一种具有除草活性的植物提取物及其应用的制作方法

本发明属于生物农药技术领域，具体地，涉及一种具除草活性的植物秃杉，以及秃杉及其物提取物作为除草剂的应用。

背景技术：

农业领域除草剂的应用广泛，用于防治农田、果园、花卉苗圃、草原及非耕地、铁路线、河道、水库、仓库等地杂草、杂灌、杂树等有害植物。除草剂的过度使用对人体及其它生物、环境都产生了严重危害。

我国植物资源极为丰富，也是研究和应用植物源农药较早的国家。植物源农药具有不破坏生态环境、靶标有害生物不易产生抗药性、对非靶标生物安全、活性成分的作用方式特异等特点，在农业领域得到广泛应用。植物体内代谢产生的生物碱类、黄酮类、萜烯类、酚类、木脂素类等化学成分具有多种多样的农用生物活性，已有许多植物品种被开发成农药进行使用。由于植物源农药的上述特点，在国家提倡农药减量增效的政策下，该领域的研究倍受关注。在植物源除草剂的研究中，目前人们已发现了近100种具有杀草活性的化合物，少数活性成分已开发成为除草剂。

例如，ben报道香漆柏属中的tetraclinisarticulate(vahl.)masters叶精油对野芥(sinapisarvensisl.)和虉草(phalariscanariensisl.)的种子萌发和根茎增长均有抑制作用，对两种杂草的萌发和根茎增长的抑制随浓度的增加而明显，并指出香漆柏属的tetraclinisarticulate中所含的烯萜类化合物中有可能含有可做为新型除草剂的化合物来源。amri和hamrouni等人从不同地方采集的松科哈列棚松(pinushalepensismiller)，研究了其松针、茎精油化学成分和抑制3种麦田常见杂草的活性，并指出哈列棚松精油在生物源除草剂上有研究价值。

但是，不同的植物及其有效成分同样存在作用对象和除草效果的差异，因此，更多更好的植物来源除草剂的研发和探索，具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中除草剂的缺陷和不足，一种具有除草活性的植物及其应用，其提取物对多种杂草具有生物活性，能明显抑制各类杂草的萌发和生长，活性显著。

本发明的目的是提供秃杉及其提取物在除草方面的应用。

本发明的另一目的是提供一种具有除草活性的秃杉提取物或精油。

本发明的再一目的是提供一种新型除草剂。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明首次研究发现，秃杉及其提取物对多种杂草具有显著的抑制萌发、抑制生长的作用，因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内。

秃杉除草或制备除草剂方面的应用。

秃杉提取物在除草或制备除草剂方面的应用。

其中，所述草包括多种典型的农田杂草、入侵杂草和/或水生杂草。

优选地，所述草包括双子叶杂草、单子叶杂草和/或水生杂草。

更优选地，所述草为马唐、反枝苋、胜红蓟、青葙、三叶鬼针草、薇甘菊、大薸、浮萍和/或水绵等杂草。

更优选地，所述草为胜红蓟(双子叶杂草)、三叶鬼针草(双子叶杂草)、马唐(单子叶杂草)、大薸、浮萍和/或水绵(水生杂草)等。

另外，优选地，所述秃杉提取物为秃杉水提取物、秃杉有机溶剂(甲醇等)提取物或秃杉精油。秃杉精油为秃杉采用水蒸气蒸馏所得。

一种具有除草活性的秃杉提取物，是以秃杉为原料提取得到，提取溶剂为水或有机溶剂。

优选地，作为一种可选择的实施方案，所述秃杉提取物的提取方法为：将秃杉(茎皮、树枝和/或叶片)烘干、粉碎后，采用常规提取方法，用甲醇或乙醇等有机溶剂提取，或水提，浓缩后得到提取物。

一种具有除草活性的秃杉精油，是以秃杉为原料，采用水蒸馏(水蒸气蒸馏)得到。

上述制备得到的提取物或者精油中含有高活性的除草成分，可抑制马唐、反枝苋、胜红蓟、青葙、三叶鬼针草、薇甘菊、大薸、浮萍、水绵等单子叶杂草、双子叶杂草和水生杂草的萌发和生长，具有显著的具有除草活性，，可用作除草剂。

向上述提取物中加入乳化剂、溶剂、助剂等，可制成植物源除草剂，用于农田杂草的防除。

因此，一种包含有上述秃杉提取物和/或秃杉精油的除草剂，也应在本发明的保护范围之内。

该除草剂适用于多种典型的农田杂草、入侵杂草和/或水生杂草，包括双子叶杂草、单子叶杂草和/或水生杂草，如马唐、反枝苋、胜红蓟、青葙、三叶鬼针草、薇甘菊、大薸、浮萍和/或水绵等。

秃杉(taiwaniaflousianagaussen)属于杉科(taxodiaceae)台湾杉属(taiwaniahayata)，共有秃杉和台湾杉(taiwaniacryptomerioideshayata)2个种及金叶台湾杉(t.cryptomerioideshayatacv‘aureiflia’)1个变种。现有技术中已有研究发现，台湾杉提取物对白蚁、真菌、细菌及肿瘤细胞等均有很好的生物活性。chang等发现台湾杉心材精油具有抗细菌，抗白蚁和杀螨活性的化合物。ho等人还研究了台湾杉树枝精油的抗菌和抗木材腐朽活性，并发现其中的铁锈醇是主要活性成分。此外，在医学领域，研究还发现台湾杉精油对包括a-549肺癌，mcf-7乳腺癌和ht-29结肠腺癌在内的三种人类肿瘤细胞的生存力存在影响，其中taiwanina、taiwanine和甲基牛蒡子素对所有测试的肿瘤细胞表现出显着的细胞毒性。因此，秃杉在作为安全的植物源药剂方面具有很好的应用前景。

本发明人课题组通过多种植物的活性筛选，研究发现并公开了秃杉提取物对多种杂草(包括多种入侵杂草)均具有显著的除草效果。试验结果显示，秃杉甲醇提取物对三叶鬼针草、薇甘菊、青葙、胜紅蓟、马唐、拟南芥、浮萍、水绵以及大薸等杂草具有显著的除草活性。例如：25μg/ml粗提物处理三叶鬼针草7天后，三叶鬼针草生长极其缓慢，根不能长出，对根生长的抑制率近100％；25μg/ml粗提物处理马唐种子7天后，根不能长出，对根生长的抑制率近100％。由此提出，秃杉可开发成除草剂使用。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

马唐、反枝苋、胜红蓟、青葙、三叶鬼针草、薇甘菊、大薸、浮萍、水绵分别是典型的农田杂草、入侵杂草、水生杂草，秃杉的有机溶剂提取物或精油对这些杂草具有显著的生长抑制作用，抑制各类杂草的萌发和生长，抑制叶绿素a的合成，抑制效果显著。

根据秃杉的这种特点，可用于农田杂草的防除，可将其开发出高效、无污染的绿色除草剂，或者为新型除草剂的创制提供先导化合物，具有显著的社会效益和经济效益。

附图说明

图1为不同浓度秃杉甲醇提取物对马唐(单子叶杂草)生长抑制作用(7d)结果，图中从左至右、从上到下处理浓度依次为：0、12.5、25、50、100和200μg/ml。

图2为不同浓度秃杉提取物对三叶鬼针草(双子叶杂草)的生长抑制作用(7d)结果，图中从左至右、从上到下处理浓度依次为：0、12.5、25、50、100和200μg/ml。

图3为秃杉甲醇提取物对浮萍生长的抑制作用，从上往下依次是处理后24h、48h、72h的生长情况。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1制备秃杉有机溶剂提取物——甲醇提取物

秃杉茎皮经50℃烘干，粉碎过60目筛，然后将干粉置于容器中，加入3倍体积的甲醇(m/v)进行提取48-72h。重复提取3次，合并滤液，浓缩后得到秃杉甲醇提取物。

实施例2制备秃杉水蒸气蒸馏物——精油

秃杉茎皮粉碎后过筛，将500g干粉装入1000ml圆底烧瓶内，再加入800ml双蒸水，通过电炉加热进行水蒸气蒸馏，可得到秃杉精油。

实施例3秃杉对胜红蓟、三叶鬼针草、马唐的除草实验

1、实验方法

(1)实验植物：以胜红蓟(双子叶杂草)、三叶鬼针草(双子叶杂草)、马唐(单子叶杂草)为例进行研究。

(2)为明确秃杉的除草活性，采用“小杯法”测定了其对不同杂草的抑制效果。在一次性小塑料杯底放2-3层玻璃珠，加入一定浓度的秃杉甲醇提取物5ml，每个小杯中放入萌芽的种子10粒，保鲜膜封口，膜上留一些小孔透气。设置浓度梯度为：200、100、50、25、12.5和0μg/ml，每个浓度三次重复。处理后，将小杯放入光照培养箱中，温度26℃，光照4000lux，光周期16∶8。

(3)7d后，测量根长和鲜重，按照下式计算相对应的抑制率：

根长(鲜重)抑制率＝(对照根长(鲜重)-处理根长(鲜重))/对照根长(鲜重)

2、结果如表1、表2、表3所示。

表1秃杉甲醇提取物对胜红蓟的生长抑制作用(7d)

注：数据差异性采用dmrt法，显著水平α＝0.05；数值为平均值±标准误。

表2秃杉甲醇提取物对三叶鬼针草的生长抑制作用(7d)

注：数据差异性采用dmrt法，显著水平α＝0.05；数值为平均值±标准误。

表3秃杉甲醇提取物对马唐的生长抑制作用(7d)

注：数据差异性采用dmrt法，显著水平α＝0.05；数值为平均值±标准误。

从表1、表2、表3可以看出，秃杉对胜红蓟和三叶鬼针草表现出良好的抑制活性，25μg/ml处理后7d，对两种杂草的根长抑制率均达到80％以上，对单子叶马唐的根长抑制率达到90％以上。同时，对这三种杂草的鲜重抑制率分别为77.65％、59.53％和49.38％。说明秃杉可以显著地抑制杂草的生长。

另外，不同浓度秃杉甲醇提取物对马唐(单子叶杂草)生长抑制作用(7d)结果如图1所示，对三叶鬼针草(双子叶杂草)的生长抑制作用(7d)结果如图2所示。秃杉甲醇提取物对马唐和三叶鬼针草具有显著的抑制作用。

实施例4秃杉对大薸和浮萍的除草实验

1、将带有秃杉提取物的营养液(霍格兰液体培养液)倒入一次性的塑料小盆中，每个处理放2-3叶期的大薸或浮萍20株。保鲜膜封口，膜上留小孔，浓度梯度设置为200、100、50、25、12.5和0μg/ml，每个浓度三次重复。将小盆放入光照培养箱中，培养条件同上文。

培养一定时间后测定大薸的叶片死亡率、根长抑制率和鲜重抑制率，测定浮萍的叶绿素含量及其抑制率，叶绿素含量测定参考相关文献，采用常规方法进行。

2、结果如表4和表5所示。

表4秃杉甲醇提取物对大薸的生物活性(7d)

表4结果表明，秃杉处理大薸后，虽然大薸叶片死亡情况不明显，但其根的生长受到明显抑制，即使最低浓度12.5μg/ml处理后，7d的抑制率也超过了50％；同时，大薸的鲜重受到明显的抑制，200μg/ml处理引起的鲜重抑制率达到96％以上，说明其生长基本停止。因而，结果表明秃杉极显著地抑制了大薸的生长。

表5秃杉甲醇提取物对浮萍的生物活性(72h)

表5结果表明，处理后，浮萍植株中的叶绿素a的含量受到了明显的抑制，50μg/ml秃杉提取物处理后，叶绿素a的抑制率达到95％以上，从而间接导致其光合作用减少，生长变缓，表现出良好的除草活性。

另外，不同浓度秃杉甲醇提取物对浮萍生长的抑制作用如图3所示，处理后，浮萍植株中的叶绿素a的含量受到了明显的抑制，随着提取物浓度和处理时间的增加，浮萍的绿色越淡。

实施例5秃杉对水绵的除草实验

1、采用水培法，用u型六孔细胞培养板，每孔放入已吸干水分的水绵0.1g，然后每孔分别加入10ml对应浓度的培养液。培养液中加有秃杉提取物，浓度依次设置为12.5、25、50、100、200μg/ml，设空白对照。

水绵为丝状藻类，采取测定其叶绿素含量分析抑制活性。处理72h后测定其叶绿素含量及其抑制率，测定方法参照相关文献采用常规方法进行。

2、结果如表6所示。

表6秃杉甲醇提取物对水绵的生物活性(72h)

表6结果表明，秃杉提取物对水绵叶绿素a的合成具有明显的抑制作用，低浓度12.5μg/ml秃杉提取物处理后抑制率达到50％左右，100μg/ml浓度处理超过90％，说明水绵的光合作用受到显著影响。

实施例6秃杉精油除草实验

1、以水绵为例，采用水培法，用u型六孔细胞培养板测定了秃杉精油对水绵的抑制作用。每孔放入已吸干水分的水绵0.1g，每孔分别加入10ml对应浓度的培养液。精油用丙酮溶解。培养液设定的精油浓度依次为12.5、25、50、100、200μg/ml。处理后加盖密封置于培养箱内培养，培养条件为26℃，光照4000lux，光周期16∶8(光照∶黑暗)。对照药剂丁草胺的处理方法同上。

水绵为丝状藻类，采取测定其叶绿素含量分析抑制活性。培养24h，48h，72h后取出。每孔吸干水分后加入2ml丙酮，少许碳酸钙研磨，研磨液全部吸取到1.5ml离心管中，使用离心机在4000r/min的条件下离心10min，取全部上层清夜加丙酮稀释至4ml，再取2ml稀释液加入丙酮定容至10ml，以丙酮为标准测定663nm，645nm处的吸光度，重复3次。

2、结果如表7所示。

表7秃杉精油对水绵叶绿素的总量抑制率(％)

从表7可以看出，秃杉精油处理水绵后，200μg/ml处理24h后叶绿素的总量抑制率达到85％以上，对照药剂丁草胺的抑制率为95％以上；48h和72h的抑制率都达到90％以上。对于两种药剂处理来讲，抑制率和剂量之间均表现出明显的正相关。总体来看，秃杉精油对水绵叶绿素的总量具有明显的抑制作用，在相同浓度处理下，与水田广泛使用的除草剂丁草胺基本无显著差异，说明秃杉精油对水绵等水生杂草也具有良好的抑制作用。