专利名称：一种木聚糖酶的发酵方法及发酵培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于发酵领域，具体涉及一种木聚糖酶的发酵方法及发酵培养基。
背景技术：
木聚糖是植物半纤维素的主要成分，是自然界中广泛存在的、含量仅次于纤维素的可再生性多糖资源。木聚糖酶，主要是由P-1，4-D-内切木聚糖酶和P-l，4-D-外切木糖苷酶组成，此外还有一些脱支链酶，如a -L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、a -葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶等，其可降解木聚糖中的￠-1,4糖苷键，这一作用既可降低木聚糖的粘性和抗营养性，又可产生具保健和调节胃肠功能的低聚木糖，因而有广泛的应用前景。国内外众多研究均已证实木聚糖酶应用于畜牧生产中，可改善畜禽消化道功能、增强免疫力、提高饲料利用率和生产性能、减少粪便对环境的污染；应用于食品工业，可提高食品品质和加工效率，还具保健功能；应用于造纸工业，则可大大减少毒性漂白剂的使用，降低纸的脆性，有效减少有毒废液对环境的污染。虽然木聚糖酶的应用价值早已在世界范围内得到确认，但由于该酶在天然材料中表达水平太低、难以大量生产、并且生产成本昂贵以及木聚糖酶的一些酶活性不能完全满足应用相关条件，因此，到目前为止木聚糖酶并没有得到很好的推广应用。随着基因工程技术的发展，通过基因工程技术这一手段，利用生物反应器则有望成百上千倍地提高其表达量，运用基因工程技术在分子水平上对木聚糖酶进行分子改造，则可望解决一些木聚糖酶活性(如抗逆性、PH值、热稳定性等)的应用缺陷。国外对重组木聚糖酶的研究开展较早，并先后从天然微生物，如黑曲霉、木霉及芽孢杆菌中克隆出其基因并实现异源表达。但受表达水平的限制，当前市场上销售的木聚糖酶仍然以天然酶为主。然而，微生物在分泌木聚糖酶的过程中，通常伴有其它酶类的分泌，这无疑大大增加了分离纯化的难度和生产成本。何军，“高效木聚糖酶基因工程菌的构建及重组酶没学性质与功效研究”，四川农业大学中公开了一种含有编码里氏木霉木聚糖酶基因序列的重组毕赤酵母工程菌PX-I，其表达产物能够有效分泌至培养基，且杂蛋白分泌量极少，但是产酶水平低，仅为560U/ml，不能满足工业应用的需求，如何进一步提高异源表达水平是实现木聚糖酶工业化廉价生产的关键。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的木聚糖酶发酵方法及发酵培养基。本发明提供了一种制备木聚糖酶的方法，它包括如下步骤i、取包含SEQ ID NO. I所示核苷酸序列的重组毕赤酵母菌，接种到YPD种子培养基上，pH为5. 4^5. 6，温度为2扩31°C下培养，制备得到种子液；U、取步骤i制备的种子液，以广3%的接种量接种到酵母发酵培养基中发酵，发酵pH为5. 4 5. 6，发酵温度为29 31。。；
iii、碳源耗尽后，饥饿0. 5 lh，用甲醇诱导木聚糖酶表达，甲醇的浓度维持为0. 5%(v/v)，直至酶活出现下降时终止发酵；iv、收集培养物上清，分离纯化，即得到木聚糖酶。包含SEQ ID NO. I所示核苷酸序列的重组毕赤酵母菌，简称毕赤酵母PX-I，是何军，“高效木聚糖酶基因工程菌的构建及重组酶没学性质与功效研究”，四川农业大学博士论文中制备的毕赤酵母工程菌PX-I。其中，步骤i所述pH为5. 5，所述温度为30°C。其中，步骤ii所述的接种量为2%，发酵pH为5. 5，发酵温度为30°C。 其中，步骤ii所述的酵母发酵培养基每一升培养基包括如下成分磷酸盐
6.5g 55g、钙盐0. 23 0. 93g、钾盐4. 55 18. 2g、镁盐3. 73 14. 9g、氢氧化钾I. 03 I. 5g、生物素4. 73ml、PTMl微量元素溶液4. 37ml、甘油40ml。微量元素(PTMl) (g/L):五水硫酸铜6. 0，碘化钾0. 18，一水硫酸锰3. 0，二水钥酸钠0. 2，硼酸0. 02，氯化钴0. 5，氯化锌20. 0，七水硫酸亚铁65. 0，浓硫酸5. OmL0优选地，所述磷酸盐为磷酸二氢铵、磷酸二氢钾或者六偏磷酸钠。优选地，所述钙盐为硫酸钙；所述钾盐为硫酸钾；所述镁盐为七水硫酸镁。优选地，所述培养基每一升培养基包括如下成分磷酸二氢铵50g，磷酸二氢钾5g，二水硫酸钙0. 93g，硫酸钾18. 2g，七水硫酸镁14. 9g，氢氧化钾I. 5g，甘油40mL，生物素
4.73mL，PTMl微量元素溶液4. 37mL。优选地，所述培养基每一升培养基包括如下成分六偏磷酸钠6. 5g，二水硫酸钙
0.23g，硫酸钾4. 55g，七水硫酸镁3. 73g，氢氧化钾I. 03g,甘油40mL,生物素4. 73mL, PTMl微量元素溶液4. 37mL。本发明还提供了一种发酵培养基，每一升培养基包括如下成分磷酸盐
6.5g 55g、钙盐0. 23 0. 93g、钾盐4. 55 18. 2g、镁盐3. 73 14. 9g、氢氧化钾I. 03 I. 5g、生物素4. 73ml、PTMl微量元素溶液4. 37ml、甘油40ml。其中，所述磷酸盐为磷酸二氢铵、磷酸二氢钾或者六偏磷酸钠。其中，所述钙盐为硫酸钙；所述钾盐为硫酸钾；所述镁盐为七水硫酸镁。优选地，所述培养基每一升培养基包括如下成分磷酸二氢铵50g，磷酸二氢钾5g，二水硫酸钙0. 93g，硫酸钾18. 2g，七水硫酸镁14. 9g，氢氧化钾I. 5g，甘油40mL，生物素
4.73mL，PTMl微量元素溶液4. 37mL。优选地，所述培养基每一升培养基包括如下成分六偏磷酸钠6. 5g，二水硫酸钙
0.23g，硫酸钾4. 55g，七水硫酸镁3. 73g，氢氧化钾I. 03g,甘油40mL,生物素4. 73mL, PTMl微量元素溶液4. 37mL。每一升培养基包括如下成分六偏磷酸钠6. 5g，二水硫酸钙0. 23g，硫酸钾4. 55g，七水硫酸镁3. 73g，氢氧化钾I. 03g,甘油40mL，生物素4. 73mL, PTMl微量元素溶液4. 37mL。本发明提供的发酵方法可以显著提高毕赤酵母工程菌PX-I的产酶水平，克服现有产酶量低的缺点，提供的两种甘油发酵培养基的发酵水平和产酶水平相当，甘油低浓度盐培养基含盐量低，生产成本低，可实现木聚糖酶的大规模工业化生产，市场应用前景良好。
图I毕赤酵母PX-I的生长曲线图2菌体湿重曲线图3不同培养基的产酶曲线图4不同pH对毕赤酵母木聚糖酶活力的影响图5不同反应温度对毕赤酵母木聚糖酶活力的影响图6毕赤酵母木聚糖酶在不同pH下保温时的失活速率图7pH对毕赤酵母木聚糖酶稳定性的影响图8毕赤酵母木聚糖酶在不同温度时的失活速率图9温度对毕赤酵母木聚糖酶稳定性的影响
具体实施例方式以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。实施例I本发明木聚糖酶的制备I材料与方法I. I 材料I. I. I 菌种含里氏木霉(Trichoderma reesei) Rut C-30 木聚糖酶基因(Xyn II)的毕赤酵母(Pichia Pastoris) PX-1，其为包含SEQ ID NO. I所示核苷酸序列的重组毕赤酵母菌，按照何军，“高效木聚糖酶基因工程菌的构建及重组酶没学性质与功效研究”，四川农业大学中公开的方法制备。I. I. 2 培养基酵母培养基YPD (质量分数)1%酵母浸出物，2%大豆蛋白胨，2%葡萄糖；甘油基础盐培养基(GLY-BSM) (1L):磷酸二氢铵50g，磷酸二氢钾5g，二水硫酸钙
0.93g，硫酸钾18. 2g，七水硫酸镁14. 9g，氢氧化钾I. 5g，甘油40mL，生物素4. 73mL，微量元素溶液(PTMl) 4. 37mL,消泡剂lmL。葡萄糖基础盐培养基(GLU-BSM) (1L):以40g葡萄糖代替40mL甘油；甘油低浓度盐培养基(GLY-LS-BSM) (1L):六偏磷酸钠((NaPO3) 6 6. 5g，二水硫酸钙0. 23g，硫酸钾4. 55g，七水硫酸镁3. 73g，氢氧化钾I. 03g,甘油40mL,生物素4. 73mL,微量元素溶液(PTMl) 4. 37mL,消泡剂lmL。其中，微量元素(PTMl) (g/L):五水硫酸铜6. 0，碘化钾0. 18，一水硫酸锰3. 0，二水钥酸钠0. 2，硼酸0. 02,氯化钴0. 5，氯化锌20. 0,七水硫酸亚铁65. 0，浓硫酸5. OmL。试剂均为国产生化试剂纯或分析纯。I. 2 方法I. 2. I培养方法(I)首先用75%的乙醇将菌种保存管外壁消毒，取保藏的毕赤酵母(PichiaPastoris)PX-l划线转接到活化斜面(YPD)，30°C恒温静置培养2d，使菌种复壮。接I环 生长良好的活化斜面种子至装有50mL种子培养基(YPD)的500mL摇瓶中，置于200r/min恒温摇瓶柜，30°C振荡培养24h,8层纱布封口，作为发酵用的一级种子；
(2)取一级种子IOmL接种于装有300mLYro培养基的IOOOmL摇瓶中，30°C，200r/min振荡培养16h，8层纱布封口，作为发酵用的二级种子。
(3)取得到的二级种子，以2%的接种量分别接种到上述三种培养基中，在30°C和300r/min的条件下振荡培养。发酵全程用氨水调节培养基的pH，使之维持在5. 5。(4)待碳源耗尽后，饥饿0.5 Ih开始诱导，甲醇的浓度维持为0.5% (v/v)0甲醇采用流加的方式后，每12h取样检测一次酶活，直至酶活出现下降时终止发酵(5)收集发酵液上清，用常规分离纯化方法纯化，即得到木聚糖酶。I. 2. 2酶活定义在37°C，pH为5. 50的条件下，每分钟从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中降解释放I u mo I还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。I. 2. 3酶液和固体酶的制备酶液的制备毕赤酵母液体培养发酵液，经4000r/min离心15min的上清液,并作
适当稀释。固体酶的制备据最优发酵条件培养菌种，所得液体酶以玉米芯粉和玉米淀粉混合物按照I :6的比例吸附，喷雾干燥后测得所得固体酶产品的水分含量为4. 68%，以固体酶进行酶学性质的分析。I. 2. 4考察指标1.2. 4. I酵母细胞密度分析将菌悬液作适当稀释，以去离子水为对照，使用紫外/可见分光光度计于波长600nm下测定吸收值(0D_)，OD6tltl=OD读数X稀释倍数，以OD值作为生物量绘制生长曲线。残留的样液4000r/min离心分离lOmin，上清液_40°C下保存，以备酶活测定。I. 2. 4. 2菌体湿重的测定每隔4h，取IOmL发酵液，4000r/min离心lOmin，倒掉上清液，称重后减去离心管重即为湿菌体浓度(g/L)。I. 2. 4. 3木聚糖酶活力的测定按照GB/T 23874-2009 标准检测。I. 2. 4. 4酶学性质的分析酶的活力受测定环境的影响，相同的酶在不同的催化条件下表现出不同的催化能力，因此酶学性质的酶活以相对酶活力来表示相对酶活=特定条件下的酶活/最适条件下的酶活X 100%I. 2. 5数据统计与分析用Excel软件统计和计算,并作图。2结果与分析2. I不同培养基对重组毕赤酵母生长曲线及生物量的影响以2%的接种量接种到30L发酵罐，每隔4h进行0D_和菌体湿重的检测，所得结果见图r2和表广2。表I菌种PX-I的生长曲线(OD600)
权利要求
1. 一种制备木聚糖酶的方法，其特征在于它包括如下步骤 1.取包含SEQID NO. I所示核苷酸序列的重组毕赤酵母菌，接种到YH)种子培养基上，pH为5. 4^5. 6，温度为2扩31°C下培养，制备得到种子液； ii、取步骤i制备的种子液，以广3%的接种量接种到酵母发酵培养基中发酵，发酵pH为5. 4 5. 6，发酵温度为29 31。。； iii、碳源耗尽后，饥饿0.5 lh，用甲醇诱导木聚糖酶表达，甲醇的浓度维持为0. 5% (v/V)，直至酶活出现下降时终止发酵； iv、收集培养物上清，分离纯化，即得到木聚糖酶。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤i所述pH为5.5，所述温度为30°C。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤ii所述的接种量为2%，发酵pH为5.5，发酵温度为30°C。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤ii所述的酵母发酵培养基每一升培养基包括如下成分磷酸盐6. 5g 55g、钙盐0. 23 0. 93g、钾盐4. 55 18. 2g、镁盐3.73 14. 9g、氢氧化钾I. 03 I. 5g、生物素4. 73ml、PTMl微量元素溶液4. 37ml、甘油40ml。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述磷酸盐为磷酸二氢铵、磷酸二氢钾或者六偏磷酸钠。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述钙盐为硫酸钙；所述钾盐为硫酸钾；所述镁盐为七水硫酸镁。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于每一升培养基包括如下成分磷酸二氢铵50g,磷酸二氢钾5g，二水硫酸钙0. 93g，硫酸钾18. 2g，七水硫酸镁14. 9g，氢氧化钾I. 5g，甘油40mL，生物素4. 73mL, PTMl微量元素溶液4. 37mL。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于每一升培养基包括如下成分六偏磷酸钠6.5g，二水硫酸钙0. 23g，硫酸钾4. 55g，七水硫酸镁3. 73g，氢氧化钾I. 03g,甘油40mL，生物素4. 73mL，PTMl微量元素溶液4. 37mL。
9.一种发酵培养基，其特征在于每一升培养基包括如下成分磷酸盐6. 5g飞5g、钙盐0. 23 0. 93g、钾盐 4. 55 18. 2g、镁盐 3. 73 14. 9g、氢氧化钾 I. 03 I. 5g、生物素 4. 73ml,PTMl微量元素溶液4. 37ml、甘油40ml。
10.根据权利要求9所述的培养基,其特征在于每一升培养基包括如下成分六偏磷酸钠6. 5g，二水硫酸钙0. 23g，硫酸钾4. 55g，七水硫酸镁3. 73g，氢氧化钾I. 03g,甘油40mL，生物素4. 73mL, PTMl微量元素溶液4. 37mL。
全文摘要
本发明提供了本发明提供了一种制备木聚糖酶的方法，它包括如下步骤ⅰ、取包含SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组毕赤酵母菌，接种到YPD种子培养基上，pH为5.4~5.6，温度为29~31℃下培养，制备得到种子液；ⅱ、取步骤ⅰ制备的种子液，以1~3％的接种量接种到毕赤酵母发酵培养基中发酵，发酵pH为5.4~5.6，发酵温度为29~31℃；ⅲ、碳源耗尽后，饥饿0.5~1h，用甲醇诱导木聚糖酶表达，甲醇的浓度维持为0.5%(v/v)，直至酶活出现下降时终止发酵；ⅳ、收集培养物上清，分离纯化，即得到木聚糖酶。本发明制备木聚糖酶的方法简便，产酶量高，克服了现有技术的缺陷，具有工业应用价值。
文档编号C12N9/42GK102643790SQ20121014027
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日
发明者何军, 余冰, 吴德, 郑萍, 陈代文 申请人:何军