测试剂盒设有DNA提取试剂瓶、耐热DNA聚合酶瓶、PCR反应液瓶、标准品瓶、质控品瓶和包装盒；所述DNA提取试剂瓶、耐热DNA聚合酶瓶、PCR反应液瓶、标准品瓶和质控品瓶设在包装盒内；所述DNA提取试剂瓶设有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、无水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第I清洗缓冲液瓶、洗脱液瓶、第2清洗缓冲液瓶和含收集管的离心柱；所述标准品瓶设有6个含fla-A基因的标准品质粒瓶；所述质控品瓶设有阴性质控品瓶和阳性质控品瓶。
2.如权利要求I所述的梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒，其特征在于所述耐热DNA聚合酶瓶采用Tag酶瓶；所述阴性质控品为不含梅毒螺旋体DNA的样品，阳性质控品为含梅毒螺旋体DNA的样品； 所述6个含fla-A基因的标准品质粒的浓度可分别为I. OX 102copies/mL、I. OX IO3Cop ies/mL、I. OX 104copi es/mL、I. 0X105cop ies/mL、I. OXlO6Cop ies/mL 和l.OX 107copies/mL,共 6 个浓度。
3.如权利要求I所述的梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒，其特征在于所述PCR反应液的成份含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和fla_A基因引物、探针组成的混合物； 所述耐热DNA聚合酶具有3’ 一 5’ DNA聚合酶活性、5’ 一 3’ DNA外切核酸酶活性和可耐受高温的聚合酶；所述耐热DNA聚合酶最好是半衰期>45min的高温聚合酶。
4.如权利要求I所述的梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤 1)靶基因筛选，具体方法如下 从基因库中筛选梅毒螺旋体fla-A基因，fla-A基因探针和引物的设计采用PCR引物探针设计软件辅助完成，然后通过Basic Local Alignment Search Tool进行同源性比对以保证其特异性，合成的引物和探针用TE溶解，使用ND-1000UV-VIS波长紫外/可见光扫描分光光度计进行浓度测定后，保存，所述TE为IOmM Tri-HCl，pH5. 0,0. ImM TA ； 2)fla-A基因标准品质粒的构建，具体方法如下 以硅胶膜-离心柱法提取梅毒螺旋体Nichols株DNA作为模板，采用步骤I)中的fla-A基因的引物，进行PCR扩增，具体过程如下将扩增产物经过回收及纯化后，在微量离心管中配制DNA溶液，后加入5 μ L等量的Solution I，16°C反应30min，与pMD18_T载体连接将连接产物转化至DH5 α中，冰中放置30min，42°C加热45s后，再在冰中放置lmin，加入LB培养基，37°C震荡培养60min后，在含有X_Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落，挑选白色菌落，进行增殖培养，提取质粒并对其进行PCR，Xab I和Sal I双酶切及测序鉴定后，将构建好的质粒进行单酶切线性化处理，再用紫外分光光度计定量并-20°C保存作为FQ-PCR的标准品； 3)fla-A基因检测试剂标准曲线制作，其具体方法如下 包含fla-A基因的阳性克隆大肠杆菌在含Amp LB肉汤增菌，提取质粒，取IOyL质粒用双蒸水稀释100倍,260nm, 280nm比色，纯度=A26(I/A28(I,浓度=A260X 50 X 2 X 100 X IO-6X 6. 02 X IO23/(2806 X 324. 5 X 2) copies/mL,根据质粒浓度，进行梯度稀释，以每个浓度标准品作模板进行荧光定量反应，确定线性范围； 4)制备PCR反应液，其具体方法如下 采用PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、fla-A基因引物、探针的混合物共同组成PCR反应液；5)制备耐热DNA聚合酶，其具体方法如下 大肠杆菌用异丙基硫代_β-D半乳糖苷进行诱导表达，诱导后的菌悬液IOOml经5000r/min, 4°C离心5min,以IOml缓冲液I重悬菌液，4°C, 5000r/min,离心5min,细菌沉淀再悬于5ml缓冲液I中，加入溶菌酶使浓度达5mg/ml，37°C水浴20min ;加入5ml缓冲液II，75°C水浴 45min, 4°C, 15000r/min 离心 IOmin ;上清加入硫酸铵使达 30%, 4°C, 1500r/min 离心lOmin，沉淀溶于Iml缓冲液III中，并对缓冲液III在4°C条件下透析，每6h换液I次共4次，离心除去不溶物后，-20°C冻存； 6)建立样品处理方法，其具体方法如下 使用梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂检测梅毒螺旋体的样本，采用硅胶膜_离心柱法提取模板DNA ； 7)制备质控品，其具体方法如下 制备阴性质控品选择经过临床确认为阴性的临床标本； 制备阳性质控品选择经过临床确认为阳性的临床标本经稀释获得阳性质控品； 8)制备梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒，将DNA提取试剂、耐热DNA聚合酶、PCR反应液、标准品和质控品共同组成梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒。
5.如权利要求4所述的梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤I)中，所述fla-A基因探针和引物的序列如下所示 靶基因序列名称引物/探针序列 I-JI 物,I5'~CGTGGAAGGATTTCCGAAAGGAGCGTTTGA-3' Λ 4 KMi; iJ I 勿!列5'-CCCTGC AGTACCCATCCG.ACCCTC-3' 尖光深计.)r;列5'-FAM-AAGACAAAGGGTATGCC AC-BHQI -3'
6.如权利要求4所述的梅毒螺旋体fIa-A基因FQ-PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述梯度稀释选I. OX 102copies/mL、I. OX 103copies/mL、l.OX 104copies/mL>l.OX 105copies/mL>l.OX 106copies/mL>l.OX 107copies/mL 6 个浓度作标准品。
7.如权利要求4所述的梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述PCR缓冲液为pH=5. (TlO. O之间的稳定缓冲时，ρΗ=7. (T9. O ;引物的浓度为25ρπι01/μ L，荧光探针的浓度为20ρπιΟ1/μ L，dNTPs的浓度为2mmol/L ;镁离子的浓度为 15 20mmol/Lo
8.如权利要求4所述的梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤 5)中，所述缓冲液 I 为 50mmol/L tris-HCl, 50mmoI /T, Glucose, lmmol/L EDTA,ρΗ8· 0 ;所述缓冲液 II 为 5mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L KCl, lmmol/L EDTA, lmmol/L PMSF,0.5%Tween 20,0. 5%NP 40 ;所述缓冲液III为 50ml mol/L Tris-HCl, lOmmol/L KCl, lmmol/LDTT, 0. 5%PMSF, 50% 甘油。
9.如权利要求4所述的梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤6)中，所述样本包括组织、全血、分泌物临床标本；所述分泌物可包括皮肤、生殖器溃疡、糜烂部分的分泌物。
10.如权利要求4所述的梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤8)中，耐热DNA聚合酶的用量为8 IOU/反应。
全文摘要
梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒及其制备，涉及一种试剂盒。试剂盒设有DNA提取试剂瓶、耐热DNA聚合酶瓶、PCR反应液瓶、标准品瓶、质控品瓶和包装盒；所述DNA提取试剂瓶设有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、无水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第1清洗缓冲液瓶、洗脱液瓶、第2清洗缓冲液瓶和含收集管的离心柱；标准品瓶设有6个含fla-A基因的标准品质粒瓶；质控品瓶设有阴性质控品瓶和阳性质控品瓶。先筛选靶基因，再构建fla-A基因标准品质粒，制作fla-A基因检测试剂标准曲线后，再制备PCR反应液、耐热DNA聚合酶，建立样品处理方法后制备质控品，最后完成梅毒螺旋体fla-A基因FQ-PCR检测试剂盒。
文档编号C12M1/34GK102634451SQ201210140509
公开日2012年8月15日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日
发明者刘莉莉, 张长弓, 徐竟波, 杨天赐, 林丽蓉, 童曼莉 申请人:厦门大学附属中山医院