专利名称：一种表达角蛋白酶的重组菌及其发酵方法
技术领域：
本发明涉及酶领域，具体涉及ー种表达角蛋白酶的重组菌及其发酵方法。
背景技术：
角蛋白是ー种坚硬的不溶性蛋白，分为α-角蛋白和β-角蛋白，α-角蛋白是毛发中主要蛋白质，β_角蛋白主要存在于动物的羽毛、皮肤、爪和鱗片中。由于高度交联的胱氨酸残基形成的ニ硫键、分子间的疏水作用以及氢键作用，角蛋白难以被膜蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等降解，传统高压水解、酸碱蒸煮降解羽毛的方法耗能高，破坏热敏性氨基酸并污染环境。角蛋白酶是降解角蛋白的ー类酶，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物产生，主要 是金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶，其用于酶降解角蛋白，不存能耗高、污染强的问题，具有巨大的应用价值和研究前景。角蛋白酶不仅可以用于对角蛋白废弃物如羽毛、猪毛、羊毛等的降解，而且在肥料、医药、食品、洗涤剂和制革等エ业中广泛应用，具有生产高级营养品、饲料添加剤、美容、软化皮革、嫩化肉类等作用，并可降解引起人类新克雅氏症和疯牛病的Prion蛋白(PrPSc构象)，从而消灭朊病毒，更使其成为世界性的研究热点。角蛋白酶的应用领域十分广泛，但由于天然菌株中角蛋白酶产量较低、生产成本昂贵、难以エ业化生产，分离的角蛋白酶作用缓慢、有效性不够好，因此角蛋白酶还没有得到广泛的实际应用。随着基因工程技术的发展，通过现代分子生物学技术，构建具有潜在应用价值的高效角蛋白酶基因工程菌株，并改造现有角蛋白酶基因，提高重组酶表达量及其稳定性，为角蛋白酶的エ业化生产、废弃角蛋白的循环利用和饲料蛋白资源开发提供新的有效途径。王丽华等，“枯草芽孢杆菌角蛋白酶基因kerC在毕赤酵母中的表达研究”，四川农业大学，2011-06-01公开了ー种利用DNA重组技术将枯草芽孢杆菌B-3的角蛋白酶基因与pPICZ a A质粒重组，并成功地在在巴斯德毕赤酵母X-33中表达，但是其产酶能力低，仅为32. 31U/ml，不能满足エ业应用的需求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的角蛋白酶及其制备方法。角蛋白酶，keratinase,是ー类可专一地降解角蛋白的蛋白酶。本发明提供了ー种如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。还提供了ー种重组载体，它包含SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列。其中，所述的重组载体是重组pPICZ a A质粒。还提供了ー种重组菌，它包含前述的重组载体。其中，所述的重组菌为重组毕赤酵母。还提供了ー种角蛋白酶，它由SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列编码。优选地，它的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
其中，它的最适温度范围是50_60°C。其中，它的最适pH范围为7-10。还提供了前述角蛋白酶的制备方法，包含如下步骤i、取前述重组菌，接种到BMGY培养基上培养，培养温度为30°C，pH为6，至0D_=2 6 ；ii、收集菌体，将其培养在BMMY培养基中，培养温度为30°C，pH为6，进行诱导表达，诱导剂为甲醇，每24小时，加甲醇至I %浓度，诱导时间为96 144h ；iii、收集培养物上清，分离纯化，即得到角蛋白酶。还提供了前述角蛋白酶的另一种制备方法，包含如下步骤(I)取上述重组菌接种到YPD种子培养基上，pH为5. 5，温度为30°C下培养，制备得到种子液；(2)取步骤(I)制备的种子液，以5%的接种量接种到发酵培养基中发酵，发酵pH为4. 9，发酵温度为30°C ；每IL发酵培养基含有如下成分50g葡萄糖、15g磷酸ニ氢钾、16g硫酸镁、IOg硫酸钾、O. 8g氢氧化钾、O. 8g硫酸钙、O. 5g消泡剂、4g硫酸铵、Ig增效剂、生物素O. 473mL、微量元素溶液(PTMl) 2. 2mL ；(3)待碳源耗尽后，补加浓度为25%葡萄糖，流加浓度为25%甘油与甲醇的混合物，诱导表达，25%甘油与甲醇的体积比为8:1，甲醇的浓度维持为1%，直至酶活出现指数增长时终止发酵；(4)收集培养物上清，分离纯化，即得到角蛋白酶。本发明提供了一种新的表达角蛋白酶的毕赤酵母工程菌，该工程菌生产角蛋白酶的表达量高，且制备的角蛋白酶与天然角蛋白酶性质相似，适合大規模エ业化生产，具有良好的市场应用前景。
图I地衣芽孢杆菌S90kerA基因扩增结果，其中，MiDNA标准分子量(DL2000) ；1为kerA基因图2地衣芽胞杆菌角蛋白酶基因T克隆测序结果及其氨基酸序列图3地衣芽胞杆菌角蛋白酶基因与pPICZ a A连接克隆测序结果图4毕赤酵母菌落PCR鉴定結果，M为DNA标准分子量，1-4 :含pPICZ a A-kerA的菌落图5重组毕赤酵母表达产物电泳分析结果图6重组角蛋白酶基因菌株诱导产酶曲线图7重组毕赤酵母角蛋白酶分泌量及菌体密度变化曲线图8重组角蛋白酶最适反应pH图9重组角蛋白酶最适反应温度图10重组角蛋白酶温度稳定性图11重组角蛋白酶热稳定性
具体实施例方式以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容作进ー步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。实施例I本发明角蛋白酶的制备一、角蛋白酶重组菌的构建(一)角蛋白酶基因片段的制备I、地衣芽胞杆菌基因组DNA提取；2、利用RT-PCR及定点突变技术扩增出角蛋白酶除去信号肽的CDS序列，引物(下划线为酶切位点，斜体部分为突变碱基)和反应条件如下 引物I (F) :5’ GCTGGTACCGCTCAACCAGCTAAAAATGT-3’ (Kpn I)引物2 (R) :5’ -CGAGCGGCCGCTTGAGCAGCAGCTTCGACATTGAT-3’ (Not I)反应条件为
9.1 °C4 min
94 0C40 s
59°C50 SI 35 cycles
72 UImin」
72 "C10 min3、DNA片段回收割取含目的基因的胶条，用小量柱式凝胶回收试剂盒进行回收；4、在T4DNA连接酶作用下将回收的目的基因片段与T载体连接，得含目的基因(B. Iicheniformis角蛋白酶基因)的T克隆载体；5、琼脂糖凝胶电泳并测序检验扩增得到的目的基因片段。由图I可知，扩展得到的目的基因片段跟天然角蛋白酶基因片段的大小无差別，由图2可知，测序证明本发明扩增的到的目的基因片段跟地衣芽孢角蛋白酶基因片段核苷酸序列的数量一祥，有3个碱基的类型有差异(下划线标记的三个碱基的类型有区別)，且这几个碱基差异使该基因片段恰好含有与毕赤酵母偏爱的密码子，有利于角蛋白酶的表达。结果证明，本发明准确地扩增得到了含有毕赤酵母偏爱密码子的编码角蛋白酶的目的基因片段(KerA基因片段)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。(ニ)重组表达载体构建I、质粒双酶切及片断回收含目的基因KerA基因片段(B. Iicheniformis角蛋白酶基因)的T克隆载体与表达载体pPICZ a A均用限制性内切酶KpnI和Not I双酶切；酶切产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后回收备用(胶回收纯化试剂盒，购自天根生物公司)。双酶切体系如下
权利要求
1.一种如SEQ ID NO :1所不的核苷酸序列。
2.ー种重组载体，其特征在干包含SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于所述的重组载体是重组PPICZaA质粒。
4.ー种重组菌，其特征在于它包含权利要求2或者3所述的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述的重组菌为重组毕赤酵母。
6.ー种角蛋白酶，其特征在干它由SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列编码。
7.根据权利要求6所述的角蛋白酶，其特征在干它的氨基酸序列如SEQID N0:2所/Jn ο
8.根据权利要求7所述的角蛋白酶，其特征在干它的最适温度范围是50-60°C;最适pH范围为7-10。
9.权利要求61任意一项所述角蛋白酶的制备方法，其特征在于包含如下步骤 i、取权利要求4或者5所述的重组菌，接种到BMGY培养基上培养，培养温度为30°C，pH 为 6，至 OD6QQ=2 6 ； ii、收集菌体，将其培养在BMMY培养基中，培养温度为30°C，pH为6，进行诱导表达，诱导剂为甲醇，每24小时，加甲醇至I %浓度，诱导时间为96 144h ； iii、收集培养物上清，分离纯化，即得到角蛋白酶。
10.权利要求61任意一项所述角蛋白酶的制备方法，其特征在于包含如下步骤 (O取权利要求4或者5所述的重组菌接种到YPD种子培养基上，pH为5. 5，温度为.30°C下培养，制备得到种子液； (2)取步骤(I)制备的种子液，以5%的接种量接种到发酵培养基中发酵，发酵pH为.4.9，发酵温度为30 0C ； 每IL发酵培养基含有如下成分50g葡萄糖、15g磷酸ニ氢钾、16g硫酸镁、IOg硫酸钾、.O.8g氢氧化钾、O. 8g硫酸钙、O. 5g消泡剂、4g硫酸铵、Ig增效剂、生物素O. 473mL、微量元素溶液(PTMl) 2. 2mL ； (3)待碳源耗尽后，补加浓度为25%葡萄糖，流加浓度为25%甘油与甲醇的混合物，诱导表达，25%甘油与甲醇的体积比为8:1，甲醇的浓度维持为1%，直至酶活出现指数增长时终止发酵； (4)收集培养物上清，分离纯化，即得到角蛋白酶。
全文摘要
本发明公开了一种如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，公开了包含该核苷酸序列的重组载体、重组菌，以及SEQ ID NO1所示的核苷酸序列编码的角蛋白酶。本发明还公开了利用本发明重组菌制备角蛋白酶的方法，该方法产酶量高，制备的角蛋白酶与天然角蛋白酶的性质类似，克服了现有技术的缺陷，具有工业应用价值。
文档编号C12N15/63GK102676561SQ201210140340
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日
发明者何军, 余冰, 吴德, 胡洪, 陈代文 申请人:陈代文