专利名称：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌IsdB蛋白活性片段的重组蛋白、及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术制药领域，涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB活性片段IsdB2重组蛋白、及其制备方法和应用。
背景技术：
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌指的是对恶唑类青霉素如甲氧西林、苯唑西林和氟氯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌，是一种存在人和动物的体表、鼻咽、会阴部及肠道的革兰阳性菌，通常引发皮肤软组织感染、菌血症以及转移并发症，如肺炎、心内膜炎、脓毒性关节炎和骨髓炎。自1961年被英国学者Jevons首次发现，目前已成为全球ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一，其引起的局部感染经久不愈，全身感染死亡率高达20%。因其传播途径广泛，易暴发流行，又由于其致病性强，变异性大，且呈多重耐药而成为临床 上治疗的难点，被称为“超级细菌”，这一特点使其极有可能作为未来军事斗争的细菌武器和生物恐怖战剂。当前，MRSA已与乙型肝炎、AIDS被列为世界三大最难解決的感染性疾病，并位居首位。在国外，2005年美国的MRSA感染监控資料显示，美国全年的严重感染人数为9. 4万多人，致死病例约为I. 9万人，这一数字甚至超过艾滋病致死人数。在国内，2008年中国细菌耐药性检测协作网(CHINET)检测结果显示，国内主要地区12所教学医院MRSA平均检出率为55. 9%，最高为77. 5%，属于MRSA感染的严重国家之一。以上海为例，2004年该地区14所医院金黄色葡萄球菌中MRSA的平均检出率为63. 9%，最高为86. 5%，而2006年MRSA的平均检出率为64. 6%，最高达92. 5%。由此可见，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌正在全球蔓延，其感染率和死亡率不断攀升，严重威胁人类健康。目前，万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最后一道防线，但1997年以来耐万古霉素的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌相继被分离出来，可见抗生素的发展远远跟不上细菌耐药性的发展，使得耐甲氧西林金黄色葡萄球菌即将面临无抗生素可治的严峻挑战。因此，加强对MRSA感染的防治研究，已迫在眉睫。目前，美国研发的MRSA疫苗已进入III期临床试验阶段，因此，研发具有自主知识产权的、高效、安全、经济的MRSA疫苗对控制MRSA感染、耐药性发展、生物恐怖防御和提高国际竞争力具有重要意义。由于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌致病因子包括荚膜多糖、ClfA, IsdB、肠毒素、TSST-U α-溶血素以及凝固酶等数十种，且含量较低，直接从全菌中分离纯化出保护性抗原的难度较大，方法繁琐，不利于疫苗的产业化制备。利用基因工程技术将菌体有效的保护性抗原进行克隆表达使MRSA疫苗研制的可行性大大提高。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB是一种外膜蛋白抗原，IsdB不仅是MRSA —个重要外膜锚钉蛋白，在MRSA定植粘附中期重要作用，同时它也是MRSA从宿主获得铁的一个主要工具。细菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标，可以介导对细菌最直接有效的杀灭作用，是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关键因素。利用生物信息学对IsdB进行结构功能分析，发现IsdB是两次跨膜蛋白，由胞外区以及跨膜区组成。由于IsdB是的细胞壁锚定蛋白，因此其捕获血红蛋白主要由胞外区的蛋白质发挥作用。这为设计亚单位疫苗提供了理论基础。亚单位疫苗是去除病原体中与激发保护性免疫无关甚或有害的成分，但保留有效免疫原成分的新型疫苗。然而，亚单位疫苗由于具有诸多局限性，例如其在受体内引起的免疫反应较多是短暂性的，不能引起长期有效的免疫性，因此选择的合适的免疫原成分就成为需要解决的重大问题。
发明内容
针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的高耐药性，本发明提供一种耐甲氧西林金黄色 葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB的活性片段IsdB2重组蛋白，其可应用于制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。鉴于ISdB蛋白为两次跨膜蛋白，其胞外区对应34飞28的氨基酸序列，并且其捕获血红蛋白主要由胞外区的蛋白质发挥作用，为了在最大限度上保持IsdB的结构和功能不发生较大的变化，本发明同时截短IsdB (SEQ IDNO :1)氨基端I 33个氨基酸和羧基端的f 23个氨基酸后对IsdB活性片段进行克隆、表达和保护性免疫的评价，将IsdB截短后的片段命名为IsdB2。本发明所述活性片段IsdB2包含IsdB蛋白的胞外区，其氨基酸序列为为SEQ IDNO 3或在SEQ ID NO 3的氨基端和/或羧基端添加或缺失若干个氨基酸后得到的与SEQID NO :3具有相同或相似功能的序列；优选地，所述活性片段的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，即所示序列的氨基端和羧基端分别缺失33和23个氨基酸后所获得的示于SEQ ID NO 4的序列，即同时截短IsdB (SEQ ID NO :1)氨基端33个氨基酸和羧基端的23个氨基酸后获得的序列。本发明还提供一种用于表达IsdB2重组蛋白的重组表达载体，其包含编码所述IsdB2重组蛋白的核苷酸序列以及载体序列。所述编码IsdB2重组蛋白的核苷酸序列可以是SEQ ID NO :4或在SEQ ID NO :4的一端或两端添加或缺失若干个核苷酸后得到的编码与SEQ ID NO :3所示蛋白具有相同或相似功能蛋白的序列；优选地，所述核苷酸序列为编码SEQ ID NO :3氨基酸序列的SEQ IDNO :4。本发明优选采用pGEX-6p_2载体来构建重组表达载体，表达IsdB2重组蛋白，pGEX是由Smith和Johnson于1987年构建的表达融合蛋白的载体,其主要特点是载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签是蛋白纯化的标记。与其他融合载体相比，PGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。因此，本发明还提供一种宿主菌，其导入有上述构建的重组表达载体。本发明还提供一种表达IsdB2重组蛋白的方法，其包含以下步骤1)根据编码IsdB2重组蛋白的核酸序列设计正向引物isdB2-F和反向引物isdB2-R;2)使用步骤I)设计的正向引物和反向引物，通过PCR扩增出编码IsdB2重组蛋白的基因片段；3)将步骤2)所获得的基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主菌；以及4)诱导转化后的宿主菌表达IsdB2重组蛋白。本发明设计的正向引物和反向引物的优选核苷酸序列分别示于SEQID N0:5和SEQ ID NO6o所使用的宿主菌优选大肠杆菌XLlbule。本发明还提供一种IsdB2重组蛋白在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗中的应用。本发明还提供一种IsdB2重组蛋白在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测试剂盒中的应用。本发明采用基因工程技术克隆表达此截短的保护性抗原成分IsdB2蛋白，表达量 高，便于分离纯化，而且高效安全。IsdB2重组蛋白可以直接与佐剂(如Al (OH) 3佐剂、MF59、AS03、ASO4、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂等)配合使用，适用于注射免疫接种。本发明的基因工程重组蛋白的表达方法具有以下优点1) IsdB2重组蛋白表达质粒在原核表达系统一大肠杆菌中诱导表达；2)选择pGEX载体系列时，IsdB2重组蛋白以融合蛋白形式表达；表达载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性；表达率约为30%，纯化出来的IsdB2重组蛋白纯度大于95% ；3)IsdB2重组蛋白均能够诱导动物产生特异性的抗体。利用本发明IsdB2重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体和细胞免疫应答。并经动物实验证实，所述基因工程重组多价疫苗具有良好的抗MRSA感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图I是IsdB2基因片段的PCR扩增结果，其中泳道M :核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道I 3 目的基因片段IsdB2 (1785bp)的PCR扩增产物。图2为表达载体pGEX-6p-2_IsdB (1785bp)的酶切鉴定结果泳道M :核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道1-6 :重组表达质粒pGEX-6p-2_IsdB经酶切后的鉴定结果，其中泳道4表示酶切后分离的片段4000bp和1785bp ；图3表示不同温度下诱导蛋白表达结果泳道M :蛋白分子量标准(Marker)
泳道1、3、5、7、9 :表达载体分别在30°C、25°C、18°C、16°C、12°C下诱导表达后，在上清中获得的蛋白。泳道2、4、6、8 :表达载体分别在30°C、25°C、18°C、16°C下诱导表达后，在沉淀中获
得的蛋白。图4表示重组表达载体在16 °C过夜诱导表达后，获得含GST标签的融合蛋白，其中泳道M :蛋白分子量标准(Marker)；泳道1、2:重组表达载体在16°C下过夜诱导表达后，在上清中获得含GST标签的融合蛋白；泳道3、4 :重组表达载体在16°C下过夜诱导表达后，在沉淀中获得的蛋白。 图5表示含GST标签的融合蛋白酶切结果泳道M :蛋白分子量标准(Marker)；泳道I :酶切前，含有GST标签的融合蛋白；泳道2 :酶切后，在上清获取的目的蛋白；泳道3 :酶切后,第一次洗漆用于结合表达蛋白的GlutathioneSepharose 4B凝胶柱(beads)获取的目的蛋白；泳道4 :酶切后，第二次洗涤beads获取的目的蛋白；泳道5 :酶切后，非特异性结合在beads的目的蛋白和特异性结合在beads上的酶和GST标签。图6是利用在线生物信息软件对IsdB蛋白跨膜区预测结果图。图7是利用Porter软件对IsdB 二级结构预测结果图，其中“H”表示α螺旋“Ε”表示β折叠“C”表示无规则卷曲“Τ”表示β转角。图8利用SWISS-MODEL软件通过同源模建在PDB数据库中寻找模板，对IsdB进行
三级结构预测。图9利用SWISS-MODEL软件通过同源模建在PDB数据库中寻找模板，对IsdB进行
三级结构预测。图10是重组表达载体测序后与IsdB2的核酸序列对比结果。
具体实施例方式本发明所使用的菌株与各种试剂如下I.菌株、质粒金黄色葡萄球菌MRSA-252国际标准株由美国ACTT提供；菌株XL-Iblue大肠杆菌为美国安捷伦公司产品；质粒pGEX_6p_2 为美国 GE Healthcare 公司产品；质粒pET_22b为美国merck公司产品；2.试剂primeSTAR HS DNA Polymerase>DNA Marker、限制性内切酶 BamHI 和 Not I、蛋白Marker为大连TakaRa公司产品；质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；细菌基因组提取试剂盒、超薄回收试剂盒以及显色液为天根公司产品；
T4DNA Ligase 为 Fermentas 公司产品；谷胱甘妝-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose 4B为美国GE Healthcare公司亮抑妝Leupeptin hemisulfate 和胃蛋白抑制剂 PepstatinA 购自德国 AppliCh公司；苯甲基磺酰氟PMSF来自上海碧云天生物技术研究所。本发明中所使用PBS、Tris等化学试剂均为市售的分析纯；本发明中所使用TB培养基、MH培养基等均为市售的生化制品。实施例I :耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB活性片段IsdB2的克隆I.首先根据MRSA_252IsdB蛋白全长基因序列，应用生物信息软件进行结构分析，分析结果参见附图6-9，从而确定需要扩增的IsdB2目的基因片段。2.根据分析结果，采用PCR方法自MRSA-252基因组扩增IsdB2目的基因片段，扩增步骤如下I)设计PCR引物如下，分别为SEQ ID NO :5_6 (下划线示酶切位点碱基序列)isdB2-F SEQ ID NO 55，-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAGC-3’BamH IisdB2-R SEQ ID NO :65’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-3，Not I本实施例将编码SEQ ID NO :4所示IsdB2氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO 3作为目的基因片段进行PCR扩增，但本领域技术人员应该理解，可以选择衍生自SEQ ID NO2所示核苷酸序列、在其对应编码蛋白氨基酸序列(如SEQ ID NO: I所示)氨基端和羧基端分别缺失1-33和1-23个密码子后所获得的任意序列作为目的基因片段。2) _80°C冷冻库中取出保存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA-252菌株涂布于MRSA-252专用固体培养基上，于37 °C培养过夜，再挑取单菌落接种于MRSA-252专液体体培养基中培养8个小时，参照细菌基因组抽提试剂盒抽提MRSA基因组。3)以MRSA-252全基因组DNA为模板PCR扩增IsdB2基因片段PCR体系
模扳(239.2 ng/μ )2.5μ1
isdB2-F (50μΜ)Ιμ
isdB2-R (50μΜ)Ιμ
Taq _2.5μ1
dNTP2 μ!
BufferΙ5μ权利要求
1.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB的活性片段IsdB2重组蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO :3或在SEQ ID NO: 3的氨基端和/或羧基端添加或缺失若干个氨基酸后得到的与SEQ ID NO :3具有相同或相似功能的序列。
2.—种权利要求I所述IsdB2重组蛋白的重组表达载体，其特征在于，包含编码所述IsdB2重组蛋白的核苷酸序列以及载体序列。
3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQID N0:4或在SEQ ID NO :4的一端或两端添加或缺失若干个核苷酸后得到的编码与SEQ ID NO :3所示蛋白具有相同或相似功能蛋白的序列。
4.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述载体序列为pGEX-6p-2载体序列。
5.—种宿主菌,其特征在于,导入有权利要求2所述的重组表达载体。
6.ー种表达权利要求I所述IsdB2重组蛋白的方法，其特征在于，包含以下步骤 .1)根据编码IsdB2重组蛋白的核酸序列设计正向引物和反向引物； .2)使用步骤I)设计的正向引物和反向引物，通过PCR扩增出编码IsdB2重组蛋白的基因片段； .3)将步骤2)所获得的基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主菌；以及 .4)诱导转化后的宿主菌表达IsdB2重组蛋白。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤I)中所设计的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6。
8.权利要求I所述的IsdB2重组蛋白在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗中的应用。
9.权利要求I所述的IsdB2重组蛋白在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB的活性片段IsdB2重组蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No3或在SEQID NO3的氨基端和/或羧基端添加或缺失若干个氨基酸后得到的与SEQID NO3具有相同或相似功能的序列。本发明还公开了构建所述重组蛋白的表达载体、转化宿主菌而制备该重组蛋白的方法，以及所述重组蛋白在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗以及相关检测试剂盒中的用途。本发明采用基因工程技术克隆表达此截短的保护性抗原成分IsdB2蛋白，表达量高，便于分离纯化，而且高效安全。所述基因工程重组多价疫苗具有良好的抗MRSA感染的免疫保护效果。
文档编号C12N1/21GK102675433SQ20121014038
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者冯强, 卢陆, 曾浩, 童文德, 蔡昌芝, 邹全明 申请人:中国人民解放军第三军医大学, 重庆原伦生物科技有限公司