利用反相高效液相色谱检测茶叶中游离氨基酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学领域，具体涉及一种同时检测茶叶中19种游离氨基酸含量 的高效液相色谱（HPLC)方法。
【背景技术】
[0002] 氨基酸是构成生物体蛋白的最基本物质，也是生物体内活性肽、酶和其他一些生 物活性分子的重要组成成分，与生命活动有着密切的关系。茶叶中含有丰富的氨基酸，因此 为人体所需提供了不可或缺的营养成分。茶叶中的氨基酸也是直接影响茶叶品质的特征性 成分之一，其含量和组成与茶叶的滋味和香气密切相关。因此，分析茶叶中氨基酸对茶叶的 品质鉴定和营养价值评价都具有十分重要的意义。
[0003] 目前，常用的茶叶氨基酸检测方法主要有电化学分析法、气相色谱法、离子交换色 谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳法。
[0004] 电化学分析法主要是用于测定游离氨基酸总量，此方法快速、简便，但精确度低， 重现性不好。离子交换色谱法方法是利用氨基酸在酸性条件下形成的阳离子在交换柱中 保留的时间不同而达到分离的，分离的氨基酸用茚三酮衍牛化为紫色产物，再经紫外可见 分光光度检测器进行检测。但该方法破坏了氨基酸的固有结构，分析时间很长，硬件配置复 杂，用途专一，灵活性差。毛细管电泳主要有两种模式：毛细管区域电泳（CZE)和胶柬电动 毛细管色谱（MEKC)，MEKC的分离度要好于CZE。此方法主要用于氨基酸的手性分离，具有 分离效率高、灵敏度高、无须梯度洗脱、分析速度快和溶剂消耗少等优点。但其重现性差因 此限制了其在氨基酸分析检测领域中的使用。质谱（GC-MS)分析方法是利用氨基酸分子中 的羧基在强碱环境中形成的阴离子在阴离子交换树脂上保留时间不同而达到分离的目的， 该方法灵敏，分辨率高、重复性好，主要用于疾病、植物等氨基酸定量分析及氨基酸对映异 构体鉴定中，但此方法对仪器以及实验人员水平要求较高，费用较高。
[0005] 高效液相色谱法是利用衍生化试剂将荧光基团加在氨基酸的氨基上，然后通过荧 光和紫外检测器进行检测。此方法较灵敏，分离条件较易改进，通用性强，分析速度较快。 1993年，Waters公司开发了反相高效液相色谱法方法-AccQ. Tag法。此法操作简单；灵 敏度极高，定量结果准确；精确度高，重复性好。能够较好地分离天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨 酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异 亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸17种氨基酸。2010年，李大祥建立了能够检测茶氨酸、 天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半 胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸18种氨基酸的反相高效液 相色谱法。但此方法不包含谷氨酰胺的检测。随着茶叶氨基酸代谢途径研究的深入，此途 径中的关键氨基酸-谷氨酰胺受到广泛的重视，探寻茶叶中谷氨酰胺的检测方法是目前迫 切需要解决的问题。因此本发明旨在建立测定范围更广的能够检测茶叶中谷氨酰胺、茶氨 酸、天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、 半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸19种游离氨基酸的方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种利用RP-HPLC检测茶叶中19种游离氨基酸的方法，对 19种游离氨基酸进行定性和定量分析，此方法样品前处理简单，成本低，实现了同时测定茶 叶中谷氨酰胺等19种游离氨基酸的目的。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 利用反相高效液相色谱检测茶叶中游离氨基酸的方法，其特点在于：包括以下步 骤：
[0009] (1)标准品：天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、苏 氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、茶 氨酸。
[0010] ⑵样品前处理
[0011] 称取I. 5g茶样浸泡于200ml屈臣氏水中，KKTC浸提45min，冷却至室温，抽滤后转 移至250ml容量瓶定容，静置取上清，0. 22um微孔滤膜过滤，所得滤液密封保存，用于下一 步衍生；
[0012] (3)标准品及样品的衍生
[0013] 衍生剂为6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC)，衍生时间为lOmin，衍 生温度为55°C。
[0014] (4) RP-HPLC 色谱条件
[0015] 检测仪器：Waters 600高效液相色谱系统，Waters 2478紫外检测器，Waters 2456荧光检测器；荧光检测：激发波长250nm，发射波长395nm ;UV检测波长：254nm ;
[0016] 色谱柱：AccQ-Tag C18氨基酸专用分析柱；
[0017] 流动相A :AccQ · Tag洗脱浓缩液A (商品名为AccQ · Tag洗脱浓缩液A，购自沃特 世公司）；流动相B为乙腈；流动相C为屈臣氏水（市购），柱温37°C ;洗脱程序：0-47min， AccQ · Tag 洗脱液 A : 100 % -68 %，乙腈：0 % -20 %，屈臣氏水：0 % -12 % ;47-50min， AccQ · Tag 洗脱液 A :68 % -O %，乙腈：20 % -60 %，屈臣氏水：12 % -40 % ;50-58min， AccQ · Tag 洗脱液 A :0% -100%,乙腈：60% -〇%,屈臣氏水：40% -〇% ;流速 lmL/min,进 样量5 μ L ;
[0018] (5)测定
[0019] 根据步骤（4)对衍生后的谷氨酰胺等19种游离氨基酸标准溶液和茶叶样品的游 离氨基酸进行色谱分析，经过紫外和荧光检测，获得氨基酸色谱图；根据色谱图结果计算茶 叶样品的谷氨酰胺等19种游离氨基酸的含量。
[0020] 作为优选，所述步骤（2)方案为：准确称取1.5g茶样于250ml试剂瓶中，加入 200ml煮沸的屈臣氏水，加盖密封，放入KKTC水浴中浸提45min，期间晃动摇匀2-3次； 抽滤后转移至250ml容量瓶中，用40°C -60°C屈臣氏水定容，静置5min后取上清，上清经 0. 22um水相滤头过滤，封口，用于下一步衍生。
[0021] 作为优选，所述步骤（3)具体方法为：
[0022] A、取3mg所述衍生剂溶解于ImL AccQ · Fluor稀释剂中得衍生剂液；
[0023] B、取20ul标准品溶液或样品滤液于衍生管中，然后加入70ulAccQ · Fluor Buffer,漩润 IOs ;
[0024] C、向步骤B衍生管中加入IOul步骤A所得衍生剂液，密封、漩涡10s，静置lmin， 然后立即置于55°C烘箱中加热lOmin。
[0025] 与已有技术相比，本发明有益效果体现在：
[0026] 由于AccQ-Tag C18氨基酸专用分析柱的柱效和氨基酸的极性，谷氨酰胺和组氨 酸在同一时间点出现色谱峰且完全重叠，即一个峰型图指示的是谷氨