专利名称：一种缺失型α-地中海贫血基因、检测试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及缺失型a-地中海贫血基因(-a 29 6)、检测试剂盒及方法。
背景技术：
α-地中海贫血是由于a-珠蛋白基因缺失导致其合成速率改变而致，在遗传学上具有高度的异质性，我国南方有较高的发病率。a-地中海贫血分子缺陷主要为基因的大片段缺失。导致a -地中海贫血的缺失突变有多种类型，在中国人中已发现至少共有7种缺失型突变，即一SEA、-a 3_7、-a 4_2、-a 2_7、一THAI、一FIlP — ，其中以东南 (_」EA)、左缺(-a3·7)和右缺(_a4_2)最常见。近年来，新的缺失不断被发现与鉴定。
发明内容
本发明提供一种新的缺失型α-地中海贫血基因(-α 29 6)及其检测试剂盒、检测方法。本发明提供一种缺失型a-地中海贫血基因(-a 29 6)，其序列如SEQ ID NO: I所示。携带该缺失型基因的杂合病人表现为轻微的地中海贫血症状。一种检测试剂盒，含有能够识别所述基因的试剂。所述试剂包括检测缺失型α-地中海贫血基因(-α 29 6)的上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:2，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:3所示。所述试剂包括检测作为对照的人CLCN7基因的上游引物和下游引物，上游引物序列如SEQ ID N0:4所示，下游引物序列如SEQ ID N0:5所示。权利要求I所述基因的检测方法，包括如下步骤a)提取待测人体外周血的基因组DNA ；b)以所述基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到PCR产物；c)对所述PCR产物作琼脂糖凝胶电泳检测，只得到一条带I. 3kb条带时，结果为阴性；得到I. 3kb和2. Okb两条带时结果为阳性；d)其中，所述步骤b)中，PCR扩增缺失型α-地中海贫血基因(_α 29 6)用到的引物序列为:上游引物序列如SEQ ID Ν0:2所示，下游引物序列如SEQ ID Ν0:3所示。扩增人CLCN7基因用到的引物序列为上游引物序列如SEQ ID Ν0:4所示，下游引物序列如SEQ IDNO:5所示。本发明的有益效果是得到一种缺失型α-地中海贫血基因，便于地中海贫血筛选。
图I是先证者外周血DNA样本的MLPA检测结果图，使用MLPA检测先证者α -珠蛋白基因簇拷贝数(NG_000006. I 3893-165187)，结果显示探针6-8完全缺失，在探针
4-5,9-11发生部分缺失；
图2用于MLPA检测的探针在α -珠蛋白基因上的相对位置，粗线条表示缺失型α-地中海贫血基因(-α 29 6)的缺失区域；图3是PCR扩增产物电泳结果图，显示母亲和先证者携带该缺失型α-地中海贫血基因(-α 29 6)，父亲未携带该缺失型α-地中海贫血基因(-α 29 6)；图4是缺失片段连接点的测序峰图。
具体实施例方式下面通过具体实施方式
结合附图对本发明作进ー步详细说明。申请人:通过MLPA检测试剂盒对人体外周血DNA样本进行检测，其检测结果如图2所示，其显示存在缺失片段，该缺失片段范围从图2中的探针4到探针8，且包含整个α 2基因。 根据MLPA结果，推定上游断裂点位于探针3和探针4之间的区域内，下游断裂点位于探针8和探针9之间的区域内。根据该推定，设计如下引物上游引物TCCTTCACTTGGTGTAATGGTTCG(SEQ ID NO:2)下游引物CCAGGGTTAGTCTGAGGGCTTCC(SEQ ID NO:3)根据该引物，进行跨越断裂点扩增，PCR扩增的产物片段约为2000bp。为了对检测反应体系进行评估，在该PCR体系中，引入了另外一对扩增人CLCN7基因的引物上游引物CTCTTGGGACTGAATGTGCTTGG(SEQ ID N0:4)下游引物GCAACAAACCCTAAAGAGCCTGG(SEQ ID NO:5)根据该引物，PCR扩增的CLCN7基因产物1346bp。该检测反应体系为包含4条引物的双重PCR，反应參数为98で变性1011^11;98で变性 lmin, 60°C煺火 45s, 72°C延伸 2min ；35 个循环后，72°C延伸 IOmin.PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，仅有只得到一条带I. 3kb条带时，结果为阴性；得到I. 3kb和2. Okb两条带时结果为阳性。扩增成功后，可对阳性产物直接测序。将测序结果与參考序列比对，以进ー步证实。该參考序列如SEQ ID NO: I所示。使用本发明的检测方法，对ー家庭进行检測。先证者为血红蛋白H病，父亲为典型的地中海贫血症状，母亲有轻微的地中海贫血症状(如表I所示)。使用本发明检测的结果如图3所示。表I血液学參数表
权利要求
1.一种缺失型α -地中海贫血基因，其序列如SEQ ID NO: I所示。
2.一种检测试剂盒，含有能够识别权利要求I所述基因的试剂。
3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列如SEQ ID NO: 2，所述下游引物序列如SEQ ID NO: 3所示，扩增人CLCN7基因作为对照上游引物序列如SEQ ID Ν0:4所示，下游引物序列如SEQ ID Ν0:5所示。
4.一种权利要求I所述基因的检测方法，包括如下步骤 a)提取待测人体外周血的基因组DNA； b)以所述基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到PCR产物； c)对所述PCR产物作琼脂糖凝胶电泳检测，只得到一条带I.3kb条带吋，结果为阴性；得到I. 3kb和2. Okb两条带时结果为阳性； d)对2.Okb长的产物进行直接基因测序，测序结果与參考序列比对，确定断裂位点； 其中，所述步骤b)中，PCR扩增用的引物序列为:上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。
全文摘要
本发明公开了一种缺失型α-地中海贫血基因、检测试剂盒及方法，其序列如SEQ ID NO:1所示。一种检测试剂盒，含有能够识别所述基因的试剂。所述试剂包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:2，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:3所示。本发明得到一种缺失型α-地中海贫血基因，便于地中海贫血筛选。
文档编号C12Q1/68GK102864153SQ20121027456
公开日2013年1月9日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者李泽松, 谢君, 愈晶 申请人:李泽松, 谢君, 愈晶